劉 爽，陳 曦，周國(guó)平

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，江蘇 南京 210029

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是兒童最常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病之一［1］，在世界范圍內(nèi)的患病率呈上升趨勢(shì)［2］。哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括免疫因素、感染因素、環(huán)境因素和遺傳因素［3］。支氣管高反應(yīng)性、間歇性氣流受限和氣道重塑是哮喘的3 大典型特征。氣道重塑是指長(zhǎng)期反復(fù)的炎癥不斷刺激，誘發(fā)氣道組織增生而出現(xiàn)反復(fù)修復(fù)，最終導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)的改變，以氣道壁增厚、上皮下纖維化、平滑肌數(shù)量增加、血管生成和黏液腺的增加為其主要特征［4］。當(dāng)前，臨床上尚無(wú)有效方法治愈哮喘。因此，重要的是探索氣道炎癥和重塑的機(jī)制，并尋求新的策略。

同源異型盒基因1（sine oculis homeobox homolog 1，Six1）是一種包含同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）起著重要作用［5-7］。Six1表達(dá)在胚胎發(fā)生后大幅度下調(diào)，但在許多癌癥中重新高表達(dá)，從而有助于腫瘤的生長(zhǎng)［8-9］。在哮喘中，Six1對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）1 介導(dǎo)的EMT、氣道炎癥及氣道重塑具有重要作用［10］。氣道炎癥和重塑是哮喘兩個(gè)最典型的病理特征，滲透到氣道的炎癥細(xì)胞通過(guò)促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移而有助于氣道重塑。

因此，研究人Six1基因?qū)ο?、腫瘤等疾病有重要的理論指導(dǎo)意義。但是目前對(duì)Six1的研究主要集中在信號(hào)通路及其與蛋白的相互作用上，對(duì)于Six1自身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建人Six1 啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告重組質(zhì)粒，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞，分析其在這2種細(xì)胞中的熒光素酶活性，接著通過(guò)qRT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定敲低、過(guò)表達(dá)E2F轉(zhuǎn)錄因子4（E2F transcription factor 4，E2F4）后Six1表達(dá)量的改變，旨在為進(jìn)一步研究人Six1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎細(xì)胞（HEK-293）、人肺支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）、pGL3-basic 質(zhì)粒、pRL-TK（海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒）為本實(shí)驗(yàn)室保存；E2F4 小干擾RNA siE2F4 及其陰性對(duì)照siNC、E2F4 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pENTER-E2F4及空載體pENTER（南京擎科生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（ThermoScientific 公司，美國(guó)）；胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)）；青鏈霉素雙抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；小量質(zhì)粒抽提試劑盒（Omega公司，美國(guó)）；DNA Marker、限制性內(nèi)切酶MIUⅠ和XhoⅠ、T4 DNA 連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa 公司，日本）；SYBR Green qPCR Master Mix（Bimake 公司，美國(guó)）。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000脂質(zhì)體（Invitrogen公司，美國(guó)）；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（Promega公司，美國(guó)）；瓊脂糖（GENE公司，西班牙）；總蛋白提取試劑盒（南京凱基生物技術(shù)股份有限公司）；E2F4、Six1、GAPDH 一抗（Proteintech 公司，美國(guó)）；SDS-PAG 凝膠、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK-293 和BEAS-2B 細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，2～3 d 傳代1 次。實(shí)驗(yàn)操作均采用對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞。

1.2.2 人Six1 啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

人Six1 基因序列（GenBank 編號(hào)：NC-000014.9）從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)中心數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）找到起始密碼子ATG 上游約351 bp 片段序列。將人Six1 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）設(shè)置為+1。將人Six1 DNA片段-351～100 nt的啟動(dòng)子插入pGL3-Basic 載體中，命名為pSix1-451。用JASPAR 軟件（http：//jaspar.genereg.net/）預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞

將HEK-293 和BEAS-2B 細(xì)胞分別接種到96 孔板中（1×104個(gè)/孔）。24 h 后，使用Lipofectamine 3000 將100 ng 啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒pSix1-451 或pGL3-Basic 與pRL-TK 質(zhì)粒（4 ng）一起共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中作為內(nèi)部對(duì)照。使用Lipofectamine 3000試劑將100 ng啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒pSix1-451 與siE2F4（50 nmol/L）或siNC（50 nmol/L）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察敲低E2F4對(duì)pSix1-451啟動(dòng)活性的影響；另外，將pSix1-451與pENTER-E2F4（100 ng）或pENTER（100 ng）進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，觀察過(guò)表達(dá)E2F4對(duì)pSix1-451啟動(dòng)活性的影響。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)啟動(dòng)子活性

棄培養(yǎng)基，用100 μL/孔磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）將96 孔板清洗2～3 遍，每孔加入30 μL 裂解液后室溫震蕩20 min，按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒步驟測(cè)定pGL3-basic、pSix1-451以及敲低和過(guò)表達(dá)E2F4后pSix1-451的啟動(dòng)子活性，并將其標(biāo)準(zhǔn)化為pRL-TK的活性。結(jié)果至少重復(fù)3次。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

使用TRIzol 試劑從細(xì)胞系中提取總RNA，然后使用PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time Kit將其反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。qRT-PCR 使用SYBR Green 技術(shù)在LightCycler480Ⅱ（羅氏公司，美國(guó)）中進(jìn)行。反應(yīng)條件為：95 ℃10 min預(yù)變性，95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。所有樣品均以β-actin 作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3 次重復(fù)分析，并使用2-ΔΔCt方法評(píng)估相對(duì)表達(dá)水平。具體引物列于表1。

表1 小干擾序列和qRT-PCR引物Table 1 Sequences of siRNAs and qRT-PCR primers

1.2.6 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

使用試劑盒從細(xì)胞系中提取總蛋白，然后加入5×上樣緩沖液并100 ℃煮沸10 min。配制10%SDSPAG凝膠，80 V預(yù)電泳后100 V恒壓分離蛋白，分離蛋白后恒流250 mA，120 min 轉(zhuǎn)至PVDF 膜，室溫下5%脫脂奶粉溶液封閉2 h 后4 ℃孵育一抗過(guò)夜，使用TBST 洗膜后室溫孵育二抗1 h，再次洗膜后加曝光液曝光顯影。使用GAPDH 作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7及SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人Six1啟動(dòng)子活性檢測(cè)

將合成的pSix1-451 片段質(zhì)粒進(jìn)行核酸序列測(cè)定，結(jié)果提示此片段核苷酸序列與人Six1基因啟動(dòng)子區(qū)序列一致，說(shuō)明人Six1基因啟動(dòng)子區(qū)已經(jīng)成功插入pGL3-basic載體中。如圖1所示，與pGL3-basic組相比，轉(zhuǎn)染pSix1-451片段質(zhì)粒的HEK-293和BEAS-2B 細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。結(jié)果表明，人Six1 啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK-293 和BEAS-2B細(xì)胞后具有啟動(dòng)子活性。

圖1 熒光素酶報(bào)告基因分析HEK-293和BEAS-2B細(xì)胞中人Six1啟動(dòng)子活性Figure 1 Human Six1 promoter activity in HEK-293 and BEAS-2B cells analyzed by luciferase reporter system

2.2 人Six1啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

根據(jù)上述人pSix1-451 片段質(zhì)粒的熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果分析，提示-351～+100 nt 區(qū)域內(nèi)可能存在明顯影響人Six1 啟動(dòng)子活性的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，應(yīng)用JASPAR對(duì)該區(qū)域進(jìn)行分析，獲得可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。如圖2 所示，預(yù)測(cè)結(jié)果提示該序列范圍內(nèi)可能存在E2F4等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

圖2 運(yùn)用JASPAR網(wǎng)站預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)Figure 2 Predication of binding sites of transcriptional factors by JASPAR

