張曉婕，邱樹毅，王曉丹，周鴻翔

(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025)

中國白酒以富含淀粉質(zhì)的糧谷為原料，以酒曲為糖化發(fā)酵劑，采用固態(tài)發(fā)酵，蒸餾、貯存和勾調(diào)而成，已有2 000 多年的歷史[1]，是中國食品工業(yè)的重要組成部分。白酒中的酒精與水約占總量的98%～99%，微量成分僅占1%～2%。但恰恰是微量成分決定了白酒的香氣、口感和風(fēng)格，其中一些則是形成白酒風(fēng)味的關(guān)鍵。隨著白酒釀造工藝的發(fā)展，白酒香型發(fā)生著悄然變化，原料、釀造工藝等的不同造成不同香型白酒中風(fēng)味物質(zhì)的差異[2]。因此，研究白酒中各種風(fēng)味物質(zhì)對于提高白酒風(fēng)味品質(zhì)具有重要意義。

目前，在白酒中已經(jīng)檢測出2 400多種風(fēng)味成分[3]，其中很大一部分由氣相分析方法檢出。白酒風(fēng)味物質(zhì)的研究主要是將感官分析與氣相分析技術(shù)結(jié)合，通過感官對白酒整體香氣輪廓和風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行評定和描述，通過氣相色譜儀對風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行提取分離、定性定量等，再結(jié)合各種數(shù)據(jù)分析方法，從而對白酒主要風(fēng)味物質(zhì)等進(jìn)行判定(如圖1)。除了對白酒主體風(fēng)味成分進(jìn)行研究，對白酒工藝及基酒質(zhì)量的鑒別也是白酒研究的熱點之一，但目前多是依靠感官進(jìn)行。因此，本文對白酒氣相分析及研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為白酒風(fēng)味分析及利用氣相鑒別白酒提供一定的思路與參考。

1 白酒風(fēng)味物質(zhì)的預(yù)處理

許多白酒風(fēng)味物質(zhì)的濃度遠(yuǎn)低于儀器或感官所能檢測到的檢測限，需提取濃縮后再分析。目前最常用的白酒風(fēng)味物質(zhì)預(yù)處理有：直接進(jìn)樣(direct injection，DI)、固相微萃取(solid phase micro extraction，SPME)、液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)和攪拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction，SBSE)等。還有一些其他的預(yù)處理方法，如超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，SFE)[1-2]、同時蒸餾萃取(simultaneous distillation extraction，SDE)[3]等。每種預(yù)處理方法各有特點(表1)，將不同方法有機(jī)結(jié)合可以改善分離提取效果。

表1 常見白酒風(fēng)味物質(zhì)預(yù)處理方法比較Table 1 Comparison of common pretreatment methods of flavor compounds in Baijiu

1.1 直接進(jìn)樣

DI法是指對酒樣不進(jìn)行或僅進(jìn)行簡單處理，經(jīng)過0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后直接進(jìn)入色譜柱分析。多用于白酒主要風(fēng)味成分的測定。SUN等[17]采用直接進(jìn)樣測定36種芝麻香型白酒中的揮發(fā)性化合物。但白酒中一些含量極低的的風(fēng)味物質(zhì)無法通過DI法檢出，因此，在白酒風(fēng)味物質(zhì)分析中，通常將DI法與其他預(yù)處理方法相結(jié)合。

1.2 固相微萃取

SPME采用“相似相溶”的原理，萃取頭表面涂有高分子固定相薄層，在待測物、固定相和水相之間建立萃取平衡以達(dá)到提取、富集、進(jìn)樣和解析待測組分的目的。白酒分析中最常用的萃取頭是碳分子篩/二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷 (divinybenzene/carboxen/ polydimethylsiloxane, DVB/CAR/PDMS)。

SPME常與頂空進(jìn)樣(headspace injection mode, HS)相結(jié)合以分析揮發(fā)性物質(zhì)[18]。然而，傳統(tǒng)SPME仍具有萃取量不足和吸附競爭等缺點[19]。為了提高響應(yīng)面積和萃取效率，產(chǎn)生了一種新SPME技術(shù)——箭型固相微萃取(SPME Arrow)，近年來逐漸應(yīng)用于各種揮發(fā)性物質(zhì)的檢測分析[19]。SPME Arrow的萃取相涂層較傳統(tǒng)SPME厚，吸附性能更好、能夠檢測更廣泛的化合物，測定快速高效、結(jié)果穩(wěn)定性高，可顯著提高方法靈敏度和樣品萃取效率[20]。SPME Arrow已逐漸應(yīng)用于水、魚露等香氣成分的分析[21-22]。ZHANG等[23]采用HS-SPME-Arrow提取和鑒定了白酒樣品中82種芳香化合物。與傳統(tǒng)SPME相比，SPME Arrow是一種更高效的香氣成分提取方法，這一方法的發(fā)展將有助于改進(jìn)白酒風(fēng)味物質(zhì)的分析。

