翁方中，胡朝梁，嚴(yán) 駿，戴 偉，周瑞祥

(湖北省武漢市第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢 430022)

房顫是最常見的心律失常，一般人群房顫患病率可達(dá)0.4%～1.0%，且隨著年齡增長房顫患病率明顯增加，據(jù)報道年齡≥85歲以上人群房顫患病率可達(dá)17.4%。心肌纖維化則是心律失常的主要病理表現(xiàn)之一，且難以逆轉(zhuǎn)[1]。當(dāng)前臨床依據(jù)心肌纖維化的病理特征將其劃分為反應(yīng)性纖維化、或是修復(fù)性纖維化兩種，兩種心肌纖維化雖具不同的病理表現(xiàn)，但均可誘導(dǎo)心肌損傷，引起心臟重構(gòu)、心功能不全或心肌壞死。研究證實內(nèi)源性腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosteron system,RAAS)、內(nèi)皮素(endothelin，ET)-一氧化氮(nitric oxide,NO)系統(tǒng)等心臟旁分泌系統(tǒng)或自分泌系統(tǒng)在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[2]；但關(guān)于內(nèi)源性抗心肌纖維化防御體系研究甚少，其作用尚不清楚，如松弛素(Relaxin,RLX)，作為迄今最強的內(nèi)源性抗纖維化物質(zhì)之一[3]，其抗心肌纖維化的機制也仍未闡明。鑒于此，本研究擬通過觀察內(nèi)源性Relaxin-1、Relaxin-3及松弛素受體(RLXreceptor,LGR7)的表達(dá)變化及Relaxin對心肌纖維化的影響，為探尋心肌纖維化發(fā)病的新機制和防治的新策略提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物：C57B62小鼠[湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司《許可證號：SCXK(湘)2013-0004》]40只，雄性，14周齡，體重25±3g；所有小鼠均飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境中，按12h間隔光照黑暗交替，溫度20～25℃，濕度40%～70%，自由飲食飲水，普通飼料。實驗嚴(yán)格遵循實驗動物使用3R原則。

1.2房顫模型建立：40只C57B62小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機分為空白對照組、模型組、模型組+RLX1、模型組+RLX3組，每組10只。模型組、模型組+RLX1、模型組+RLX3組均構(gòu)建心房顫動小鼠模型：腹腔注射ISO 2.5mg·kg-1·d-1，空白對照組腹腔注射等量生理鹽水；連續(xù)注射2周后應(yīng)用MedLab-U/4C501H生物信號采集處理系統(tǒng)描記小鼠心電圖，對照組為標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，建模大鼠則為標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心房顫動，提示房顫模型建立成功；模型組+RLX1、模型組+RLX3組分別在造模成功后次日腹腔注射終濃度為100 ng/mL的RLX1、RLX3，連續(xù)注射7 d，空白對照組、模型組注射等量生理鹽水；一周后處死小鼠，取心臟組織備用。見圖1。

圖1 對照組小鼠與建模小鼠的Ⅱ?qū)?lián)心電圖

1.3組織標(biāo)本處理：20mg/kg 1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉；小鼠前胸開口，剪開左心耳，心間部穿刺后應(yīng)用20mL肝素鹽水灌注，待血液灌注干凈后取材；取4只小鼠僅保留左心室(每只小鼠左心室分3份)，液氮保存用于檢測Real-Time PCR檢測、Western Blot法；其余小鼠心臟組織制成4 μm厚的石蠟包埋切片(平行心臟縱軸連續(xù)切片)保存待檢。

1.4心肌膠原沉積纖維面積及心肌羥脯氨酸含量檢測：應(yīng)用天狼星紅染色觀察心肌纖維化，取石蠟切片常規(guī)脫蠟，苦味酸15s使背景變成紅色，1∶9比例的天狼猩紅:苦味酸滴染3min，無水乙醇10s、二甲苯3min，而后封片、鏡檢；采用Leica顯微鏡采集圖像，NIS-Elements 3.0分析圖像，Image-Pro plus 6.0軟件分別計算左心室、右心室、室間隔膠原沉積纖維面積百分比(膠原沉積纖維面積/整個心肌面積)。取20 mg液氮中心肌組織，應(yīng)用羥脯氨酸試劑盒檢測心肌羥脯氨酸含量，取30～100 mg左心室心肌組織，參照試劑盒說明書提取上清液，測定波長550時的吸光度(A)值，計算羥脯氨酸含量(μg/mg濕重)=(測定A值-空白A值)/(標(biāo)準(zhǔn)A值-空白A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(5μg/mL)×水解液總體積(10mL)/組織濕重(mg)。

