蔡萌萌，劉子強，戶紅通，陳 寧，2，3，徐慶陽，2，3*

（1.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457；3.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津 300457）

L-羥脯氨酸是亞氨基酸L-脯氨酸羥基化后的產(chǎn)物[1]，其存在于明膠、膠原、細胞壁蛋白質(zhì)中[2]，也存在于一些微生物的次級代謝產(chǎn)物中。L-羥脯氨酸作為一種稀有的亞氨基酸，在醫(yī)藥[3-5]、化工[6-8]、食品[9-10]和美容[11-13]等行業(yè)都具有廣泛的應(yīng)用。目前，生產(chǎn)L-羥脯氨酸的方法包括生物提取法、化學合成法和微生物發(fā)酵法，其中應(yīng)用最廣的生物提取法具有諸多弊端，正逐漸被市場淘汰[14]，而微生物發(fā)酵法正以其原料來源廣泛、成本低、工藝環(huán)保等優(yōu)勢迅速發(fā)展起來。

采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-羥脯氨酸時，L-脯氨酸在羥化酶的催化作用下生成L-羥脯氨酸，此過程需要Fe2+作為催化輔因子，同時需要α-酮戊二酸和氧氣的參與[15]，但是微生物細胞內(nèi)合成的α-酮戊二酸含量有限，限制了L-羥脯氨酸的高效合成[16]。因此，本實驗在L-羥脯氨酸發(fā)酵過程中外源添加α-酮戊二酸，通過改變α-酮戊二酸的添加量、添加時間和添加方式來探究α-酮戊二酸對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響，旨在提高L-羥脯氨酸產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

大腸桿菌（Escherichia coli）4HYP：由天津科技大學代謝工程研究室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉6 g/L，（NH4）2SO41 g/L，KH2PO42 g/L，檸檬酸0.5 g/L，維生素B1（vitamin B1，VB1）1 mg/L，維生素H（vitamin H，VH）0.3 mg/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉3 g/L，（NH4）2SO41 g/L，KH2PO44 g/L，檸檬酸0.5 g/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L，VB15 mg/L，VH 0.2 mg/L。

1.1.3 化學試劑

葡萄糖：西王藥業(yè)有限公司鄒平分公司；酵母粉：英國OXOID公司；（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaOH、FeSO4·7H2O：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；檸檬酸、MnSO4·H2O、H2O2：國藥集團化學試劑有限公司；L-羥脯氨酸：北京索萊寶科技有限公司；對二甲氨基苯甲醛：上海三愛思試劑有限公司；硫酸：天津化學試劑二廠。實驗所用化學試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250-A生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；5L離位滅菌發(fā)酵罐、30 L在位滅菌發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；KQ-C型全自控蒸汽發(fā)生器：上海奉賢協(xié)新機電廠；V-1200型可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；TG16-W微量臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

搖瓶培養(yǎng)方法：在無菌條件下，用接種環(huán)劃取一環(huán)斜面菌種至含有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL圓底三角瓶中，200 r/min、37℃培養(yǎng)10 h，然后按發(fā)酵培養(yǎng)基體積10%的接種量將菌液接種至含有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板三角瓶中，pH 7.0～7.2、37℃、200 r/min培養(yǎng)，發(fā)酵過程中以苯酚紅作指示劑，當發(fā)酵液紅色褪去時，補加體積分數(shù)25%的氨水溶液至紅色出現(xiàn)，當發(fā)酵液長時間不變色時，補加1 mL 60 g/L的葡萄糖溶液維持發(fā)酵進行。

