紀欣，劉文俊,2，郭艷榮,2，孫天松,2*

1(乳品生物技術與工程教育部重點實驗室(內蒙古農業(yè)大學)，內蒙古 呼和浩特，010018)2(農業(yè)農村部奶制品加工重點實驗室(內蒙古農業(yè)大學)，內蒙古 呼和浩特，010018)

新疆地區(qū)地貌獨特，在三山和兩盆地的周圍有著遼闊的天然草原，得天獨厚的地理條件推動了其畜牧業(yè)的發(fā)展，是蒙古族、哈薩克族、維吾爾族等游牧民族的聚集地。由于長期的牧區(qū)生活，牧民們對加工發(fā)酵牦牛乳、曲拉、奶酪、發(fā)酵牛乳和馬奶酒等自然發(fā)酵乳制品積累了豐富的經驗，其中，牧民手工制作的酸牛乳是在開放環(huán)境中經過自然發(fā)酵而成，酸甜可口，營養(yǎng)豐富，具有調理胃腸道、改善乳糖不耐癥、降低膽固醇等益生作用，深受當地牧民的喜愛，其中優(yōu)良的發(fā)酵菌種經過數年代代相傳而來。

近年來，諸多關于自然發(fā)酵乳制品中微生物多樣性的研究表明，自然發(fā)酵酸牛乳中微生物豐富多樣，其中門水平上，主要包含F(xiàn)irmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria等[1-3]，種水平上，主要有Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus、Lactobacillusdelbrueckii、Lactobacillusfermentum、Lactobacillushelveticus、Streptococcusthermophilus、Lactococcuslactissubsp.lactis、Lactobacilluscasei等乳酸菌[4-8]，并且不同種類、不同地區(qū)自然發(fā)酵乳制品中乳酸菌組成具有顯著的地域差異和家庭特異性。

然而，自然發(fā)酵乳制品質量較不穩(wěn)定，安全性難以保證，當前將其制作工藝統(tǒng)一化、標準化來實現(xiàn)工業(yè)化生產以提升其品質和生產規(guī)模十分重要，但如果將自然發(fā)酵乳制品脫離原始發(fā)酵環(huán)境進行工業(yè)化生產，能否保留自然發(fā)酵乳制品特有的微生物組成和品質，還需要足夠的科研數據支持，相關研究還鮮有報道。

因此，本研究在實驗室模擬自然發(fā)酵乳中的混合微生物連續(xù)發(fā)酵過程，通過純培養(yǎng)方法結合PacBio SMRT測序技術探究新疆自然發(fā)酵酸牛乳在連續(xù)發(fā)酵過程中乳酸菌菌群結構動態(tài)變化，為自然發(fā)酵酸牛乳工業(yè)化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究用的自然發(fā)酵酸牛乳樣品由內蒙古農業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供，采集信息如表1所示。MRS液體培養(yǎng)基(CM1175)、MRS固體培養(yǎng)基(CM1163)，英格蘭OXOID公司；細菌基因組 DNA 提取試劑盒，北京天根生物技術有限公司；OMEGA EZNA?Soil微生物宏基因組DNA提取試劑盒，美國OMEGA公司；KAPA HiFi HotStart ReadyMIX PCR Kit，美國KAPA生物系統(tǒng)公司；SMRT建庫試劑盒(DNA Template Prep Kit 1.0)、測序試劑(DNA/Polymerase Bingding Kit P6 v2和DNA Sequencing Bundle 4.0)，美國太平洋生物科學公司。

表1 新疆自然發(fā)酵酸牛乳樣品采集信息表Table 1 Information of traditional fermented milk samples in Xinjiang

1.2 儀器與設備

SMRT RSⅡ測序平臺，美國Pacific Biosciences公司；Applied Biosystems PCR儀，伯樂公司；DYY-12型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；UVPGDS-8000型凝膠成像分析系統(tǒng)，UVP 公司；ND-1000型微量紫外分光光度計，Nanodrop公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 自然發(fā)酵酸牛乳的實驗室連續(xù)發(fā)酵

吸取5 mL自然發(fā)酵酸牛乳樣品至100 mL 110 g/L的滅菌脫脂乳中，充分混勻，置于25 ℃發(fā)酵72 h。將發(fā)酵結束的發(fā)酵乳作為下一次發(fā)酵的引子，重復上述發(fā)酵過程，連續(xù)發(fā)酵持續(xù)9個月。每次發(fā)酵結束進行pH值的測定，對第0、3、6、9月發(fā)酵乳樣品進行乳酸菌計數，乳酸菌分離及16S rRNA基因序列鑒定，乳酸菌宏基因組PCR測序。