1.5心肌Relaxin 1、Relaxin3其受體LGR7表達(dá)：①Real-Time PCR法：依據(jù)TRIzol試劑盒說明書步驟提取小鼠左心室組織總RNA，分光光度劑測定RNA濃度及純度，參照TaKaTa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，應(yīng)用Real-Time PCR檢測心肌Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA，以GAPDH為內(nèi)參；應(yīng)用灰度掃描系統(tǒng)分析電泳條帶，半定量分析心肌Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA水平(引物序列見表1)。②Western Blot法：提取心肌組織蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，按20μg/孔上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂牛奶室溫封膜后加入Relaxin 1抗體、β-actin抗體，40℃過夜。0.5% TBST洗膜、加二抗孵育60 min，洗膜后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法曝光拍照，Gel-pro 32圖像分析軟件定量分析結(jié)果，目的蛋白表達(dá)量與內(nèi)參照β-actin的灰度比值為目的蛋白相對表達(dá)量。參照上述Real-Time PCR法、Western Blot法檢測Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7蛋白表達(dá)。

表1 引物序列表

1.6α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)的表達(dá)和組織分布：①免疫組化法：取組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，過氧化氫滅活過氧化物酶，熱修復(fù)抗原后滴加α-SMA一抗，4℃過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min，而后滴加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作也，雙花扁豆凝集素(DBA)顯色、封片；Image-Pro 5.1圖像分析軟見分析α-SMA表達(dá)，每張切片取5個連續(xù)陽性表達(dá)(鏡下可見棕褐色顆粒)視野，測定積分光密度(integral optical density,IOD)。②Western Blot法：參照1.5中Western Blot法步驟檢測心肌組織α-SMA蛋白表達(dá)，同樣以目的蛋白表達(dá)量與內(nèi)參照β-actin的灰度比值為目的蛋白相對表達(dá)量，Western Blot法參照方法1.5。

1.7心肌纖維相關(guān)指標(biāo)表達(dá)：測定I型膠原蛋白(collagenⅠ)、Ⅲ型膠原蛋白(collagenⅢ)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-1(MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)、金屬蛋白酶組織抑制物-1(tissue inhibitors of metalloproteinases-1,TIMP-1)mRNA及蛋白表達(dá)；Real-Time PCR、Western Blot檢測方法參照1.5。

1.8心肌血管緊張素Ⅱ(AngiotensionⅡ,AngⅡ)、醛固酮(Aldosterone,ALD)及其受體表達(dá)：Real-Time PCR法檢測心肌AngⅡ、血管緊張素受體1(angiotensin receptor 1,AT1)、血管緊張素受體2(angiotensin receptor 2,AT2R)、醛固酮(Aldosterone,ALD)、鹽皮質(zhì)激素受體MineralocorticoidReceptor，MR)mRNA表達(dá)，Real-Time PCR檢測方法參照1.5。

2 結(jié) 果

2.1各組心肌膠原沉積纖維面積百分比、心肌羥脯氨酸含量比較：天狼猩紅染色可見心肌膠原纖維呈紅色，心肌細(xì)胞呈黃色表達(dá)，主要沉積于心肌細(xì)胞間隙、心肌血管周圍，空白對照組僅可見少量心肌膠原纖維沉積(圖A)，模型組可見大量心肌膠原纖維沉積(圖B)，模型組+RLX1、模型組+RLX3心肌膠原纖維沉積較模型組明顯減少(圖C、D)(見圖2)；模型組心肌膠原沉積纖維面積百分比，心肌羥脯氨酸含量較空白對照組顯著上升(P<0.05)；模型組、模型組+RLX1、模型組+RLX3組室間隔、右心室及左心室心肌膠原沉積纖維面積百分比，心肌羥脯氨酸含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；與模型組比較，模型組+RLX1、模型組+RLX3室間隔、右心室及左心室心肌膠原沉積纖維面積百分比，心肌羥脯氨酸含量明顯下降(P<0.016)，但模型組+RLX1、模型組+RLX3比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.016)，見圖2、表2。

圖2 天狼猩紅染色圖

表2 各組心肌膠原沉積纖維面積百分比心肌羥脯氨酸含量比較

2.2各組Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7比較：與空白對照組比較，模型組Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1蛋白、Relaxin 3蛋白、LGR7蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)；模型組、模型組+RLX1、模型組+RLX3組Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1蛋白、Relaxin 3蛋白、LGR7蛋白差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，與模型組比較，模型組+RLX1、模型組+RLX3 Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1蛋白、Relaxin 3蛋白、LGR7蛋白則明顯上升(P<0.016)，但模型組+RLX1、模型組+RLX3比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.016)，見表3。