2.3 轉(zhuǎn)錄因子E2F4對(duì)Six1啟動(dòng)子水平的調(diào)控

為了確定E2F4能否直接調(diào)節(jié)人Six1的轉(zhuǎn)錄，我們?cè)贖EK-293 和BEAS-2B 細(xì)胞中分別敲低和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子E2F4。如圖3所示，與siNC處理的對(duì)照組相比，用siE2F4處理的HEK-293和BEAS-2B細(xì)胞中，pSix1-451 片段質(zhì)粒熒光素酶的活性明顯降低（P＜0.001，P＜0.01）；而與用空載體pENTER 處理的對(duì)照組相比，用pE2F4 處理的HEK-293 和BEAS-2B細(xì)胞中，pSix1-451片段質(zhì)粒熒光素酶的活性明顯升高（P＜0.05，P＜0.05）。

圖3 轉(zhuǎn)錄因子E2F4在啟動(dòng)子水平調(diào)控HEK-293和BEAS-2B細(xì)胞人Six1基因Figure 3 The transcription factor E2F4 regulates the human Six1 gene at the promoter level in HEK-293 and BEAS-2B cells

2.4 轉(zhuǎn)錄因子E2F4對(duì)Six1 mRNA水平的調(diào)控

為進(jìn)一步探究E2F4對(duì)人Six1的調(diào)控作用，通過(guò)qRT-PCR 測(cè)量了HEK-293 和BEAS-2B 細(xì)胞中E2F4和Six1 的mRNA 水平，以確定E2F4 是否影響Six1 mRNA 的表達(dá)。與siNC 處理的對(duì)照組相比，siE2F4處理的HEK-293和BEAS-2B細(xì)胞中，內(nèi)源性Six1的mRNA 水平明顯降低（P＜0.01，P＜0.001，圖4）。同時(shí)，與pENTER 處理的對(duì)照組相比，pE2F4 處理的HEK-293 和BEAS-2B 細(xì)胞中，內(nèi)源性Six1 的mRNA水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.001，圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)錄因子E2F4在mRNA水平調(diào)控HEK-293和BEAS-2B細(xì)胞人Six1基因表達(dá)Figure 4 The transcription factor E2F4 regulates the human Six1 gene at the mRNA level in HEK-293 and BEAS-2B cells

2.5 轉(zhuǎn)錄因子E2F4對(duì)Six1蛋白水平的調(diào)控

通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)HEK-293 和BEAS-2B細(xì)胞中敲低和過(guò)表達(dá)E2F4后E2F4和Six1的蛋白水平，以確定E2F4是否影響Six1蛋白水平的表達(dá)。如圖5 所示，與siNC 處理的對(duì)照組相比，siE2F4處理的細(xì)胞中內(nèi)源性Six1的蛋白水平明顯降低（P＜0.01）。同時(shí)，與pENTER 處理的對(duì)照組相比，pE2F4 處理的細(xì)胞中內(nèi)源性Six1 的蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。

圖5 轉(zhuǎn)錄因子E2F4在蛋白水平調(diào)控HEK-293和BEAS-2B細(xì)胞人Six1基因表達(dá)Figure 5 The transcription factor E2F4 regulates the human Six1 gene at the protein level in HEK-293 and BEAS-2B cells

3 討論

真核生物在其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是真核生物調(diào)控基因表達(dá)非常重要的機(jī)制。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始部位一些特殊的調(diào)控序列，如啟動(dòng)子和作用于啟動(dòng)子區(qū)的一些轉(zhuǎn)錄因子。啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄的起始，指導(dǎo)著RNA聚合酶Ⅱ?qū)?dòng)的調(diào)控，對(duì)基因的正確轉(zhuǎn)錄起著關(guān)鍵作用，是蛋白質(zhì)編碼基因以及真核生物中許多非編碼基因表達(dá)的重要組成部分，但也是真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控中最容易被忽視的一部分［11］。對(duì)人Six1 基因的研究多集中在其蛋白水平的研究，但對(duì)其啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控卻很少有研究。本研究通過(guò)構(gòu)建人Six1 啟動(dòng)子熒光素酶基因報(bào)告重組質(zhì)粒pSix1-451，并通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性檢測(cè)，證實(shí)其具有啟動(dòng)子活性。然后通過(guò)JASPAR 軟件預(yù)測(cè)其可能含有E2F4 在內(nèi)的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并在啟動(dòng)子、mRNA和蛋白多水平驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄因子E2F4 對(duì)人Six1 基因轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控。