發(fā)酵罐培養(yǎng)方法：在無菌條件下，將活化的斜面菌種（1個250 mL茄形瓶）接種于含3 L種子培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中進行種子培養(yǎng)，pH 7.0～7.2、溫度37℃、溶氧25%～30%，當OD600nm值為15左右時，以10%的接種量將其接種到30 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，接種后發(fā)酵液體積為14 L，通過發(fā)酵罐自動控制溫度37℃、pH 7.0～7.2，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通風量控制溶氧水平在25%～30%，當溶氧快速上升時說明培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡，此時調(diào)節(jié)補糖脈沖比，自動流加80 g/L的葡萄糖溶液，發(fā)酵過程中每隔2 h取樣檢測并記錄數(shù)據(jù)。

1.3.2 測定方法

pH值：pH值采用發(fā)酵罐連接的pH電極和精密pH試紙（6.4～8.0）測定；溶氧：采用發(fā)酵罐連接的溶氧電極。

菌體OD600nm值：將待測發(fā)酵液進行適當倍數(shù)的稀釋，分光光度計測定波長600 nm處的吸光度值，將得到的吸光度值與稀釋倍數(shù)相乘即為菌體OD600nm值。

L-羥脯氨酸含量測定[17]：取適量L-羥脯氨酸發(fā)酵液13 000 r/min離心2 min去除菌體，得到上清液，取20 μL于1 mL 5%H2O2溶液中，加入2滴1%CuSO4溶液和1 mL 10%NaOH溶液，混合均勻后呈現(xiàn)淡黃色，室溫反應(yīng)10 min至顏色消失且無氣泡產(chǎn)生，加入1mL1%對二甲氨基苯甲醛硫酸溶液，混勻后沸水浴5 min，顏色由粉紅色變?yōu)榘导t色，冷卻后加入10mL蒸餾水，混合均勻，于波長560nm處測定吸光度值，以同樣的方法測定20 g/L的L-羥脯氨酸標準溶液的吸光度值，通過計算得到L-羥脯氨酸含量，其計算公式如下：

代謝流平衡模型的建立方法參照參考文獻[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-酮戊二酸添加量對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響

為了考察不同α-酮戊二酸添加量對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響，通過搖瓶實驗，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0、1 g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的α-酮戊二酸，每組設(shè)置3個平行，發(fā)酵24h后，菌體OD600nm值和L-羥脯氨酸產(chǎn)量情況如圖1所示。

圖1 不同α-酮戊二酸添加量對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of α-ketoglutarate addition on the fermentation of L-hydroxyproline

由圖1可知，隨著α-酮戊二酸添加量的增加，細菌的OD600nm值逐漸降低，當α-酮戊二酸添加量≤4 g/L時，菌體OD600nm值雖有減少，但減少的幅度并不顯著，當添加量增加至5g/L時，菌體OD600nm值顯著下降。當α-酮戊二酸添加量為0～4 g/L時，L-羥脯氨酸的產(chǎn)量隨α-酮戊二酸的增加而逐步增加，且添加量在4g/L時，L-羥脯氨酸產(chǎn)量達到最大值12.75g/L，與未添加α-酮戊二酸的產(chǎn)量（7.03g/L）相比，提高了81.37%。這說明雖然α-酮戊二酸的添加會對菌體生長產(chǎn)生一定的抑制作用，但在一定范圍內(nèi)，外源添加α-酮戊二酸能有效緩解細胞內(nèi)α-酮戊二酸含量不足的問題，使菌體高效合成L-羥脯氨酸。因此，α-酮戊二酸最適添加量為4 g/L。

2.2 α-酮戊二酸添加時間對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響

為了考察不同α-酮戊二酸添加時間對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響，分別在發(fā)酵0 h（培養(yǎng)基中）、6 h（發(fā)酵前期）、14 h（發(fā)酵中期）和22 h（發(fā)酵后期）加入4 g/Lα-酮戊二酸，同時以不添加α-酮戊二酸的發(fā)酵實驗作為對照，發(fā)酵過程中菌體生長情況、L-羥脯氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率如圖2所示。