表3 各組Relaxin 1 Relaxin 3 LGR7比較

2.3各組α-SMA IOD、α-SMA蛋白比較：與空白對照組比較，模型組免疫組化圖陽性染色明顯增加(圖A、B)，與模型組比較，模型組+RLX1、模型組+RLX3陽性染色明顯減少(圖C、D)；與空白對照組比較，模型組α-SMA IOD、α-SMA蛋白、collagenⅠ mRNA、collagenⅢ mRNA、collagenⅠ蛋白、collagenⅢ蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.05)；模型組、模型組+RLX1、模型組+RLX3組 α-SMA IOD、α-SMA蛋白、collagenⅠ mRNA、collagenⅢ mRNA、collagenⅠ蛋白、collagenⅢ蛋白比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)與模型組比較，模型組+RLX1、模型組+RLX3 α-SMA IOD、α-SMA蛋白、collagenⅠ mRNA、collagenⅢ mRNA、collagenⅠ蛋白、collagenⅢ蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.016)，但模型組+RLX1、模型組+RLX3比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.016)，見圖3、表4。

圖3 α-SMA免疫組化圖

表4 各組α-SMA collagenⅠ collagenⅢ比較

2.4各組心肌MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1 mRNA比較：與空白對照組比較，模型組MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA、MMP-13 mRNA、MMP-1 蛋白mRNA、MMP-2 蛋白、MMP-9 蛋白、MMP-13蛋白表達(dá)明顯上升，TIMP-1 mRNA、TIMP-1蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)；模型組、模型組+RLX1、模型組+RLX3組 MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA、MMP-13 mRNA、MMP-1 蛋白mRNA、MMP-2 蛋白、MMP-9 蛋白、MMP-13蛋白、TIMP-1 mRNA、TIMP-1蛋白差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F<0.001)，與模型組比較，模型組+RLX1、模型組+RLX3 MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA、MMP-13 mRNA、MMP-1 蛋白mRNA、MMP-2 蛋白、MMP-9 蛋白、MMP-13蛋白表達(dá)明顯下降、TIMP-1 mRNA、TIMP-1蛋白明顯上升(P<0.016)，但模型組+RLX1、模型組+RLX3比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.016)，見表5。

表5 各組心肌MMP-1 MMP-2 MMP-9 MMP-13 TIMP-1比較

2.5各組大鼠Ang Ⅱ、ALD及其受體mRNA表達(dá)：與空白對照組比較，模型組Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA水平明顯上升；模型組、模型組+RLX1、模型組+RLX3組 Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<.001)，與模型組比較，模型組+RLX1、模型組+RLX3 Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA明顯下降(P<0.016)，但模型組+RLX1、模型組+RLX3比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.016)，見表6。

表6 各組大鼠Ang Ⅱ ALD及其受體mRNA表達(dá)

3 討 論

心房顫動的發(fā)病機制繁雜，心房重構(gòu)則是心房顫動的重要病理環(huán)節(jié)之一，其最顯著特征為心肌纖維化，正常心肌細(xì)胞被膠原纖維包繞劃分，心肌細(xì)胞間的傳導(dǎo)連續(xù)性被破壞，增加傳導(dǎo)異質(zhì)性并減慢傳導(dǎo)速度，從而為折返環(huán)的形成及單項傳導(dǎo)阻滯提供病生理基礎(chǔ)[4,5]。當(dāng)前臨床抗心律失常藥物的主要作用機制仍是針對心房電重構(gòu)，治療效果有限。心肌纖維化作為心房顫動的重要危險因素，探討心房顫動患者心肌纖維化分子機制有重要意義，可為心房顫動的防治提供思路。Relaxin屬多功能活性多肽，是體內(nèi)分布極為廣泛，參與神經(jīng)垂體激素的分泌等廣泛生理過程的調(diào)節(jié)，與腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移，心血管疾病發(fā)病均有密切關(guān)聯(lián)，并具強大的抗纖維化效應(yīng)[6,7]。

