黃榮，樊明湖，黃芬，盧小菊，李新建

結(jié)直腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在癌癥中排名第三，但死亡率排名第二。在結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展中，多個種系和體細(xì)胞突變不斷積累，特別是一些關(guān)鍵的致癌基因和腫瘤抑制基因。隨著對結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制認(rèn)識的深入，分子靶向藥物和免疫療法等新的治療策略被開發(fā)出來，極大改善了結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。然而，結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制復(fù)雜，涉及許多過程。因此，進(jìn)一步揭示其潛在的分子機(jī)制，開發(fā)更有效的治療干預(yù)措施有助于提高患者預(yù)后。越來越多的證據(jù)表明，遺傳和表觀遺傳失調(diào)在腫瘤的產(chǎn)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。日前，非編碼RNA 的生物學(xué)功能被廣泛研究，包括微RNA（microRNA，miRNA/miR）和長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1（bladder cancer associated transcript 1，BLACAT1）在肝癌、乳腺癌、骨肉瘤中表達(dá)上調(diào)，能促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而BLACAT1的下調(diào)抑制癌細(xì)胞的體外增殖、侵襲和移植瘤的體內(nèi)生長。miR-503-5p 可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，并調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移或耐藥。然而 BLACAT1 和 miR-503-5p 在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能仍不清楚。本研究自2019年1-10 月考察BLACAT1 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，及對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并結(jié)合miR-503-5p，探討結(jié)直腸癌潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞株NCM460 和結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620，LOVO，HT29 購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，RPMI-1640 培養(yǎng)基（Roswell Park Memorial Institute）購自美國Gibco公司，胎牛血清、青霉素-鏈霉素購自美國Hyclone公司，PrimeScript?RT試劑盒購自大連Takara公司，RIPA裂解緩沖液、噻唑藍(lán)（MTT）購自美國Sigma 公司，si-con、si- BLACAT1、miR-con、miR-503-5p、anti-miR-con、anti-miR-503-5p 購自上海 GenePharma公司，β 肌動蛋白（β-actin）、細(xì)胞核相關(guān)抗原67（Ki-67）、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、活化的多聚ADP-核糖聚合酶（Cleaved PARP）和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved caspase-3）抗體購自美國Cellular Signaling Technology 公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自英國Abcam 公司，雙重?zé)晒馑孛笀蟾婊驕y定系統(tǒng)購自美國Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

NCM460、SW620、LOVO和HT29細(xì)胞在RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所有培養(yǎng)基均補(bǔ)充10%的胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素，于37℃、5%二氧化碳的濕潤環(huán)境中生長。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR（qRT

-

PCR）檢測結(jié)直腸癌細(xì) 胞 中

BLACAT1 和

miR

-

503

-

5p 表 達(dá)

利 用TRIzol 試劑從 NCM460、SW620、LOVO 和 HT29 細(xì)胞提取總RNA。使用PrimeScript?RT試劑盒將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，并通過 ABI 7500 定量 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。用2法計算相對基因表達(dá)，選擇GAPDH 和 U6 作 為 內(nèi) 參 。 引 物 序 列 ：BLACAT1 5-CAAGAGGAGCCGGCTTAGCATCTA-3（正 向），5-ACGGTTCCAGTCCTCAGTCAG-3（反 向）。 內(nèi) 參GAPDH 5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3（正向），5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3（反 向）。 miR-503-5p 5-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3（正向），5-GTAATACGGTTATCCACGCG-3（反向）。內(nèi)參U6 5-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3（正向），5-GGAACGCTTCACGAATTTG-3（反向）。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將HT29 細(xì)胞接種于6 孔板中（每孔2×10個細(xì)胞），待細(xì)胞融合至80%左右時，利用Lipofectamine 2000 試 劑 ，將 si-con、si- BLACAT1、pcDNA、pcDNA-BLACAT1、miR-con、miR-503-5p、anti-miR-con、anti-miR-503-5p 轉(zhuǎn)染到 HT29 細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞，依照1.3 所述方法檢測BLACAT1和miR-503-5p表達(dá)，并進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測。

1.5 MTT 檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖

將HT29 細(xì)胞接種于 96 孔板，培養(yǎng) 48 h 后，加入 20 μL 的 MTT 溶液，培養(yǎng)4 h 后加入150 μL 二甲基亞砜，劇烈震蕩10 min，讀取酶標(biāo)儀490 nm 波長處的吸光度（OD）值，計算細(xì)胞存活率（%）。胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡

根據(jù)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶（AnnexinⅤ-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書的步驟，將HT29 細(xì)胞密度調(diào)整為 1×10個/毫升，加入 5 μL 的Annexin V-FITC和5 μL的PI染色液，分別混勻，黑暗反應(yīng)15 min，于流式細(xì)胞儀檢測HT29細(xì)胞的凋亡。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞Ki

-

67、CyclinD1、Cleaved PARP 和

Cleaved caspase

-

3 的表達(dá)

