左清平 張順芝 何鴿飛 劉曉慧 袁 立

(湖南省長沙市第一醫(yī)院藥劑科，長沙市 410000，電子郵箱:aahyxaa@163.com)

肺癌又稱為原發(fā)性支氣管肺癌，根據(jù)病理分級可分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩大類[1]。肺癌發(fā)病機(jī)制所涉及的生物學(xué)過程較為復(fù)雜，惡性程度高，易復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，近年來肺癌的發(fā)病率明顯上升，其死亡率在惡性腫瘤死因中位居第一位[2]，但目前臨床上尚無肺癌的特異性治療方法，晚期肺癌患者的病情難以控制，復(fù)發(fā)率高，患者5年生存率低于14.5%[3]。研究表明，肺癌本質(zhì)上是一種多基因疾病，其發(fā)病機(jī)制受多個基因的共同調(diào)節(jié)，疾病的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸機(jī)制復(fù)雜[4]。因此，從肺癌的發(fā)病機(jī)制出發(fā)尋找新的治療途徑，做到早期診斷與早期治療是目前肺癌治療的重點(diǎn)[5]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼RNA序列，可在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[6]，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、癌變等多種生物學(xué)過程，miRNA的異常表達(dá)與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。miRNA-34a被證明在多種腫瘤疾病中呈低表達(dá)，并具有抑癌作用。研究顯示，miRNA-34a在肺癌患者血清中低表達(dá)，并與患者預(yù)后直接相關(guān)[9]。但miRNA-34a是否可以抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和增殖，是否可作為肺癌的早期診斷和預(yù)后評估指標(biāo)，目前尚未完全清楚。本研究旨在探討miRNA-34a對肺癌細(xì)胞增殖與遷移的影響，并分析其可能的分子作用機(jī)制，為肺癌的防治和預(yù)后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 人肺癌細(xì)胞株A549(批號：XTK20181215S)、H1299(批號：HKT20190111)、PC9(批號：FGF20190104)及人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B細(xì)胞(批號：FDG20190212)均購自美國菌種保藏中心。