1.3 液液萃取

LLE是利用溶劑分離提取液體混合物中組分的過程。常用萃取劑有乙醚、戊烷、二氯甲烷等[11]。LLE的關(guān)鍵是乙醇濃度對萃取物的影響，高度白酒必須稀釋至10%～14%后才能有效萃取[11]。LLE比SPME能提取更多的高級醇[24]。

萃取過程中會存在一定的損失，且萃取出的物質(zhì)選擇性較差，白酒風(fēng)味分析中，往往會根據(jù)風(fēng)味成分酸堿性分離濃縮酒樣[25](圖2)。王曉欣[11]利用LLE分別萃取濃香型和醬香型習(xí)酒中香氣化合物，并利用酸堿性的不同將其分為酸性/水溶性、中性和堿性3個組分，分析發(fā)現(xiàn)，2種香型習(xí)酒的酸性/水溶性組分中香氣化合物種類較簡單，主要是揮發(fā)性脂肪酸類化合物和醇類；堿性組分中主要為一些醇類和吡嗪類化合物；而在中性組分中檢測到的香氣化合物較多，包括酯類、醇類、呋喃類、酚類和芳香族化合物等。利用酸堿性將風(fēng)味成分分為不同組分，每個組分將會呈現(xiàn)不同的香氣，再結(jié)合儀器進(jìn)行分析，可以對白酒中的各種風(fēng)味物質(zhì)有更深入更全面的了解。

1.4 其他

SBSE與SPME類似，其通過攪拌棒上的聚合物涂層吸附樣品分子從而實現(xiàn)目標(biāo)物的萃取。除了傳統(tǒng)的SBSE外，順序SBSE技術(shù)通過增加一個攪拌子來提高化合物的萃取效率，有效地提取和富集不同極性的化合物[26]。

SFE是一種新型萃取分離技術(shù)，該方法利用超臨界流體，即處于溫度高于臨界溫度、壓力高于臨界壓力的熱力學(xué)狀態(tài)的流體作為萃取劑，以達(dá)到分離目的[27]。在提取白酒風(fēng)味物質(zhì)時多選用CO2作萃取劑，因此又常稱為超臨界二氧化碳萃取[27]。

2 白酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)氣相色譜分析技術(shù)

食品中風(fēng)味物質(zhì)多采用色譜法進(jìn)行分析，主要包括離子色譜法(ion chromatography，IC)、HPLC和GC(表2)。目前， GC是分析白酒揮發(fā)性組分最常用的方法，其分辨率高、靈敏度高、能識別大量化合物[28]。在白酒分析中，常將多種檢測技術(shù)相結(jié)合，以此得到最佳分析結(jié)果，對于確定白酒主要風(fēng)味物質(zhì)具有重要的意義。

表2 白酒風(fēng)味物質(zhì)色譜分析方法[29-30]Table 2 Chromatographic analysis methods of flavor compounds in Baijiu[29-30]

2.1 氣相色譜柱

色譜柱是氣相色譜儀的核心之一，使多組分樣品分離為單一組分，從而進(jìn)入檢測系統(tǒng)進(jìn)行分析，分離好壞直接關(guān)系到后續(xù)結(jié)果的準(zhǔn)確度。色譜柱分填充柱和毛細(xì)管柱2種?，F(xiàn)在使用的絕大多數(shù)都是毛細(xì)管色譜柱，其樣品用量小、分離效能與分析速度都遠(yuǎn)高于填充柱。毛細(xì)管色譜柱包括多孔層開口毛細(xì)管柱(porous layer open tubu,PLOT柱)和壁涂層開口毛細(xì)管柱(wall coated open tubular column，WCOT柱)，在白酒風(fēng)味分析中，最常見的是WCOT柱，這種色譜柱是在長長的石英毛細(xì)管的內(nèi)部加上一層薄薄的固定相液體涂層，在外部加上一層聚酰胺外套，用來增加毛細(xì)管的韌性和抗腐蝕能力。