Six家族是一組進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄因子，存在于從扁蟲(chóng)到人類的多種生物中，在視網(wǎng)膜、耳、鼻、大腦、腎臟、肌肉和性腺中的細(xì)胞群體表達(dá)，并在其中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。Six1 基因是Six 基因家族中重要的一員，參與了許多組織和器官的發(fā)育，如肌肉、腎臟、聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)、感覺(jué)器官和顱面結(jié)構(gòu)［12］，并在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、伯基特淋巴瘤、肝細(xì)胞癌、卵巢癌和橫紋肌肉瘤等［13］。有研究表明，Six1 的下調(diào)直接影響氣道重塑重要介質(zhì)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2和MMP-9 的表達(dá)和分泌。此外，沉默Six1 可以顯著抑制肺中核因子κB（NF-κB）途徑的激活。在慢性哮喘小鼠中炎癥細(xì)胞（包括嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞）比在PBS處理的對(duì)照小鼠中的表達(dá)量更高，而敲低Six1顯著減少了炎癥細(xì)胞的積累，從而有效抑制了哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道重塑［14］。Six1 是由非造血細(xì)胞（如間充質(zhì)系細(xì)胞）通過(guò)TGF-β、白介素（interleukin，IL）-1β、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IL-6和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激產(chǎn)生的。這些間充質(zhì)細(xì)胞通過(guò)釋放Six1作用于免疫細(xì)胞，促使其分泌促炎性細(xì)胞因子和趨化因子［15］。Six1影響靶細(xì)胞信號(hào)事件的機(jī)制一直是研究的重點(diǎn)，研究確定了至少5 個(gè)潛在的Six1 信號(hào)途徑，包括抑制磷酸化的Smad 1、3、8 信號(hào)通路、AKT 途徑、AMP 激活的蛋白激酶途徑、TLR4/CD14 途徑以及對(duì)Na+/K+-ATP 酶膜電位方面的影響［16-17］。因此，調(diào)控Six1自身的表達(dá)也可以通過(guò)調(diào)控有關(guān)蛋白以及各種信號(hào)通路直接或間接起作用，并為后續(xù)進(jìn)一步的研究提供了方向。

轉(zhuǎn)錄因子是一類可以和基因上游啟動(dòng)子區(qū)序列結(jié)合從而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)。E2F轉(zhuǎn)錄家族在高級(jí)真核生物中編碼一系列轉(zhuǎn)錄因子，并且在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期和DNA 合成中起著重要調(diào)控作用。目前根據(jù)其功能特征分為兩類：即轉(zhuǎn)錄激活因子，包括E2F1、E2F2和E2F3a，以及轉(zhuǎn)錄阻遏因子包 括E2F3b、E2F4、E2F5、E2F6、E2F7 和E2F8［18］。E2F4作為E2F轉(zhuǎn)錄家族的一員，已被證實(shí)和子宮頸癌、Burkitt淋巴瘤等多種疾病相關(guān)［19］，并且在細(xì)胞增殖、周期、凋亡和侵襲中發(fā)揮重要作用［20］。研究表明E2F4 的沉默減少了人類腸道上皮細(xì)胞和結(jié)直腸癌CRC細(xì)胞的增殖［21］，但其在哮喘中的作用卻很少有研究。

本研究首先成功構(gòu)建了人Six1 啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告重組質(zhì)粒，測(cè)定其具有啟動(dòng)子活性。其次通過(guò)軟件預(yù)測(cè)其啟動(dòng)子區(qū)可能含有的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列。最后，在啟動(dòng)子、mRNA和蛋白水平驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄因子E2F4對(duì)人Six1的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控。