用RIPA 裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白。將樣品在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）凝膠中分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。隨后在4 ℃條件下與Ki-67、CyclinD1、Cleaved PARP、Cleaved caspase-3 和內(nèi)參照β-actin 的一抗（稀釋比為1∶1 000）孵育過夜。第二天，將膜與二抗（稀釋比為1∶2 000）在室溫孵育1 h。使用ECL檢測系統(tǒng)檢測目的蛋白的信號。

1.8 靶基因預(yù)測和雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)

starbase預(yù)測BLACAT1 的靶基因，發(fā)現(xiàn)BLACAT1 與miR-503-5p存在互補(bǔ)配對位點(diǎn)。構(gòu)建包含miR-503-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型BLACAT1（WT-BLACAT1）和突變型BLACAT1（MUT-BLACAT1）的 pmirGLO 熒光素酶基因報告質(zhì)粒，利用Lipofectamine 2000試劑，將其與miR-con、miR-503-5p共轉(zhuǎn)染，48 h后參照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書的步驟，進(jìn)行熒光素酶活性測定。

2 結(jié)果

2.1 BLACAT1 和miR

-

503

-

5p 在結(jié)直腸癌細(xì)胞和人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR 檢測數(shù)據(jù)表明，與人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460比較，結(jié)腸癌細(xì)胞 SW620、LOVO 和 HT29 中 BLACAT1 表達(dá)量明顯增加，miR-503-5p 表達(dá)量減少（

P

＜0.05），見表1。選擇差異最的HT29細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，結(jié)直腸癌細(xì)胞中BLACAT1和miR-503-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，

r

=0.3114。

表1 結(jié)直腸癌細(xì)胞和人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞中BLACAT1和miR-503-5p的表達(dá)/

2.2 沉默或過表達(dá)BLACAT1 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡

與si-con 組比較，沉默 BLACAT1 明顯減少 HT29 細(xì)胞中 BLACAT1 表達(dá)量、Ki-67、CyclinD1 蛋白表達(dá)量和細(xì)胞存活率，增加Cleaved PARP、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率（

P

＜0.05）。與pcDNA組比較，過表達(dá)BLACAT1 明顯提高 HT29 細(xì)胞中 BLACAT1 表達(dá)量、Ki-67、CyclinD1 蛋白表達(dá)量和細(xì)胞存活率，降低Cleaved PARP、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率（

P

＜0.05），見表2。

表2 沉默BLACAT1對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響/（，n=3）

BLACAT1 為膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物 1，Cyclin D1 為細(xì)胞周期蛋白D1，Cleaved PARP 為活化的多聚ADP-核糖聚合酶，Cleaved caspase-3 為活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3。

2.3 BLACAT1 靶 向

miR

-

503

-

5p 調(diào) 控 其 表 達(dá)

starbase 預(yù)測到BLACAT1與miR-503-5p部分堿基可形成互補(bǔ)配對現(xiàn)象（圖1）。相比于miR-con 和WTBLACAT1共轉(zhuǎn)染，miR-503-5p和WT-BLACAT1共轉(zhuǎn)染明顯降低細(xì)胞的熒光素酶活性相對活性（

P

＜0.05），miR-con、miR-503-5p 和 MUT-BLACAT1 共轉(zhuǎn)染對熒光素酶活性相對活性無影響（表3）。qRTPCR 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染si-BLACAT1 較轉(zhuǎn)染si-con明顯增加miR-503-5p 表達(dá)量；轉(zhuǎn)染pcDNA-BLACAT1 比轉(zhuǎn)染 pcDNA 減少 miR-503-5p 表達(dá)量（

P

＜0.05），見表4。

表3 miR-con、miR-503-5p和BLACAT1共轉(zhuǎn)染對熒光素酶活性相對活性的影響/

表4 BLACAT1 調(diào)控miR-503-5p的表達(dá)/

圖1 BLACAT1與miR-503-5p存在互補(bǔ)配對位點(diǎn)

2.4 miR

-

503

-

5p 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡

與miR-con 組比較，轉(zhuǎn)染miR-503-5p 明顯提高HT29 細(xì)胞的miR-503-5p 表達(dá)量、Cleaved PARP、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率，降低 Ki-67、CyclinD1 和細(xì)胞存活率（

P

＜0.05），見表5。

表5 轉(zhuǎn)染miR-503-5p對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響/（，n=3）

2.5 干擾miR

-

503

-

5p 部分逆轉(zhuǎn)沉默BLACAT1 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的作用

與si-BLACAT1 和anti-miR-con 共轉(zhuǎn)染比較，si- BLACAT1 和anti-miR-503-5p 共轉(zhuǎn)染明顯減少HT29 細(xì) 胞 的 miR-503-5p 表 達(dá) 量 、Cleaved PARP、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率，增加Ki-67、CyclinD1 蛋白表達(dá)量和細(xì)胞存活率（

P

＜0.05），見表6。

表6 干擾miR-503-5p對沉默BLACAT1誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響/（，n=3）