在選擇毛細(xì)管柱時，最重要的是選擇合適的固定相，以獲得更好的分離效能。常見的固定相為聚硅氧烷和聚乙二醇。固定相的極性由取代基團(tuán)的極性及其相對含量決定的，對化合物的保留和分離具有一定影響。聚硅氧烷固定相多為非極性或低/中等極性，而聚乙二醇固定相極性則較強(qiáng)。應(yīng)根據(jù)待分析物質(zhì)的極性，按“相似相溶”的原則選擇固定相。白酒分析中，多選用具有極性的聚乙二醇為固定相的色譜柱[17]，也可同時選擇2種色譜柱從而更全面的檢測風(fēng)味物質(zhì)[1]。

內(nèi)徑對柱效、保留、壓力、載氣流速和柱容量都有影響。內(nèi)徑越小，柱效越高，分離效果越好。柱容量隨內(nèi)徑的增大而增加，但柱容量還取決于固定相、溶質(zhì)和液膜厚度。柱長影響柱效、保留和載氣壓力。柱長越長，分離效果越好，分析時間越長，因此在保證柱效的前提下，應(yīng)盡量選擇短柱以保證工作效率。液膜厚度影響柱容量、分離度、保留時間等參數(shù)。膜厚越厚，柱容量越大，保留時間也越長，所得色譜圖的峰越寬。白酒分析中，最常用的色譜柱內(nèi)徑為0.25 mm或0.32 mm，柱長為30 m或60 m，膜厚為0.25 μm[31]。

表3 白酒分析中常用色譜柱Table 3 Chromatographic columns commonly used in liquor analysis

2.2 氣相色譜法

各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在色譜柱中得到分離后進(jìn)入檢測器進(jìn)行分析，主要包括GC-O、GC-MS、氣相色譜-氫火焰離子化檢測器(GC ionization detector，GC-FID)、全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS)[35]等。

2.2.1 一維氣相色譜技術(shù)

現(xiàn)階段，GC-O-MS是食品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)最常用的分析技術(shù)，其將人類嗅覺的敏感性和選擇性、氣相色譜極強(qiáng)的分離能力及質(zhì)譜對未知化合物的鑒定能力相結(jié)合，從而對風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性定量。經(jīng)色譜柱分離的組分按一定分流比分別進(jìn)入檢測器和嗅探口，以同時獲得樣品的化學(xué)組成和氣味特征信息[37]。常用的GC-O檢測方法有香氣提取物稀釋分析[37]、時間-強(qiáng)度法[38]及檢測頻率法。前2種方法在白酒風(fēng)味物質(zhì)檢測中較常用。通過對比譜庫信息、標(biāo)準(zhǔn)品譜圖、香氣特征等對風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性[11]，還可根據(jù)保留指數(shù)(retention index，RI)進(jìn)行定性[4]。RI表示物質(zhì)在固定相中的保留行為，僅與固定相性質(zhì)和柱溫有關(guān)，準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性很好，其計算公式如下：

(1)

目前，LLE/HS-SPME-GC-MS技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種食品中香氣成分的定性定量研究[39]。然而，白酒中一些香氣成分濃度較高，GC-MS檢測會出現(xiàn)過載現(xiàn)象，影響定量結(jié)果[11]。因此，這部分物質(zhì)往往采用GC-FID進(jìn)行定量分析。

近年來，穩(wěn)定同位素稀釋技術(shù)發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域。如白酒及葡萄酒中氨基甲酸乙酯的檢測[40-41]、利用食用酒精勾兌糧食酒的鑒別[42]等。同位素標(biāo)記物與待測物具有非常相似的性質(zhì)，因此加入目標(biāo)組分的同位素作為內(nèi)標(biāo)能減少干擾，消除基質(zhì)效應(yīng)，降低質(zhì)譜儀器波動的影響[43]。隨著穩(wěn)定同位素稀釋技術(shù)的不斷完善，可以將其與色譜及質(zhì)譜氣相技術(shù)結(jié)合，以實現(xiàn)白酒中某一關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)或痕量物質(zhì)的專一檢測，為白酒風(fēng)味、工藝、安全等方面的研究提供有效手段。

除了GC-FID和GC-MS等常規(guī)的檢測技術(shù)外，近幾年還發(fā)展了一種直接檢測樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的新技術(shù)——?dú)庀?離子遷移譜聯(lián)用技術(shù)(GC-ion mobility spectrometry, GC-IMS)。IMS在電場下對樣品分子電離，根據(jù)離子遷移率的差異進(jìn)行分離檢測，無需真空條件，且檢測限低，能夠快速準(zhǔn)確地檢測食品在不同條件下的變化[44]。朱玲等[45]采用GC-IMS技術(shù)建立白酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析方法，快速直觀區(qū)分白酒香型。將GC-IMS作為GC-MS的一種輔助分析工具，常壓檢測，有望建立一種快速鑒別白酒風(fēng)味分析及香型的新技術(shù)。

