張艾青

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 食品與藥品科技學院，山東 濰坊 261061）

羊乳具有特殊的風味、營養(yǎng)價值及保健功能，但由于其自帶的膻味較重，極大程度限制了羊乳制品的研究與生產(chǎn)加工[1]。羊乳中蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)、維生素及多種生物活性物質(zhì)的含量較高，主要營養(yǎng)物質(zhì)含量與母乳較相近，且具有抗過敏、抗衰老、提高免疫力等保健作用[2]。經(jīng)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵羊乳可以減輕羊奶特有的膻味，提高羊乳產(chǎn)品的營養(yǎng)物質(zhì)含量，同時發(fā)酵能提高羊乳的抗氧化能力。有研究表明，山羊乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后有較強的抗氧化能力，主要體現(xiàn)為DPPH自由基清除能力和抑制脂質(zhì)過氧化能力的增強[3]。根據(jù)國內(nèi)外研究表明，發(fā)酵劑的復(fù)合使用可以有效彌補單一發(fā)酵劑發(fā)酵的缺點，使發(fā)酵乳制品的口感、風味較單一發(fā)酵劑發(fā)酵乳制品更容易被廣大消費者接受[4]。

酵素是以水果、蔬菜、食用中藥材等為原料，通過天然發(fā)酵或添加有益微生物發(fā)酵而成的一類具有保健功能的發(fā)酵制品[5]。酵素中不僅含大量的氨基酸、礦物質(zhì)、功效酶等發(fā)酵原料中原有的成分，也具有較高含量的還原糖、維生素C、酚類、花色苷、超氧化物歧化酶等抗氧化物質(zhì)[6]，具有清除人體自由基、美容養(yǎng)顏等多種益生作用[7-8]。目前天然酵素的開發(fā)和利用還處于初級水平，有待進一步深入[4]。蘋果酵素是以蘋果為原料，經(jīng)自然發(fā)酵所得，其含有大量的維生素、礦物質(zhì)、酵母菌及其代謝產(chǎn)物等，具有一定的生物功能[9]。經(jīng)研究表明，發(fā)酵所得的蘋果酵素具有較強的抗氧化能力，強于蘋果的抗氧化性[10]。而用蘋果酵素發(fā)酵羊乳的研究至今未有報道。

作者以蘋果酵素協(xié)同多菌種（丁二酮乳酸鏈球菌與雙歧桿菌）制備發(fā)酵羊乳制品，并測定其抗氧化活性。將蘋果酵素添加至羊乳制品制成蘋果酵素發(fā)酵羊乳產(chǎn)品，不僅增加其抗氧化性，還有效提高了產(chǎn)品的適口性，更易被消費者接受，促進水果酵素發(fā)酵羊乳產(chǎn)品的商業(yè)化應(yīng)用，為后續(xù)羊乳制品的生產(chǎn)和開發(fā)提供一定的技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：新鮮羊乳由山東陽春羊奶乳業(yè)公司提供，蘋果為山東濰坊紅富士。

A發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌質(zhì)量比為1∶1）、B發(fā)酵劑（丁二酮乳酸鏈球菌∶雙歧桿菌質(zhì)量比為1∶1）：購于丹麥Danisco公司；濃硫酸、無水硫酸銅、乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉、甲醛等均為分析級：購于天津市大茂化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平：賽多斯科學儀器有限公司產(chǎn)品；精密數(shù)顯酸度計：上海電子儀器廠產(chǎn)品；HH-4電子恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司產(chǎn)品；離心機：上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；分光光度計：常州澳華儀器有限公司產(chǎn)品；SQ510C立式壓力蒸汽滅菌鍋：重慶雅馬拓科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 蘋果酵素制備 將蘋果洗凈、晾干后分別切塊，按照白砂糖、水果和蒸餾水質(zhì)量比為1∶8∶10加到發(fā)酵罐中，把罐體密封好置于25~30℃發(fā)酵，每隔3 d于無菌操作臺中通氣1次，靜置發(fā)酵30 d。在無菌狀態(tài)下，6℃、4 000 r/min離心10 min，保留上清液，保存?zhèn)溆肹11]。