1.2 主要試劑與設(shè)備 PCR試劑盒(批號：120111157ST)，RNA提取試劑盒(批號：151411158TR)均購自日本TaKaRa公司；澳洲胎牛血清(批號：TH2019514S)購自鼎國公司，RPMI 1640培養(yǎng)基(批號：TH2019042B)購自Gibco公司；Opti-MEM培養(yǎng)基(批號：GH2019043G)購自Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000(批號：JT20190108)購自Invitrogen公司；MTT試劑盒(批號：20190318)購自日本TaKaRa公司；熒光素酶檢測試劑(批號：H20190224)購自Promega北京生物技術(shù)有限公司；miRNA-34a模擬物(批號：20181227)和陰性對照(批號：20181227)購自上海吉瑪生物科技有限公司；miRNA-34a模擬物序列為：UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU。目標(biāo)基因探針和內(nèi)參基因探針的5′ 端均采用 FAM 報告熒光標(biāo)記，3′ 端均采用TAMRA淬滅熒光標(biāo)記；Transwell小室(批號：S5478RTA)購自美國Millipore 公司；信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription,STAT3) 兔單克隆抗體(批號：GT20181114)購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(批號：20181217)購自北京中杉金橋公司；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS，批號：20190425)，0.25%胰蛋白酶(批號：20190502)均購自四季青生物有限公司；TRIzol試劑購自日本TaKaRa公司(批號：14111164ER)；二甲基亞砜購自阿拉丁試劑有限公司(批號：2019S0124)；總蛋白提取試劑盒購自碧云天生物有限公司(批號：20180928)；聚偏二氟乙烯膜于甲醇溶液購自北京生物技術(shù)有限公司(批號：20180830)；三羥甲基氨基甲烷緩沖液(T-TBS)購自碧云天生物有限公司(批號：20190221)。病理圖像分析儀(型號：OLYMPUSDP71)購自奧林巴斯映像銷售有限公司，凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司，恒溫水浴箱購自上海亞榮生物儀器廠，熒光定量PCR儀(型號：IQ5)購自美國Bio-Rad公司，5804R型高速臺式冷凍離心機(jī)購自艾本德中國有限公司，722S型紫外分光光度計購自上海精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：取A549、H1299、PC9、BEAS-2B細(xì)胞，分別復(fù)蘇后，觀察細(xì)胞培養(yǎng)液顏色，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞密度。輕輕倒出瓶內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)基，用移液槍吸取2 mL PBS，打入瓶底，將培養(yǎng)瓶來回輕晃幾次，使PBS與細(xì)胞充分接觸清洗細(xì)胞，重復(fù)兩次，棄去培養(yǎng)瓶內(nèi)的PBS，加入RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清及雙抗)5 mL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上時，棄去培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液，加入PBS 2 mL，按上述方法清洗細(xì)胞兩次后，棄去培養(yǎng)瓶內(nèi)PBS，滴入0.25%胰蛋白酶(不含乙二胺四乙酸)1 mL消化細(xì)胞，按1 ∶3進(jìn)行分瓶傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.2 實時定量PCR方法：分別取上述對數(shù)生長期的實驗用細(xì)胞，加入TRIzol試劑1 mL，吹打數(shù)次，靜置5 min。按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，采用分光光度計檢測其純度與濃度，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實時熒光定量PCR法檢測人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299、PC9及人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B中miRNA-34a的表達(dá)情況，反應(yīng)體系為20 μL(2×SYBR 10 μL+RNA Free Water 8.2 μL+Primer F 0.4 μL+Primer R 0.4 μL+Cdna 1 μL)，反應(yīng)條件：94℃～98℃ 30 s，60℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)，72℃延伸8 min，各設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次，以U6為內(nèi)參基因，目的基因及內(nèi)參基因的引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算miRNA-34a的表達(dá)量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：(1)將miRNA-34a模擬物用Opti-MEM培養(yǎng)基配置成 20 μmol/L母液，放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。取對?shù)生長期的A549細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶(不含乙二胺四乙酸)消化，重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個/mL，接種于6孔板中，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿瓶底80%左右時，采用0.25%胰蛋白酶消化后吸出至12孔板培養(yǎng)基中。(2)配置FAM標(biāo)記和未標(biāo)記的miRNA 模擬物轉(zhuǎn)染液：取5 mL EP管，分別加入Opti-MEM培養(yǎng)基10 μL，然后加入20 μmol/L的miRNA模擬物母液5 μL，輕輕混勻，室溫下孵育5 min，加入Lipofectamine 3000 10 μL，輕輕混勻，室溫下孵育15 min，最后加入Opti-MEM 990 μL，使miRNA模擬物終濃度為100 nmol/L，將配置好的FAM標(biāo)記的miRNA-34a 模擬物(100 nmol/L)和FAM未標(biāo)記的miRNA-34a 模擬物(100 nmol/L)轉(zhuǎn)染液加入12孔板中，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染8 h后去除轉(zhuǎn)染液，加入Opti-MEM培養(yǎng)基1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染后發(fā)綠色熒光為轉(zhuǎn)染成功。本研究中，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上。

1.3.4 MTT法檢測miRNA-34a對肺癌細(xì)胞增殖的影響：取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于96孔板中，密度為2×105個/mL，分為miRNA-34a模擬物組、陰性對照組和空白對照組，其中miRNA-34a模擬物組、陰性對照組進(jìn)一步分為200 nmol/L、100 nmol/L、50 nmol/L組。除空白對照組外，其余各組均按上述miRNA-34a模擬物瞬時轉(zhuǎn)染步驟對細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染(miRNA-34a模擬物各亞組分別加入不同濃度miRNA-34a模擬物，陰性對照組加入不同濃度的miRNA模擬物序列)，轉(zhuǎn)染24 h及48 h后吸去培養(yǎng)基。每孔加入20 μL新鮮配制的含0.2 mg/mL MTT的PBS溶液，37℃繼續(xù)孵育4 h。吸去PBS，并加入二甲基亞砜150 μL，用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以試驗波長為570 nm，參比波長為450 nm測定光密度值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(B-A)/B×100%]，其中，A為實驗藥物組光密度值，B為空白對照組光密度值。