圖2 不同α-酮戊二酸添加時間對菌體生長情況（A）、L-羥脯氨酸產(chǎn)量（B）及糖酸轉(zhuǎn)化率（C）的影響Fig.2 Effects of different addition time of α-ketoglutarate on the cell growth(A),L-hydroxyproline yield(B)and glucose to acid conversion ratio(C)

由圖2（A）可知，當0 h添加α-酮戊二酸時，菌體生長初期受到了嚴重的抑制作用，之后隨著α-酮戊二酸的消耗，菌體生長速率基本恢復(fù)正常，但最終菌體OD600nm值只有98.5，與未添加α-酮戊二酸的菌體OD600nm值125.4相比，降低了27.31%；隨著α-酮戊二酸添加時間的推移，菌體OD600nm值受到的影響逐漸減小，當22 h添加α-酮戊二酸時，菌體OD600nm值為117.7，與未添加α-酮戊二酸的OD600nm值相比，僅降低了6.79%。

由圖2（B）可知，當外源添加α-酮戊二酸后，L-羥脯氨酸的產(chǎn)酸速率明顯提高，隨著α-酮戊二酸的消耗，產(chǎn)酸速率恢復(fù)常規(guī)水平，當發(fā)酵前期添加α-酮戊二酸時，雖然搖瓶實驗中，L-羥脯氨酸的產(chǎn)量得到了明顯提高，但在發(fā)酵罐中進行發(fā)酵時，L-羥脯氨酸的產(chǎn)量并未獲得提升，這可能是由于前期菌體生長受到抑制，菌體總量較低導(dǎo)致的；當22 h添加α-酮戊二酸時，L-羥脯氨酸最終產(chǎn)量達47.21 g/L，與不添加α-酮戊二酸的產(chǎn)量42.03g/L相比，提高了12.32%。

由圖2（C）可知，22h添加α-酮戊二酸時L-羥脯氨酸的糖酸轉(zhuǎn)化率最高，達到20.77%，與不添加α-酮戊二酸的19.79%相比，提高了4.95%。

通過改變α-酮戊二酸的添加時間，L-羥脯氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率獲得了一定程度的提高，但并沒有達到理想水平，這可能是由于添加α-酮戊二酸時采用的是分批補料策略，即將其一次性加入發(fā)酵液中，導(dǎo)致了發(fā)酵液中α-酮戊二酸濃度瞬間升高，嚴重抑制了菌體生長，同時隨著α-酮戊二酸的消耗，產(chǎn)酸速率未能一直維持較高水平，因此，接下來考慮采用連續(xù)補料策略進行L-羥脯氨酸的發(fā)酵。

2.3 α-酮戊二酸連續(xù)補料策略對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響

為了研究α-酮戊二酸連續(xù)補料策略對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響，分別添加3 g/L、4 g/L、5 g/L和6 g/L（初始發(fā)酵液）α-酮戊二酸溶液至糖溶液中，當發(fā)酵底糖耗盡時，使α-酮戊二酸隨糖流加入發(fā)酵液，發(fā)酵過程中菌體生長情況、L-羥脯氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率如圖3所示。

圖3 α-酮戊二酸連續(xù)補料策略對菌體生長情況（A）、L-羥脯氨酸產(chǎn)量（B）及糖酸轉(zhuǎn)化率（C）的影響Fig.3 Effect of continuous feeding strategy of α-ketoglutarate on the cell growth(A),L-hydroxyproline yield(B)and glucose to acid conversion ratio(C)