1.3.2 蘋果酵素發(fā)酵羊乳制備 新鮮羊乳添加質(zhì)量分數(shù)6%的蔗糖，20~25 MPa均質(zhì)處理后90℃殺菌30 min，冷卻至40~45℃，添加質(zhì)量分數(shù)1%~5%的蘋果酵素，裝瓶后在41~44℃下培養(yǎng)2.5~4.0 h，置于0~4℃儲藏。

1.3.3 發(fā)酵羊乳制備 新鮮羊乳添加質(zhì)量分數(shù)6%的蔗糖，20~25 MPa均質(zhì)處理后90℃殺菌30 min，冷卻至40~45℃，添加質(zhì)量分數(shù)3%的雙歧桿菌，裝瓶置于41~44℃，培養(yǎng)時間2.5~4.0 h，將發(fā)酵好的羊乳置于0~4℃儲藏。

1.3.4 復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵羊乳制備 新鮮羊乳添加質(zhì)量分數(shù)6%的蔗糖，20~25 MPa均質(zhì)處理后90℃殺菌30 min，冷卻至40~45℃，添加質(zhì)量分數(shù)3%的發(fā)酵劑（發(fā)酵劑A或發(fā)酵劑B），裝瓶后在41~44℃下培養(yǎng)2.5~4.0 h，將發(fā)酵好的羊乳置于0~4℃儲藏。

1.3.5 復(fù)合型發(fā)酵羊乳制備 新鮮羊乳添加質(zhì)量分數(shù)6%的蔗糖，20~25 MPa均質(zhì)處理后90℃殺菌30 min，冷卻至40~45℃，添加蘋果酵素和發(fā)酵劑，41~44℃下裝瓶，培養(yǎng)2.5~4.0 h，將發(fā)酵好的復(fù)合型發(fā)酵羊乳置于0~4℃儲藏。

1.3.6 發(fā)酵羊乳感官評定 發(fā)酵羊乳感官評定指標按照GB 19302—2010[12]進行評定，具體指標見表1。

表1 感官評價指標Table 1 Sensory evaluation index

1.3.7 發(fā)酵羊乳理化指標測定 蛋白質(zhì)檢測按照GB 5009.5—2016方法測定，脂肪含量按照GB 5413.3—2010蓋勃法測定，非脂乳固體檢測按照GB 5413.39—2010方法進行測定[13-15]。

1.3.8 乳酸菌數(shù)測定 按照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗方法》測定發(fā)酵羊乳中乳酸菌數(shù)[16]。

1.3.9 DPPH·自由基清除能力的測定 參照文獻[17-20]的方法，將400μL提取液與2.6 mL濃度0.1 mmol/L的DPPH（用乙醇溶解）溶液混合，在黑暗中放置30 min，使用無水乙醇作為空白，并測量517 nm處的吸光度。DPPH的清除率計算公式如下。

式中：D為DPPH清除率，%；A1為樣品與DPPH溶液的吸光度；A2為樣品與無水乙醇溶液的吸光度；A3為無水乙醇與DPPH溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Excel 2007和Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪制曲線圖，SPSS 17.0進行方差分析和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果酵素添加質(zhì)量分數(shù)對發(fā)酵羊乳感官評定指標的影響

由表2可以得出，蘋果酵素添加的質(zhì)量分數(shù)越高，發(fā)酵羊乳的凝固性越強，蘋果口味越強，酸度和甜度呈現(xiàn)增加趨勢。當蘋果酵素添加質(zhì)量分數(shù)為4%時，發(fā)酵羊乳凝固性好，色澤為乳白色，顏色分布均勻，具有發(fā)酵羊乳特有的風味，有蘋果口味，酸度合適，甜度合適，口感較佳，易于被大眾接受。其可能原因為，蘋果酵素添加質(zhì)量分數(shù)過低，發(fā)酵能力不夠，出現(xiàn)了發(fā)酵不完全，產(chǎn)品酸度低，凝固性差，甜度低等現(xiàn)象。

表2 蘋果酵素發(fā)酵羊乳感官評定Table 2 Sensory evaluation of goat milk fermented by apple-ferment

