曾 文 麥榮嘉 鄧文喻 黃 研 郭家銘

廣東省婦幼保健院 廣東廣州 510010

Epstein-Barr病毒(EBV)，也被稱為人類皰疹病毒4 (HHV-4)，是一種雙鏈DNA病毒，據(jù)估計95%的全世界的人口血清呈陽性。EBV原發(fā)感染多數(shù)無明顯癥狀或表現(xiàn)為上呼吸道感染，部分患兒在感染可發(fā)展為傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)[1-2]。IM是一種良性的淋巴細(xì)胞增殖性疾病，多數(shù)表現(xiàn)為急性發(fā)作，并具有自限性；然而，少部分患兒會在病毒持續(xù)的感染下，出現(xiàn)嚴(yán)重威脅生命的并發(fā)癥，此類患者即為慢性活動性EB病毒感染(chronic active EBV disease，CAEBV)，或者甚至由IM演變?yōu)镋B病毒相關(guān)性噬血細(xì)胞綜合癥(hemophagocytic syndrome，HPS)又稱噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥(hemophagocytic lymphonistiocytosis，HLH)[3，4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EBV-DNA載量檢測對原發(fā)性IM的早期診斷有重要意義[5]，但是為了進一步深入研究初診EBV-DNA拷貝數(shù)水平，外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的拷貝數(shù)變化與患者疾病進展預(yù)后情況之間的關(guān)系，本研究總結(jié)了本院收治的 68例EBV感染患者的臨床資料并對其預(yù)后情況進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年1月—2021年1月于廣東省婦幼保健院診斷為原發(fā)性EBV感染(IM)共68例住院患兒的臨床資料。

IM診斷標(biāo)準(zhǔn)是參考《兒童主要非腫瘤性EB病毒感染相關(guān)疾病的診斷和治療原則建議》[6]：①臨床表現(xiàn)：發(fā)熱、咽峽炎、淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大；②外周血白細(xì)胞分類以淋巴細(xì)胞為主，異形淋巴細(xì)胞百分比>10%；③EBV感染依據(jù)：EB病毒衣殼抗原抗體(EBV-VCA-IgM)陽性。具備診斷標(biāo)準(zhǔn)①中任意3項，并同時具備③，有或無②，可診斷IM。HLH診斷標(biāo)準(zhǔn)采用 HLH-2004 診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.2 方法

EBV核酸提取及檢測(熒光定量PCR法)，實時熒光定量PCR檢測EBV-DNA 采用核酸提取試劑盒提取外周血DNA，EBV檢測試劑盒進行熒光定量 PCR 反應(yīng),嚴(yán)格按照說明書進行操作。以拷貝數(shù)>500 拷貝數(shù)/mL為陽性。根據(jù)EBV-DNA載量將68例EBV感染患兒分為低拷貝組(<104拷貝/mL)42例，高拷貝組(>104拷貝數(shù)/mL)26例，比較不同EBV-DNA載量IM患兒TBNK淋巴細(xì)胞亞群、生化指標(biāo)水平、預(yù)后狀態(tài)以及預(yù)后EBV-DNA載量。

PBMC的分離提取采集患者全血約 5 mL，以5 mL PBS稀釋。緩慢將5 mL稀釋的血液溶液加入到2.5 mL Ficoll溶液中，離心 20 min，然后收集含單核細(xì)胞層細(xì)胞。并采用核酸提取試劑盒提取PBMC的DNA。

1.3 流式細(xì)胞儀分析TBNK淋巴細(xì)胞亞群

取20 μL抗凝血,加入紅細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞,離心 (1 000 r/min,5 min)，棄上清，加入熒光標(biāo)記抗體CD3+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞(CD3+CD4+)、CD8+T細(xì)胞(CD3+CD8+)、NK細(xì)胞(CD3-CD16+和56+)、B淋巴細(xì)胞(CD19+)，震蕩混勻，室溫避光孵育15～20 min，取200 μL置于流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 肝功能檢測