1.3.5 雙熒光素酶報告：采用預(yù)測軟件Targetscan(http://www.targetscan.org)和miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)進(jìn)行miRNA-34a作用靶基因預(yù)測。結(jié)果顯示，STAT3可能為miRNA-34a的下游靶基因。構(gòu)建STAT3野生型(STAT3WT-Luc)與突變型(STAT3MUT-Luc)熒光素酶報告基因質(zhì)粒，將STAT3WT-Luc、STAT3MUT-Luc分別與200 nmol/L miRNA-34a模擬物和200 nmol/L陰性對照(miRNA模擬物隨機(jī)序列)同時轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞內(nèi)(轉(zhuǎn)染方法同1.3.3中的miRNA-34a模擬物瞬時轉(zhuǎn)染步驟)。轉(zhuǎn)染48 h后獲取細(xì)胞，檢測各組的螢火蟲熒光素酶(Firefly)的活性。

1.3.6 蛋白免疫印跡法檢測STAT3蛋白的表達(dá)情況：取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，密度為2×105個/mL，分為miRNA-34a模擬物組、陰性對照組、空白對照組，陰性對照組采用miRNA模擬物隨機(jī)序列(200 nmol/L)轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，miRNA-34a模擬物組采用miRNA-34a模擬物(200 nmol/L)轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，采用總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量測定。制作10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠，置于電泳槽，每孔加入20 μL的蛋白樣品，以110 V恒壓電泳70 min分離蛋白。聚偏二氟乙烯膜于甲醇溶液中浸泡20 s，放入轉(zhuǎn)移緩沖液平衡，以110 V恒壓將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二佛乙烯膜。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將膜放入T-TBS(含5% 脫脂奶粉)中，于37℃條件下封閉1 h，然后采用T-TBS漂洗3次，10 min/次；4℃孵育一抗(目的蛋白稀釋度為1 ∶100，β-actin稀釋濃度為1 ∶2 000，孵育液含3%脫脂奶粉)24 h；采用T-TBS漂洗3次，5 min/次；37℃孵育二抗(稀釋濃度為1 ∶2 000，孵育液含2%脫脂奶粉)1 h，用T-TBS漂洗5次，5 min/次；制備約1 mL電化學(xué)發(fā)光工作液，室溫孵育轉(zhuǎn)印膜1 min，保鮮膜密封，暗盒中放入X線片光曝光5～10 min后進(jìn)行顯影和定影，采用Image J軟件統(tǒng)計灰度值，以β-actin為對照，計算STAT3蛋白的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用成組設(shè)計t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-34a在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況 相對于BEAS-2B細(xì)胞，A549、H1299、PC9細(xì)胞系中miRNA-34a的表達(dá)量均下降(均P<0.05)，見表2。

表2 A549、H1299、PC9 和BEAS-2B細(xì)胞系中miRNA-34a的表達(dá)情況(x±s)

2.2 miRNA-34a對A549細(xì)胞增殖的抑制作用 200 nmol/L、100 nmol/L的miRNA-34a模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h、48 h后，其對A549細(xì)胞的增殖抑制率均高于相同劑量的陰性對照組和空白對照組(均P<0.05)，其中轉(zhuǎn)染200 nmol/L miRNA-34a模擬物48 h后，抑制率可達(dá)(47.32±7.32)%。見表3和圖1。

表3 miRNA-34a 模擬物對A549細(xì)胞增殖的抑制作用(x±s)

圖1 轉(zhuǎn)染48 h后A549細(xì)胞增殖情況(×100)

2.3 雙熒光素酶報告分析結(jié)果 相比于陰性對照組，野生型STAT3WT-Luc和miRNA-34a模擬物共轉(zhuǎn)染明顯降低STAT3的3′UTR區(qū)熒光酶活性(P<0.05)，而突變型STAT3MUT-Luc和miRNA-34a模擬物對STAT3的3′UTR區(qū)熒光酶活性無影響，見表4。

表4 雙熒光素酶活性檢測(x±s)

2.4 miRNA-34a對A549細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)的影響 蛋白免疫印跡試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后，miRNA-34a模擬物組STAT3蛋白表達(dá)水平低于陰性對照組和空白對照組(均P<0.05)，而陰性對照組與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5和圖2。

表5 3組細(xì)胞的STAT3蛋白表達(dá)水平的比較(x±s)