1.3.2 乳酸菌計數

采用傾注平板法[9]對所有樣品中乳酸菌進行活菌計數。

1.3.3 樣品中乳酸菌的分離及16S rRNA基因序列鑒定

乳酸菌的分離采用MRS培養(yǎng)基及平板涂布法[10]，菌株純化采用平板劃線法，將革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性，無芽孢菌株初步斷定為疑似乳酸菌進行保藏。

用MRS培養(yǎng)基活化1.3.3保藏的菌株，連續(xù)培養(yǎng)2代后，離心收集菌體。采用TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒對分離株基因組DNA進行提取，并檢測DNA質量是否合格[11]。將DNA基因進行PCR擴增[9,12-13]，將PCR產物送至上海桑尼生物科技有限公司進行16S rRNA基因序列測定，在GenBank數據庫對分離株16S rRNA基因序列進行同源性比對，鑒定其菌種[14]。

1.3.4 樣品中乳酸菌宏基因組PCR測序

采用OMEGA EZNA?Soil試劑盒提取樣品中宏基因組，之后使用微量紫外分光光度計檢驗其純度及濃度，使用乳酸菌特異性引物對乳酸菌DNA進行PCR擴增[15]。PCR產物經AMPure beads純化后，用Pacific Biosciences Template Prep Kit 2.0構建文庫[16]，加入測序引物、聚合酶后，使用SMRT RSⅡ儀器進行測序[12]。

1.3.5 生物學信息分析

使用RS_ReadsOfinsert.1對原始序列進行處理，使用QIIME[17]平臺對原始序列進行過濾，保留高質量序列[18]。采用PyNAST將序列校準排齊后，使用UCLUST algorithm在> 97%的相似性條件下劃分操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)[19]。去除屬于嵌合體 OTU 后，使用 RDP(ribosomal database project，Release11.5)、Sliva(v128)及Greengenes(v13.8)數據庫確定各 OTU 的分類學地位，進而計算各樣品乳酸菌在門、綱、目、科、屬和種水平的相對含量。計算各組樣本香農指數(Shannon-wiener index)、辛普森指數(Simpson index)、Chao1指數和發(fā)現(xiàn)的物種數量指數(Observed species)，用于評估α多樣性?；赨nifrac距離對樣品之間進行加權(weighted)和非加權(unweighted)的主坐標分析(principal coordinate analysis，PCoA)[20]。

1.3.6 數據處理

由QIIME分析的乳酸菌α多樣性結果及樣品之間Unifrac距離結果使用ImageGP(www.ehbio.com/ImageGP)進行可視化處理，其余圖由Origin 8.6完成，使用軟件IBM SPSS Statistics 22.0進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 自然發(fā)酵酸牛乳連續(xù)發(fā)酵過程中pH值及乳酸菌活菌數的變化

3份酸牛乳樣品在連續(xù)發(fā)酵過程中pH值變化如圖1所示。酸牛乳樣品在連續(xù)發(fā)酵期間pH值呈現(xiàn)下降趨勢(圖1-a～圖1-c)，由圖1-d可知，在連續(xù)發(fā)酵期間，酸牛乳樣品中乳酸菌活菌數變化總體呈下降趨勢，這是因為部分不耐酸乳酸菌生長受到了抑制[21]。其活菌數雖有所下降，但仍保持在7.0 lgCFU/mL以上。

2.2 基于純培養(yǎng)方法分析自然發(fā)酵酸牛乳連續(xù)發(fā)酵期間乳酸菌菌群結構

a-WQ8；b-TK7；c-YC8；d-乳酸菌活菌數圖1 連續(xù)發(fā)酵期間酸牛乳pH值及乳酸菌活菌數的變化Fig.1 The variation of pH and lactic acid bacteria viable count of fermented milk during successive fermentation

如表2及圖2所示，通過純培養(yǎng)方法從12份酸牛乳樣品中共分離到9個乳酸菌菌種，其中，L.helveticus、L.delbrueckii、L.delbrueckiisubsp.bulgaricus是0月(原始)酸牛乳樣品中優(yōu)勢菌種。然而隨著連續(xù)發(fā)酵，L.delbrueckii、L.delbrueckiisubsp.bulgaricus再未分離到，由此看來L.delbrueckii、L.delbrueckiisubsp.bulgaricus生長受到抑制。連續(xù)發(fā)酵9個月后，樣品WQ8、TK7、YC8中優(yōu)勢菌分別為L.helveticus、L.casei、L.fermentum，從YC8中還分離到了Enterococcusdurans與Enterococcusfaecium，很顯然，酸牛乳樣品中乳酸菌組成發(fā)生改變，其中L.helveticus、Enterococcus在對酸性條件的耐受性方面具有一定的優(yōu)勢[22]。

表2 連續(xù)發(fā)酵時期酸牛乳樣品中乳酸菌分離鑒定結果Table 2 Isolation and identification of lactic acid bacteria from fermented milk samples during successive fermentation stages