生化指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測于ADVIA2400生化儀上進行檢測?；純篈LT持續(xù)升高(>40 U/L)或AST持續(xù)升高(>40 U/L)，則判斷為肝功能異常[8]。

1.5 對68例患者在出院后1～2個月內(nèi)進行隨訪

患者在我院門診或病房隨訪，并且進行回訪EBV-DNA載量檢測(拷貝數(shù)>500 拷貝數(shù)/mL為陽性)。有完整隨訪患者62例，3例患者失訪，失訪率為 4.84%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 組間年齡、性別比較

低拷貝組42例，男25例，女17例，年齡1～11歲，平均(3.12±2.2)歲；高拷貝組26例，男15例，女11例，年齡1～12歲，平均(3.89±2.5)歲。兩組間性別及年齡比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.2 臨床癥狀與體征特點

68例EBV感染患兒均有發(fā)熱癥狀，其中低拷貝組的眼瞼水腫、淋巴結(jié)腫大、肝脾腫大發(fā)生率顯著低于高拷貝組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。而扁桃體腫大、皮疹以及噬血細(xì)胞綜合征在兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 兩組間患兒臨床特點

2.3 兩組患兒淋巴細(xì)胞亞群以及肝功能指標(biāo)水平比較

表1結(jié)果顯示，高拷貝組患兒的CD8+T細(xì)胞為(48.21±10.73)%高于低拷貝組的CD8+T細(xì)胞(38.1±10.04)，而 NK 細(xì)胞、CD4+T、CD4+/CD8+T細(xì)胞分別為(8.52±5.79)%、(21.37±5.78)%、(0.5±0.27)則均低于低拷貝組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。而兩組間的CD3+細(xì)胞和B細(xì)胞比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。高拷貝組的ALT和AST指標(biāo)水平均高于低載量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩組間實驗指標(biāo)的比較

2.4 回訪陽性病例的PBMC和血漿EBV DNA的檢測結(jié)果

表1結(jié)果顯示，在回訪EBV-DNA檢測中，高拷貝組15例(57.69%)高于陰性參考值，比低拷貝組的8例(21.62%)差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。在回訪EBV-DNA陽性病例的23例樣本中，PBMC EBV DNA拷貝數(shù)(4.8±0.5)高于全血EBV DNA拷貝數(shù)(2.96±0.28)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.5 預(yù)后

低拷貝組里，42例患兒治療時間為5～62 d, 平均治療時間為 (10±8.93)d并且全部治愈。而高拷貝組里，26例患兒治療時間為7～92 d, 平均治療時間為 (20.35±18.67)d。治療天數(shù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高拷貝組里有3例患兒發(fā)展為EBV-HLH(2例EBV-HLH治愈，1例轉(zhuǎn)院后治愈)，1例發(fā)展為CAEBV(轉(zhuǎn)院治療中)以及1例為淋巴相關(guān)性腫瘤(轉(zhuǎn)院失聯(lián))。

圖2 回訪陽性23患者PBMC與血漿EBV DNA拷貝數(shù)的比較***：P<0.05

3 討論

EBV感染可累及全身各組織臟器，且根據(jù)個體的免疫功能差異或缺陷，可表現(xiàn)出IM、CAEBV、EB-HLH等多種疾病癥狀。目前，分子診斷技術(shù)EBV-DNA檢測被廣泛應(yīng)用于EBV感染的臨床診斷，其靈敏度和時效性優(yōu)于血清學(xué)檢測，對早期診斷兒童EBV感染具有重要意義[9]。IM被認(rèn)為是EB病毒感染兒童時引發(fā)的一種免疫病理性疾病(immunopathological disease)，以發(fā)熱、咽峽炎和頸部淋巴結(jié)腫大為主要臨床特征。在該病病程發(fā)展中，EB病毒主要侵犯機體的B淋巴細(xì)胞，并刺激輔助 T 細(xì)胞(Th)、效應(yīng)T細(xì)胞(CD4+)、細(xì)胞毒T細(xì)胞及抑制T細(xì)胞(CD8+)的大量增殖；CD4+細(xì)胞可分泌IL-6、IL-10、TNF-β等多種細(xì)胞因子，促進B細(xì)胞和效應(yīng) T 細(xì)胞的活化，參與細(xì)胞免疫和體液免疫的調(diào)節(jié)。而CD8+細(xì)胞通過殺傷感染的B淋巴細(xì)胞和分泌抑制因子，負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能[10-11]。