2.2蘋果酵素添加質(zhì)量分數(shù)對發(fā)酵羊乳理化指標的影響

由圖1（a）可知，當蘋果酵素添加質(zhì)量分數(shù)增加時，發(fā)酵羊乳中脂肪和蛋白質(zhì)含量均降低，且存在顯著性差異（P<0.05）。由圖1（b）可知，隨著蘋果酵素添加質(zhì)量分數(shù)增加，發(fā)酵羊乳中非脂乳固體含量呈上升趨勢，且存在顯著性差異（P<0.05）。原因在于蘋果酵素中含有大量蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，可以酶解羊乳中的蛋白質(zhì)和脂肪，從而使發(fā)酵羊乳中的蛋白質(zhì)和脂肪含量降低[21]，故當添加蘋果酵素時，蘋果酵素發(fā)酵羊乳中蛋白質(zhì)和脂肪含量降低。綜合口感和營養(yǎng)成分考慮，蘋果酵素添加質(zhì)量分數(shù)為4%時最佳。

圖1 蘋果酵素添加質(zhì)量分數(shù)對發(fā)酵羊乳理化指標的影響Fig.1 Effect of apple-ferment addition on the physicochemical properties of fermented goat milk

2.3 不同發(fā)酵劑對發(fā)酵羊乳感官評定指標的影響

從表3可知，A發(fā)酵劑和B發(fā)酵劑發(fā)酵羊乳的凝固性、色澤、滋味和氣味等感官評價結(jié)果相似，但B發(fā)酵劑酸度明顯優(yōu)于A發(fā)酵劑。保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、丁二酮乳酸鏈球菌和雙歧桿菌是發(fā)酵酸奶常用的發(fā)酵劑，發(fā)酵能力基本相同，可使發(fā)酵所得的羊乳具有酸奶特有的口感、風味[22]。丁二酮乳酸鏈球菌發(fā)酵羊乳可以產(chǎn)生特有的酸乳風味，因其可以發(fā)酵檸檬酸，產(chǎn)生具有芳香氣味的丁二酮[23-24]。利用單一的雙歧桿菌發(fā)酵羊乳作為陽性對照，對比發(fā)現(xiàn)B發(fā)酵劑發(fā)酵羊乳酸度合適，風味俱佳，故而B發(fā)酵劑較佳。

表3 發(fā)酵劑發(fā)酵羊乳的感官評定Table 3 Sensory evaluation of goat milk fermented by starter cultures

2.4 不同發(fā)酵劑對發(fā)酵羊乳理化指標的影響

由表4可知，相較于A發(fā)酵劑發(fā)酵羊乳，B發(fā)酵劑發(fā)酵羊乳脂肪和非脂乳固體質(zhì)量分數(shù)分別增加0.63%和0.07%，但差異性不顯著（P>0.05），蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)增加7.43%，存在顯著性差異（P<0.05）。相較于雙歧桿菌發(fā)酵羊乳，B發(fā)酵劑發(fā)酵羊乳蛋白質(zhì)、脂肪和非脂乳固體質(zhì)量分數(shù)分別增加11.33%、2.75%和0.36%，存在顯著性差異（P<0.05）。雙歧桿菌可以產(chǎn)生人體必需的B族維生素、丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸和蘇氨酸等營養(yǎng)物質(zhì)[25]。

2.5 不同發(fā)酵劑對發(fā)酵羊乳中乳酸菌數(shù)的影響

到發(fā)酵終點時，測定發(fā)酵羊乳中的乳酸菌總數(shù)。由表4可知，A發(fā)酵劑發(fā)酵羊乳乳酸菌數(shù)為3.8×106CFU/mL，雙歧桿菌發(fā)酵羊乳乳酸菌數(shù)為3.2×106CFU/mL，B發(fā)酵劑發(fā)酵羊乳乳酸菌數(shù)為4.5×106CFU/mL，明顯優(yōu)于A發(fā)酵劑。乳酸菌可提高人體對發(fā)酵羊乳中乳糖、鈣、磷、鐵的利用率，促進維生素D的吸收和增加蛋白酶的分泌，使發(fā)酵羊乳中的蛋白質(zhì)更易于消化吸收[23]。綜合2.3和2.4的結(jié)論，選擇B發(fā)酵劑應(yīng)用于制備發(fā)酵羊乳。