圖2 酸牛乳樣品連續(xù)發(fā)酵過程中乳酸菌種群結構變化Fig.2 The variation of lactic acid bacteria population structure of fermented milk samples during successive fermentation

2.3 基于PacBio SMRT測序技術分析自然發(fā)酵酸牛乳連續(xù)發(fā)酵期間乳酸菌菌群結構

12份酸牛乳樣品共產生30 209條高質量完整的16S rRNA基因序列，其中，剔除掉非乳酸菌及未能鑒定到屬的序列后，最終獲得30 141條乳酸菌序列，每份樣品平均序列數量為(2 512±824)條。根據 97%相似度劃分 OTU 后，共得到519個具有代表性的OTU，具體信息見表3。由稀疏曲線圖(圖3-a)可知，在當前測序量，每個樣品的稀疏曲線上升趨勢較弱，說明隨著測序量的增加，只會發(fā)現(xiàn)少量新的OTU。香農指數曲線(圖3-b)已經達到水平狀態(tài)，這表明，隨著測序量加深，微生物的多樣性不再變化了，說明當前的測序量滿足后續(xù)分析的需要。

表3 樣品序列豐度及乳酸菌多樣性信息Table 3 Sequence abundance and lactic acid bacteria diversity of samples

本研究采用單因素方差分析分析了不同連續(xù)發(fā)酵時間的酸牛乳樣品間α多樣性差異性，顯著性水平P為0.05。由圖4可知，6月酸牛乳樣品Chao1指數顯著高于0月(P=0.036<0.05)，而不同連續(xù)發(fā)酵

時間的酸牛乳樣品發(fā)現(xiàn)物種數、香農指數及辛普森指數之間不存在顯著差異(P>0.05)，則表明不同樣品乳酸菌多樣性和豐富度差異不顯著。

a-稀疏曲線；b-香農曲線圖3 稀疏曲線圖和香農曲線圖Fig.3 Rarefaction curves and Shannon diversity index curves

a-Chao1指數；b-發(fā)現(xiàn)物種數；c-香農指數；d-辛普森指數圖4 不同連續(xù)發(fā)酵時期酸牛乳菌群α多樣性差異性Fig.4 The differences in α diversity of fermented milk microbiota at different continuous fermentation times注：**表示不同連續(xù)發(fā)酵時期酸牛乳菌群α多樣性差異顯著(P<0.05)

在12份酸牛乳樣品中只檢測到了厚壁菌門。由圖5可知，在屬水平上，共鑒定出7個菌屬，包括Lactobacillus(80%)，Streptococcus(8%)，Enterococcus(8%)，Leuconostoc(4%)，還有極少量的Staphylococcus，Streptococcus和Bacillus，酸牛乳樣品中主要是Lactobacillus。

在種水平上，本研究共發(fā)現(xiàn)25個乳酸菌菌種，主要包括L.helveticus(49.09%)、L.delbrueckii(11.03%)、L.fermentum(10.07%)、S.thermophilus(7.46%)、Lactobacillusgallinarum(5.68%)等(圖6)。由此可見，與依賴培養(yǎng)方法得出的結果相比，三代測序技術測得的乳酸菌菌群的多樣性更高，更全面。此外，L.delbrueckii(38.25%)、S.thermophilus(29.80%)、L.helveticus(27.81%)為0月(原始)酸牛乳樣品中優(yōu)勢菌，采用純培養(yǎng)方法除了未分離到S.thermophilus以外，得到的結果與其基本一致。

圖5 酸牛乳樣品中乳酸菌菌群相對含量的分析(基于屬水平)Fig.5 Relative abundance of the lactic acid bacteria genera in fermented milk samples (Genera level)

隨著連續(xù)發(fā)酵，原有優(yōu)勢菌種L.delbrueckii生長受到抑制而逐漸減少，甚至消失，采用純培養(yǎng)方法也得到類似結果。此外，S.thermophilus、Lactobacillusleichmannii、Lactobacillusreuteri、Lactobacillusruminis、L.lactis等減少或消失，而L.helveticus、L.fermentum、L.gallinarum、E.durans等含量增加，表現(xiàn)出較強的適應性與競爭能力。

圖6 酸牛乳樣品連續(xù)發(fā)酵過程中乳酸菌菌群動態(tài)變化Fig.6 Dynamic change of lactic acid bacteria in fermented milk samples during successive fermentation