本研究天狼猩紅染色可見心房顫動小鼠心肌膠原纖維主要沉積于心肌細(xì)胞間隙、心肌血管周圍，存在明顯的心肌膠原纖維沉積，且心肌羥脯氨酸濕重明顯增加。由此可見，心房顫動小鼠存在心肌纖維化，造模成功，且心房顫動心肌纖維小鼠心肌內(nèi)源性Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7表達(dá)明顯下調(diào)，存在表達(dá)缺失現(xiàn)象。為探究心房顫動心肌纖維小鼠心肌內(nèi)源性Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7表達(dá)對心肌纖維化的影響機制，本研究分別對模型小鼠補充外源性RLX1、RLX3，結(jié)果顯示外源性補充RLX1、RLX3后，模型組+RLX1、模型組+RLX3 小鼠心肌膠原纖維沉積、心肌羥脯氨酸濕重增加現(xiàn)象明顯緩解；且在補充外源性RLX1、RLX3后，模型組+RLX1、模型組+RLX3 小鼠Relaxin 1 mRNA、Relaxin 3 mRNA、LGR7 mRNA及Relaxin 1、Relaxin 3、LGR7蛋白明顯上升。Kanai等[8]報道，Relaxin 1水平升高伴有心肌纖維化率降低，指出Relaxin 1可作為心室纖維化的生物標(biāo)志物，可能成為抗纖維化治療靶點。這與本研究結(jié)論相似，由此可見，Relaxin 1與心房顫動小鼠心肌纖維化有關(guān)。

另肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化也與心肌纖維化密切相關(guān)，研究指出，當(dāng)心臟受炎性介質(zhì)、壓力超負(fù)荷等刺激時候多種細(xì)胞便可轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，以α-SMA生成表達(dá)為特征性結(jié)構(gòu)表現(xiàn)及標(biāo)記[9]。而α-SMA又可通過抑制心肌細(xì)胞外基質(zhì)降解酶來促進collagenⅠ、collagenⅢ分泌[10]。collagenⅠ、collagenⅢ作為心肌間質(zhì)膠原蛋白的主要成分，其含量及比值發(fā)生變化便可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)大量沉積，最終引起間質(zhì)網(wǎng)絡(luò)重建及心肌纖維化[11]。本研究顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠α-SMA水平明顯上升，collagenⅠ、collagenⅢ分泌也明顯增強；但在補充外源性RLX1、RLX3后模型組+RLX1、模型組+RLX3 α-SMA表達(dá)較模型組明顯下降，collagenⅠ、collagenⅢ分泌也明顯減少。因此外源性補充RLX1、RLX3可下調(diào)心肌間質(zhì)膠原蛋白含量，或能達(dá)到抑制間質(zhì)網(wǎng)絡(luò)重建、改善心肌纖維化的目的。MMPs、TIMPs則是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，其直接參與心肌膠原合成與降解，是維持細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。本研究顯示，模型組MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13 mRNA及蛋白表達(dá)明顯上升、TIMP-1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯下降；但補充外源性RLX1、RLX3后模型組+RLX1、模型組+RLX3 MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13 mRNA及蛋白表達(dá)較模型組明顯下降、TIMP-1 mRNA及蛋白較模型組明顯上升。這也進一步證實了外源性補充RLX1、RLX3在改善心肌纖維化上的價值。

研究指出[12]，心肌纖維化的發(fā)生與其自身的旁/自分泌活性物質(zhì)AngⅡ mRNA、ALD mRNA表達(dá)及活性增強關(guān)系密切。Relaxin則是心血管活性物質(zhì)，由心肌合成分泌，LGR7受體則主要富含于心室、心房，研究指出中樞系統(tǒng)Relaxin可通過抑制AngⅡ表達(dá)來調(diào)節(jié)中樞滲透壓[13]。本研究顯示模型組Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA水平明顯上升，提示心肌纖維化小鼠心肌Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA存在明顯過表達(dá)現(xiàn)象，這與往期報道結(jié)論相似[14]。但補充外源性RLX1、RLX3后，模型組+RLX1、模型組+RLX3 Ang Ⅱ mRNA、AT1R mRNA、AT2R mRNA、ALD mRNA、MR mRNA較模型組明顯下降。由此可見，Relaxin可能通過作用于心臟旁/自分泌的AngⅡ及ALD系統(tǒng)拮抗心肌纖維化，或可作為機體抗纖維化的內(nèi)源性防御體系。

綜上所述，由此可見，心房顫動心肌纖維化小鼠內(nèi)源性Relaxin-1、Relaxin-3表達(dá)過低現(xiàn)象，補充外源性RLX1、RLX3可明顯改善其內(nèi)源性Relaxin-1、Relaxin-3表達(dá)過低現(xiàn)象，并有效改善心肌纖維化，分析Relaxin可能通過作用于AngⅡ及ALD系統(tǒng)拮抗心肌纖維化，值得臨床重視。