表4 不同發(fā)酵劑對發(fā)酵羊乳理化指標的影響Table 4 Effects of different starter cultures on the physicochemical indexes of fermented goat milk

2.6 發(fā)酵劑添加質(zhì)量分數(shù)對復(fù)合型發(fā)酵羊乳感官評定指標的影響

蘋果酵素復(fù)合B發(fā)酵劑發(fā)酵羊乳感官評定指標見表5。當B發(fā)酵劑添加質(zhì)量分數(shù)為2%~3%時，復(fù)合型發(fā)酵羊乳有乳清析出且酸度偏高，可能是由于B發(fā)酵劑添加質(zhì)量分數(shù)過多，羊乳發(fā)酵過度，使制品酸度偏高。當B發(fā)酵劑添加質(zhì)量分數(shù)為1%時，復(fù)合型發(fā)酵羊乳凝固性好，色澤為乳白色，顏色分布均勻，具有發(fā)酵羊乳特有的風味，有蘋果口味，酸度合適，甜度合適。故而B發(fā)酵劑最佳添加質(zhì)量分數(shù)為1%。

表5 復(fù)合型發(fā)酵羊乳感官評定Table 5 Sensory evaluation of compound fermented goat milk

2.7 發(fā)酵劑添加質(zhì)量分數(shù)對復(fù)合型發(fā)酵羊乳理化指標的影響

由圖2可知，B發(fā)酵劑添加質(zhì)量分數(shù)的變化對復(fù)合型發(fā)酵羊乳蛋白質(zhì)、脂肪和非脂乳固體含量影響較小，沒有顯著性差異，所測定指標符合國家標準要求[17]。綜合復(fù)合型羊乳的感官指標和理化指標，B發(fā)酵劑最佳添加質(zhì)量分數(shù)為1%。

圖2 發(fā)酵劑添加質(zhì)量分數(shù)對復(fù)合型發(fā)酵羊乳理化指標的影響Fig.2 Effect of content of starter cultures on the physicochemical properties of compound fermented goat's milk

2.8 不同發(fā)酵羊乳抗氧化能力的測定

由表6可知，相較于蘋果酵素發(fā)酵羊乳，雙歧桿菌發(fā)酵羊乳、B發(fā)酵劑發(fā)酵羊乳和復(fù)合型發(fā)酵羊乳對DPPH自由基清除率明顯增加，分別增加了2.01%、4.88%和8.91%，存在顯著性差異（P<0.05）。蘋果酵素的抗氧化能力與其所含的小分子糖、多糖、多酚類化合物及超氧化物歧化酶（SOD）等活性成分含量有關(guān)[26-27]。將蘋果酵素與復(fù)合發(fā)酵劑聯(lián)合使用時，復(fù)合型發(fā)酵羊乳中不僅含有小分子糖、多糖、多酚類化合物[9]，同時乳酸菌將羊乳中的蛋白質(zhì)降解成具有一定抗氧化活性的小分子肽，其DPPH清除能力較強，從而提高了發(fā)酵羊乳的抗氧化活性[28]。

表6 不同發(fā)酵羊乳抗氧化能力的測定Table 6 Determination of antioxidant capacity of different fermented goat milk

3 結(jié) 語

蘋果酵素含有小分子糖、多糖、多酚類化合物及SOD等活性成分，具有較強的抗氧化能力。優(yōu)化了蘋果酵素復(fù)合發(fā)酵劑制備發(fā)酵羊乳的方法，并結(jié)合發(fā)酵羊乳的感官和理化指標，確定了最佳發(fā)酵工藝。當蘋果酵素添加質(zhì)量分數(shù)為4%，B發(fā)酵劑添加質(zhì)量分數(shù)為1%時，復(fù)合型發(fā)酵羊乳凝固性好，色澤為乳白色，顏色分布均勻，具有發(fā)酵羊乳特有的風味，同時具有蘋果口味，酸、甜度合適。對DPPH自由基清除能力為95.17%，相比于B發(fā)酵劑發(fā)酵羊乳，其DPPH自由基清除能力得到增強。為發(fā)酵羊乳制品的進一步研究與開發(fā)、工業(yè)化生產(chǎn)和生物功能研究提供一定參考。