本研究基于Unifrac的加權和非加權主坐標分析，對不同連續(xù)發(fā)酵時間的酸牛乳樣品中乳酸菌菌群結構進行分析，結果如圖7所示。PCoA加權和非加權分析均未能將不同連續(xù)發(fā)酵時間酸牛乳樣品明顯區(qū)分開，這可能是因為酸牛乳樣品數量太少，只有3份，導致差異不明顯[16]。經PCoA加權分析發(fā)現(xiàn)，0月(原始)樣品與3、6、9月樣品之間的距離較3、6、9月樣品之間的距離更遠，這表明連續(xù)發(fā)酵前后酸牛乳之間存在差異。

a-加權；b-非加權圖7 基于Unifrac加權和非加權的不同發(fā)酵時期酸牛乳乳酸菌群落結構主坐標分析Fig.7 Principal coordinate analysis based on the weighted and unweighted Unifrac distances of lactic acid bacteria communities of samples from different passage periods

3 討論

本研究盡量模擬牧民自制自然發(fā)酵酸牛乳工藝，酸牛乳的連續(xù)發(fā)酵以72 h為1個發(fā)酵周期。就整個連續(xù)發(fā)酵過程來說，酸牛乳樣品幾乎均以Lactobacillus為主，Lactobacillus是發(fā)酵乳制品中的核心菌屬[8,11,15-16,23]，并且Lactobacillus的耐酸性比Streptococcus、Lactococcus高[11]，這與其他同類研究的結果一致。在連續(xù)發(fā)酵期間，隨著pH不斷下降，一些不適應酸性環(huán)境的乳酸菌如S.thermophilus、L.lactis、S.salivarius等，不能維持細胞內pH接近中性，便喪失活性甚至死亡[24-25]，從而酸牛乳中乳酸菌活菌數降低[21]，而L.delbrueckiisubsp.bulgaricus依賴脫羧酶機制消耗質子，通過F1F0-ATPase質子泵排出質子來維持細胞內pH平衡，具有較強的耐酸性[26-27]，但在連續(xù)發(fā)酵期間消失，可能是因為其他微生物對其存在拮抗作用。酸牛乳樣品中微生物較為復雜，除了產酸較強的乳酸菌如L.helveticus、L.fermentum、E.durans等依然保留之外[28-29]，還可能有一些酵母菌和其他細菌(醋酸菌)的存在，均具有產酸作用[30-31]，因此，菌群產酸能力并沒有因乳酸菌活菌數降低而減弱。另外，菌群產酸能力動態(tài)變化是因為每一次發(fā)酵接種的微生物數量，菌種類型及比例不同，從而導致酸牛乳中菌群產酸能力不同[32]。此外，發(fā)酵制品中微生物演替主要受發(fā)酵原料、時間、溫度、地理環(huán)境等因素的影響[33]，本研究的發(fā)酵環(huán)境為無菌且封閉，與自然發(fā)酵環(huán)境不同，缺乏外界自然環(huán)境中微生物對發(fā)酵體系的補充，這也是自然發(fā)酵酸牛乳中特有發(fā)酵菌種未能保留的原因之一。值得一提的是，在這樣競爭激烈、條件惡劣(低pH)的環(huán)境下，L.helveticus含量增加，仍然保持優(yōu)勢，可見其具有不同于其他乳酸菌的特性，L.helveticus在對溫度和pH值的耐受性方面具有一定的優(yōu)勢[22]，且蛋白水解能力強大[34]，對各類發(fā)酵乳制品的制作十分重要。因此，后續(xù)有望從中篩選到特性優(yōu)良的菌株，從而為發(fā)酵乳制品生產提供優(yōu)良乳酸菌資源。

本研究發(fā)現(xiàn)新疆自然發(fā)酵酸牛乳中優(yōu)勢菌屬為Lactobacillus，其中L.delbrueckii、L.delbrueckiisubsp.bulgaricus、S.thermophilus、L.helveticus為優(yōu)勢菌種，與其他研究結果類似[3,11]。采用純培養(yǎng)方法未分離到S.thermophilus、L.lactis、L.gallinarum、L.mesenteroides等乳酸菌，不能全面分析樣品中微生物組成，而PacBio SMRT測序技術正好彌補了這一不足，今后應當采取多種培養(yǎng)基組合使用的方式來盡可能全面地挖掘樣品中微生物。

4 結論

新疆自然發(fā)酵酸牛乳在實驗室連續(xù)發(fā)酵9個月期間，乳酸菌菌群結構沒有穩(wěn)定傳遞，說明自然發(fā)酵酸牛乳脫離自然發(fā)酵環(huán)境不利于其中乳酸菌菌群的保持。這也提示我們將自然發(fā)酵酸牛乳中混合菌種直接用于酸牛乳工業(yè)化生產尚需更多的研究支撐，從自然發(fā)酵乳中篩選發(fā)酵特性優(yōu)良的乳酸菌菌種，確定最佳發(fā)酵菌種組合，對自然發(fā)酵酸牛乳的工業(yè)化生產具有重要意義。