3 討論

在結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中，細(xì)胞存活與凋亡至關(guān)重要。最近，已經(jīng)鑒定出許多非編碼轉(zhuǎn)錄本，這些非編碼轉(zhuǎn)錄本多數(shù)與癌癥機(jī)制聯(lián)系緊密，為癌癥的診斷和治療提供了新的機(jī)會。這項(xiàng)研究探討了lncRNA BLACAT1在結(jié)直腸癌的表達(dá)和作用，BLACAT1可能是結(jié)直腸癌的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

lncRNA 長度超過200 個核苷酸，參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展的各個階段，包括腫瘤的發(fā)生、增殖、凋亡和癌細(xì)胞的遷移、血管生成、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移形成，可作為結(jié)直腸癌等癌癥的有潛力的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。既往研究表明，BLACAT1 在肝癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌等多種癌癥中的表達(dá)異常上調(diào)，可用作診斷癌癥的非特異性生物標(biāo)志物，并且可以作為預(yù)測子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。BLACAT1 在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，并通過海綿miR-144 促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖，遷移和侵襲，其下調(diào)抑制了癌細(xì)胞進(jìn)展，遷移、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。BLACAT1 在膠質(zhì)瘤、宮頸癌的組織和細(xì)胞系中均高表達(dá)，BLACAT1 在體外可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，敲除 BLACAT1 則抑制了宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。這些結(jié)果提示了BLACAT1 在癌癥中的致癌潛能。本研究觀察到，與人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460 比較，結(jié)直腸癌細(xì)胞 SW620、LOVO 和 HT29 中 BLACAT1 表達(dá)量明顯增加。功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默BLACAT1明顯減少HT29 細(xì)胞的細(xì)胞存活率、Ki-67、CyclinD1 蛋白表達(dá)量，提高細(xì)胞凋亡率、Cleaved PARP 和Cleaved caspase-3 蛋白水平，過表達(dá)BLACAT1 與之相反。表明與前述報道相同，結(jié)直腸癌的BLACAT1表達(dá)明顯上調(diào)，沉默BLACAT1 可以抑制細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，顯現(xiàn)出一定的抗癌活性。

miRNA 是另一個類重要的非編碼RNA，長度為21-25 個核苷酸。miRNA 通過與互補(bǔ)位點(diǎn)的mRNA結(jié)合，誘導(dǎo)靶mRNA 降解和/或翻譯抑制，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miRNA 總是在腫瘤發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化中異常調(diào)節(jié)，與lncRNA 一起成為癌癥發(fā)病機(jī)制的一部分。就結(jié)直腸癌細(xì)胞而言，已證實(shí)某些改變的miRNA 可控制增殖，轉(zhuǎn)移，凋亡。在 miRNA 中，miR-503-5p 在癌癥中表達(dá)異常。例如，miR-503-5p在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)，其高表達(dá)抑制了肝細(xì)胞癌HCCLM3 細(xì)胞的細(xì)胞遷移，而miR-503-5p 低表達(dá)促進(jìn)了 HCCLM3 細(xì)胞的遷移和侵襲。但 miR-503-5p 在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用尚未可知。本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620、LOVO 和HT29 中miR-503-5p 表達(dá)量減少，與 Jiang 等的報道一致。另外，轉(zhuǎn)染miR-503-5p 明顯減少HT29 細(xì)胞的細(xì)胞存活率、Ki-67、CyclinD1 蛋白表達(dá)量，提高細(xì)胞凋亡率、Cleaved PARP 和 Cleaved caspase-3 蛋白水平，說明miR-503-5p 具有一定的抗結(jié)直腸癌的功能，可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與李小輝等的研究相符。

lncRNA 的作用機(jī)制復(fù)雜。lncRNA 可以與DNA，蛋白質(zhì)，mRNA 或 miRNA 發(fā)生物理結(jié)合，并改變結(jié)合者的表達(dá)，定位和功能。在各種作用機(jī)制中，與lncRNA 的miRNA 競爭性結(jié)合的報道越來越多。通過競爭性結(jié)合常見的 miRNA，lncRNA 減輕了miRNA 引起的靶向mRNA 的降解和/或翻譯抑制。如 BLACAT1 通過海綿 miR-361 調(diào)節(jié) ABCB1來促進(jìn)胃癌的奧沙利鉑耐藥性。本研究檢測到結(jié)直腸癌細(xì)胞中BLACAT1 和miR-503-5p 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步探索BLACAT1 影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制，生物信息學(xué)預(yù)測與雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)顯示，BLACAT1 靶向miR-503-5p。上調(diào)或下調(diào)BLACAT1 明顯調(diào)控miR-503-5p 的表達(dá)，提示BLACAT1具有負(fù)向miR-503-5p表達(dá)的作用。此外，干擾miR-503-5p 部分逆轉(zhuǎn)沉默BLACAT1 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、Ki-67、CyclinD1 蛋白表達(dá)和誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡、Cleaved PARP、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的作用。這些結(jié)果表明，BLACAT1可能是通過靶向調(diào)控miR-503-5p 的表達(dá)，從而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡過程。

綜上所述，lncRNA BLACAT1 在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，miR-503-5p 表達(dá)下調(diào)，沉默 BLACAT1 可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，沉默BLACAT1 發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制與靶向調(diào)控miR-503-5p 的表達(dá)密切相關(guān)，為結(jié)直腸癌的臨床診斷和治療提供了有前景的靶點(diǎn)。