圖2 3組細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)水平

3 討 論

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，每年約有150萬人死于肺癌[10]。肺癌的發(fā)生受多種因素影響，發(fā)病機(jī)制至今尚未被完全闡明。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，人們已經(jīng)認(rèn)識到腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，該過程涉及多基因、多因素的共同作用[11]。近年來，肺癌的基因治療逐漸成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。

miRNA 通過與其靶基因mRNA的3′UTR區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)[12]。研究證實，在肺癌中存在多種 miRNA異常表達(dá)，miRNA在肺癌生長侵襲過程可能主導(dǎo)調(diào)控作用，如在人肺癌細(xì)胞中，miRNA-15通過調(diào)控相關(guān)靶基因及下游信號通路，抑制肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲，使肺癌患者的血清miRNA-155呈低表達(dá)[13]。李元濱等[14]對肺癌組織與正常肺組織進(jìn)行miRNA表達(dá)譜差異研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)38種差異表達(dá)的miRNA，如miRNA-21、miRNA-191、miRNA-17-5p及miRNA-155等。Sun等[15]利用miRNA基因芯片技術(shù)對正常肺組織、非轉(zhuǎn)移性小細(xì)胞肺癌組織和轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌組織進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中存在miRNA-18b-5p、miRNA-643、miRNA-150、miRNA-3940-5p表達(dá)，且這些差異表達(dá)的miRNA與患者預(yù)后存在一定聯(lián)系。

miRNA-34a家族作為與腫瘤相關(guān)的眾多miRNA家族中的重要一員，其在惡性腫瘤中的表達(dá)及調(diào)控作用受到了研究者的關(guān)注[16]。miRNA-34a編碼基因位于1p36.22，該區(qū)域在多種惡性腫瘤中缺失或在啟動子區(qū)存在高度的甲基化，導(dǎo)致miRNA-34a的表達(dá)異常[17]。熒光素酶報告基因分析結(jié)果顯示，miRNA-34a的編碼基因存在腫瘤抑制蛋白p53的結(jié)合位點(diǎn)，p53可促進(jìn)miRNA-34a的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[18]。將miRNA-34a轉(zhuǎn)染神經(jīng)瘤細(xì)胞質(zhì)，腫瘤細(xì)胞凋亡增加，腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲受到抑制[19]。miRNA-34a的作用機(jī)制具有多樣性，并可能依賴于細(xì)胞周期，比如外源性miRNA-34a轉(zhuǎn)染H1299肺癌細(xì)胞，可誘導(dǎo)細(xì)胞M期阻滯，而將其轉(zhuǎn)染于U-2OS骨肉瘤細(xì)胞則僅引起細(xì)胞的G1期停滯[20]。此外，有研究顯示，肺癌細(xì)胞中miRNA-34a的表達(dá)量較低，其表達(dá)水平與肺癌細(xì)胞增殖速度、存活能力呈負(fù)相關(guān)[21]。 Fu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細(xì)胞中miRNA-34a呈低表達(dá)，而在卵巢癌細(xì)胞中使miRNA-34a過表達(dá)則可抑制腫瘤血管生成，其作用靶點(diǎn)可能為人表皮生長因子受體2和人表皮生長因子受體3。

本研究結(jié)果顯示，在肺癌細(xì)胞系中，miRNA-34a均呈低表達(dá)，轉(zhuǎn)染miRNA-34a 模擬物后，A549細(xì)胞的增殖受到抑制。STAT3蛋白是細(xì)胞內(nèi)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，是多個細(xì)胞增殖、癌變、凋亡信號通路匯聚的交點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)STAT3持續(xù)性過度激活與過表達(dá)[23]。本研究利用TargetScan、miRanda等預(yù)測軟件對miRNA-34a的靶基因進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，STAT3可能為miRNA-34a的下游作用靶點(diǎn)。進(jìn)一步行雙熒光素酶標(biāo)記，結(jié)果證明STAT3為miRNA-34a的直接作用靶點(diǎn)。進(jìn)一步的蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-34a模擬物后，A549細(xì)胞STAT3蛋白相對表達(dá)水平低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)，表明miRNA-34a能夠降低A549細(xì)胞中的STAT3蛋白表達(dá)水平，從而抑制STAT3下游信號通路的激活，進(jìn)而抑制A549細(xì)胞的增殖。

綜上所述，肺癌細(xì)胞miRNA-34a呈低表達(dá)水平，上調(diào)miRNA-34a的表達(dá)水平，可抑制肺癌細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與miRNA-34a抑制STAT3下游信號通路的激活有關(guān)。