對一些濃度痕量但可能具有強(qiáng)烈香氣活性的“未知”風(fēng)味物質(zhì)的分析是近年來食品風(fēng)味行業(yè)亟待解決的難題[46]。馮云子等[46]發(fā)現(xiàn)氣相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法(GC-orbitrap-mass spectrometry，GC-Orbitrap-MS)能夠有效輔助GC-O-MS鑒定醬油中未知的氣味活性化合物。目前醬香型白酒的關(guān)鍵風(fēng)味成分至今未確定，也可能是由于其某些關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)為痕量濃度，未能檢出?？梢詫C-Orbitrap-MS應(yīng)用于白酒風(fēng)味分析中，輔助GC-O-MS鑒定白酒中未知風(fēng)味物質(zhì)，以推動白酒關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的研究。

2.2.2 全二維氣相色譜技術(shù)

由于揮發(fā)性成分的復(fù)雜性，普通一維GC由于峰容量的限制常出現(xiàn)大量色譜法重疊，影響結(jié)果準(zhǔn)確性[47]。除了對樣品進(jìn)行預(yù)處理外，還可利用全二維氣相色譜(comprehensive two-dimensional gas chromatography, GC×GC)分析。GC×GC最初用于解析高度復(fù)雜的石油樣品[48]，是利用兩根性質(zhì)不同的色譜柱，使第一維沒有完全分開的組分在第二維進(jìn)一步分離，以達(dá)到正交分離的效果，從而極大提高了峰容量、分辨率和靈敏度，其最大的優(yōu)勢為將類似的或同族的化合物歸在一起，更有利于分析。

目前在白酒分析中最常用的GC×GC技術(shù)是GC×GC-TOFMS[35]，可以在進(jìn)樣量很少的情況下實現(xiàn)多種風(fēng)味物質(zhì)的快速分離和檢測[49]。揮發(fā)性硫化物(volatile sulfur compounds，VSCs)是一類重要的芳香物質(zhì)，閾值極低，對食品香氣特征具有顯著影響[50]。VSCs在白酒中的濃度大多低于常用白酒色譜分析技術(shù)的檢出限，因此很難被識別[3]。SONG等[51]利用HS-SPME-GC×GC-SCD分析老白干中的VSCs，并比較了GC×GC-SCD與GC-FID、GC-MS、GC-FPD和GC-SCD的靈敏度，結(jié)果表明，GC×GC-SCD的檢出限和定量限分別為0.04～0.21和0.041～0.33 μg/L，比GC-FPD、GC-FID、GC-MS和GC-SCD的靈敏度高得多(分別至少是625、2 250、2 350和11倍)。GC×GC-SCD。GC×GC-SCD具有選擇性高、分辨率高、靈敏度高、樣品處理量大等優(yōu)點，可與其他色譜技術(shù)共同應(yīng)用于白酒風(fēng)味物質(zhì)分析，彌補(bǔ)過去無法準(zhǔn)確檢測白酒中VSCs含量的不足，完善白酒風(fēng)味物質(zhì)研究。

3 白酒重要風(fēng)味物質(zhì)和關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)確定

不是所有物質(zhì)都對白酒香氣有影響，各風(fēng)味物質(zhì)對白酒香氣的貢獻(xiàn)不僅取決于含量，還與其閾值有關(guān)。通過比較各物質(zhì)對白酒香氣的貢獻(xiàn)度，可以確定白酒中的重要貢獻(xiàn)風(fēng)味物質(zhì)和關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。

3.1 重要貢獻(xiàn)風(fēng)味物質(zhì)判定

為進(jìn)一步判定各風(fēng)味物質(zhì)對白酒整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)，通常會根據(jù)各風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量濃度c(μg/L)與其氣味閾值(OT，μg/L)以獲得香氣活性值(odor active values, OAV)，即OAV=c/OT。當(dāng)OAV≥1時，表示該物質(zhì)對白酒整體風(fēng)味具有明顯貢獻(xiàn)，且OAV值越高，貢獻(xiàn)越大。FAN等[37]將在豉香型白酒中共檢測出有34種風(fēng)味物質(zhì)的OAV≥1，其中OAV最高的是2-甲基丙酸乙酯(OAV=336)，其次是辛酸乙酯(OAV=157)和己醛(OAV=69)，說明這些物質(zhì)對豉香型白酒的總體風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)。