多數(shù)情況下，IM病情發(fā)展是具有自限性。隨著病程變化，IM外周血中EBV-DNA載量能反映病毒感染的活動狀況。國外報道，原發(fā)IM可檢測到病毒核酸的時間段在12～22天之間，往后EBV-DNA 拷貝數(shù)趨向于閾值。本研究發(fā)現(xiàn)，高拷貝組患兒的免疫功能紊亂以及肝功能異常比低拷貝組嚴(yán)重，同時病程也大大延長；而高拷貝組患兒的淋巴細(xì)胞亞群分型中，可觀測到明顯的CD8+T 細(xì)胞數(shù)值升高和CD4+T 細(xì)胞數(shù)值減少，與以往國內(nèi)報道[12-13]一致。

EBV感染在極少數(shù)患兒可發(fā)展為EB-HLH。HLH有原發(fā)性與繼發(fā)性之分。繼發(fā)性HLH主要因感染(包括病毒、細(xì)菌、結(jié)核以及真菌等)而誘發(fā)機體產(chǎn)生自身免疫系統(tǒng)過度炎癥反應(yīng)的綜合征，這與原發(fā)性HLH的病因有明顯的區(qū)別。國內(nèi)研究報道繼發(fā)性HLH中，以EB病毒誘發(fā)的HLH最為常見[14-15]。本研究中有3例患兒為EBV-HLH，均符合其診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，并且初診EBV-DNA載量均大于105拷貝數(shù)/mL。本研究顯示，高拷貝組EBV感染后EBV-HLH的發(fā)生率為11.54%。3例患兒均有反復(fù)高熱，肝脾腫大等體征；血常規(guī)報告中均有三系血象減少，血清鐵蛋白異常升高以及凝血指標(biāo)異常；骨髓細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果均出現(xiàn)吞噬血細(xì)胞現(xiàn)象, 骨髓象呈增生活躍。以上數(shù)據(jù)提示，初診結(jié)果中高載量的EBV-DNA可預(yù)示患兒病情兇險，有出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥的可能，如噬血細(xì)胞綜合征(HLH)。

另外，EBV在感染細(xì)胞內(nèi)主要有2種存在形式：增殖性感染和潛伏性感染。而EBV DNA是EBV感染/潛伏的直接證據(jù)。目前學(xué)界認(rèn)為，PBMC的EBV-DNA載量檢測在應(yīng)用于追蹤 EB病毒感染患兒預(yù)后狀況中具有重要意義。EBV 長期潛伏于人體的淋巴系統(tǒng)里，以小的非增殖的記憶B細(xì)胞形式持續(xù)存在，呈現(xiàn)一種相對靜止的狀態(tài)；EBV-DNA作為EBV潛伏感染的基礎(chǔ)，通過部分表達(dá)病毒蛋白，于體內(nèi)形成免疫復(fù)合物，促使補體激活免疫細(xì)胞引發(fā)機體免疫效應(yīng)，進而導(dǎo)致自身免疫系統(tǒng)受損，嚴(yán)重者將發(fā)展為CAEBV、EB-HLH、EB相關(guān)的伯基特淋巴瘤和鼻咽癌等腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，PBMC的EBV-DNA陽性率和拷貝數(shù)均高于血漿的檢測結(jié)果，且該結(jié)果與治療效果密切相關(guān)[16]。因此對于高拷貝的EBV感染的病例，可考慮運用PBMC的EBV-DNA 定量檢測，動態(tài)觀察血中 EBV-DNA 載量，有利于監(jiān)測病情變化，觀察治療效果，指導(dǎo)臨床治療。