由圖3（A）可知，當隨糖流加α-酮戊二酸的含量≤5 g/L時，對菌體生長沒有太大影響，當隨糖流加α-酮戊二酸含量增加至6 g/L時，菌體OD600nm顯著下降。由圖3（B）可知，菌體的產(chǎn)酸能力明顯提高，且到發(fā)酵后期菌體依然保持較高活力，與分批補料策略相比，發(fā)酵時間延長了6 h，產(chǎn)量大大提高；在一定范圍內(nèi)，隨著α-酮戊二酸流加濃度的增加，L-羥脯氨酸產(chǎn)量逐漸升高，當隨糖流加α-酮戊二酸含量為5 g/L時，L-羥脯氨酸的產(chǎn)量最高，達62.14 g/L，與不添加α-酮戊二酸相比，提高了47.85%，與22 h時一次性加入α-酮戊二酸相比，提高了31.62%，但當隨糖流加α-酮戊二酸含量＞5 g/L之后，因α-酮戊二酸對菌體生長的影響使得產(chǎn)量未能繼續(xù)提升。由圖3（C）可知，當隨糖流加α-酮戊二酸含為5 g/L時，L-羥脯氨酸發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率達到最大值22.37%，與不添加α-酮戊二酸和22 h一次性加入α-酮戊二酸相比，分別提高了13.04%和7.70%。

2.4 α-酮戊二酸連續(xù)補料對L-羥脯氨酸代謝流的影響

根據(jù)L-羥脯氨酸發(fā)酵過程中菌體生長情況，假設(shè)22～28 h期間細胞處于擬穩(wěn)態(tài)，檢測該階段發(fā)酵液中L-羥脯氨酸、葡萄糖、丙酮酸、乳酸、乙酸及賴氨酸的濃度，計算其積累或消耗速率，利用MATLAB軟件計算分析，得到L-羥脯氨酸生物合成途徑的代謝流分布情況，結(jié)果如圖4所示。

圖4 L-羥脯氨酸合成代謝流分布Fig.4 Synthetic metabolic flux distribution of L-hydroxyproline

由圖4可知，當發(fā)酵過程中不添加α-酮戊二酸時，進入糖酵解途徑（glycolytic pathway，EMP）的代謝流為58.01，進入磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，HMP）的代謝流為41.99，從異檸檬酸（isocitric acid，ICI）進入乙醛酸循環(huán)和三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）的代謝流分別為3.69和147.43，主要副產(chǎn)物乙酸合成的代謝流為5.54，產(chǎn)物L-羥脯氨酸合成的代謝流為26.96，當隨糖流加5 g/L α-酮戊二酸時，進入EMP途徑的代謝流提高到53.60，進入HMP途徑的代謝流下降為46.40，從ICI進入乙醛酸循環(huán)的代謝流為3.39，進入TCA循環(huán)的代謝流為145.26，同時，乙酸合成的代謝流（3.91）明顯減少，L-羥脯氨酸合成的代謝流（30.19）顯著增加，與不添加α-酮戊二酸的相比，L-羥脯氨酸合成的代謝流提高了11.98%，乙酸合成代謝流減少了29.42%?？梢?，α-酮戊二酸的加入可有效降低副產(chǎn)物乙酸的生成，使更多的代謝流流向L-羥脯氨酸的合成途徑。

3 結(jié)論

菌體細胞內(nèi)L-羥脯氨酸的合成需要α-酮戊二酸的參與，但往往細胞自身合成的α-酮戊二酸含量有限，不能滿足需要，因此本研究通過在L-羥脯氨酸發(fā)酵過程中外源添加α-酮戊二酸來解決這一問題。實驗結(jié)果表明，在L-羥脯氨酸發(fā)酵過程中，外源添加α-酮戊二酸能有效提高L-羥脯氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，但α-酮戊二酸對菌體生長有一定的抑制作用，所以其添加濃度應(yīng)該控制在一定范圍內(nèi)；當采用連續(xù)補料策略，使α-酮戊二酸隨糖流加，質(zhì)量濃度在5 g/L時，L-羥脯氨酸產(chǎn)量能夠達到最大值62.14 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為22.37%，與不添加α-酮戊二酸相比，分別提高了47.85%、13.04%，同時，L-羥脯氨酸的合成代謝流提高了11.98%，副產(chǎn)物乙酸合成代謝流減少了29.42%。