3.2 關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)確定

初步判定出重要貢獻(xiàn)風(fēng)味物質(zhì)后，還需要對其進(jìn)一步驗證，以確定關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)[4]。主要包括香氣重構(gòu)、缺失/添加試驗。通過重組酒樣重要貢獻(xiàn)香氣物質(zhì)后與原酒樣對比，相似度越大說明重要香氣化合物的分析結(jié)果越準(zhǔn)確。若香氣重構(gòu)試驗成功，可進(jìn)一步進(jìn)行香氣缺失試驗，以判斷某一化合物是否為酒樣的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。FAN等[37]將34種OAV≥1的香氣物質(zhì)按測定的濃度混合，成功重構(gòu)了豉香型白酒的香氣，并通過缺失試驗發(fā)現(xiàn)不含(E)-2-壬烯醛以及2-苯乙醇的模型與完全重組相比，在香氣方面具有非常高的顯著性(α≤ 0.001)，從而明確了(E)-2-壬烯醛和2-苯乙醇對豉香型白酒典型香氣的關(guān)鍵作用，又用庚二酸二乙酯、辛二酸二乙酯和壬二酸二乙酯對完全重組物進(jìn)行加標(biāo)，發(fā)現(xiàn)3種二元酸二乙酯的添加對豉香型白酒香氣無貢獻(xiàn)。

目前，已經(jīng)確定了濃香型和清香型白酒的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)分別是己酸乙酯和乙酸乙酯[3]，但醬香型白酒的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)仍未確定，這可能是由于決定“醬香”的不是某一種單一的物質(zhì)，而是多種風(fēng)味物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

4 展望

白酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究已取得了一定進(jìn)展，常用的預(yù)處理和分析技術(shù)相對成熟，但隨著對不同種類白酒的研究以及研究思想和技術(shù)手段的不斷進(jìn)步，將會有更多成分被挖掘，仍有許多方面需要進(jìn)行深入的探究和剖析：

(1)風(fēng)味物質(zhì)的提取濃縮是風(fēng)味研究中重要的一環(huán)，但截止目前，還沒有一種預(yù)處理方法能夠一次性且完全地對所有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行富集濃縮。將近幾年發(fā)展的一些新的預(yù)處理技術(shù)與傳統(tǒng)預(yù)處理技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于白酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析中，能夠更全面地解析白酒復(fù)雜基質(zhì)中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，同時通過深入探究這些新技術(shù)的特點，對現(xiàn)有白酒預(yù)處理技術(shù)進(jìn)行改善。

(2)除了采用適宜的預(yù)處理外，還應(yīng)根據(jù)酒樣的不同以及目標(biāo)物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的差異，針對性地選擇檢測器或檢測方法，以實現(xiàn)對目標(biāo)物更精準(zhǔn)的定性定量。可以將近年來發(fā)展的分離檢測新技術(shù)與GC-MS相融合或?qū)⑵渌l(fā)酵食品(如調(diào)味品)中揮發(fā)性物質(zhì)分析技術(shù)應(yīng)用于白酒分析中，輔助GC-O-MS鑒定白酒中未知的風(fēng)味物質(zhì)。這對白酒風(fēng)味物質(zhì)的研究具有重要的推動作用，為構(gòu)建白酒全面的香氣模型、指紋圖譜提供依據(jù)。

(3)目前，白酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測分析主要基于氣相色譜。但色譜質(zhì)譜法作為食品揮發(fā)性組分檢測的傳統(tǒng)方法，其儀器系統(tǒng)復(fù)雜，不能實時快速分析揮發(fā)性組分，只能在實驗室使用。針對這些問題，可以考慮將其他檢測方法(如紅外與激光光譜法)應(yīng)用于白酒揮發(fā)性組分分析中，以實現(xiàn)白酒揮發(fā)性組分的實時檢測。

此外，還應(yīng)加強(qiáng)對白酒風(fēng)味成分間的相互作用關(guān)系研究，更全面系統(tǒng)地對白酒進(jìn)行剖析，解決白酒風(fēng)味的相關(guān)難題。白酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究應(yīng)朝著便捷、高效、多種分析技術(shù)相結(jié)合、實時檢測與詳細(xì)分析共存的趨勢不斷發(fā)展。