劉夢瑤，王展慧，吳 浩，谷 月，吳文學(xué)

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

犢牛腹瀉是世界范圍內(nèi)引起犢牛疾病最重要的因素[1]。引起犢牛腹瀉的病毒主要有牛星狀病毒(bovine astroviruses，BAstV)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)、牛冠狀病毒(bovine coronavirus，BCV)和牛輪狀病毒(bovine rotavirus，BRV)等。這四種病毒在國內(nèi)均有流行。據(jù)調(diào)查在發(fā)生腹瀉的犢牛糞便中BAstV陽性率為5.2%～9.9%[2-4]。對于BVDV，雖然在犢牛耳緣組織和血液中病毒陽性率較低，但血液抗體陽性率較高，達(dá)15.94%～91.10%，且主要為BVDV-1型[5-7]。BCV在具腹瀉癥狀犢牛糞便樣本中的抗原陽性率為0.0%～26.4%[2,4,8-10]。BRV在中國具腹瀉癥狀犢牛糞便樣本中的抗原陽性率為9.20%～73.83%[2,4,9-12]。

星形病毒是鳥類和哺乳動(dòng)物腹瀉疾病的致病因素[13]，Mitchell等[14]發(fā)現(xiàn)從腹瀉前1～8 d開始至腹瀉停止后的1～20 d能檢測到星狀病毒排毒。BAstV感染1～4月齡犢牛將導(dǎo)致排大量水樣棕褐色至黃色的糞便和黏液等癥狀的嚴(yán)重的急性腸道疾病，多數(shù)癥狀在發(fā)病后5～7 d消失，少數(shù)則會(huì)演變?yōu)槁圆?，?dǎo)致明顯的發(fā)育延遲和少毛癥[15]。BVDV非細(xì)胞病變型和細(xì)胞病變型感染犢牛后均會(huì)導(dǎo)致一些溫和的急性呼吸道疾病和腹瀉的癥狀：感染后3～5 d開始出現(xiàn)精神沉郁，拒食，體溫高達(dá)41.9 ℃，從鼻腔和眼睛排出漿液性分泌液，短期血便，白細(xì)胞減少癥(可低至2 700 個(gè)·mm-3)，并且呼吸器官及腸道有肉眼可見的變化。這些感染的動(dòng)物大多在感染后12～15 d后恢復(fù)，并且90%的病例在感染25 d后形成體液免疫[16]。非細(xì)胞病變型BVDV急性感染妊娠25～90 d的母牛，通過抑制干擾素tau刺激的子宮內(nèi)膜Ⅰ型干擾素刺激基因的產(chǎn)生等原因使病毒逃避子宮內(nèi)膜中的宿主檢測，穿過胎盤進(jìn)入免疫系統(tǒng)未發(fā)育完全的胎兒建立持續(xù)感染，持續(xù)感染的牛終身排毒[17-20]。BCV和BRV是牛最常見的病毒性腸道病原體[21]。BCV是犢牛腸胃炎和呼吸系統(tǒng)疾病，泌乳牛冬季痢疾和飼養(yǎng)場牛運(yùn)輸性肺炎的主要原因[22]。Boileau等[23]用BCV感染犢牛，感染后48 h內(nèi)排出高水平的病毒，這種情況可持續(xù)至14 d。而Oma等[24]以自然感染BCV的牛與陰性?；烊焊腥?，得到牛感染后間歇性地排毒，鼻排毒雖早于糞便排毒，但鼻排毒到第28天，而糞便排毒可達(dá)35 d，且排毒高峰伴隨精神沉郁和咳嗽，高峰一周后達(dá)到最高的呼吸頻率和直腸溫度。Grover等[25]用夾心ELISA檢測驗(yàn)證了BRV感染犢牛后能持續(xù)排毒5～8 d，且出現(xiàn)腹瀉癥狀后1～2 d 病毒滴度最高。鑒于各種病毒在感染后的排毒時(shí)間不同，依據(jù)單次的核酸定量檢測結(jié)果不足以確定感染病原的主次，應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合判斷或間隔一定時(shí)間重復(fù)檢測一次。

為了輔助臨床獸醫(yī)準(zhǔn)確診斷犢牛腹瀉的病因以及開展流行病學(xué)監(jiān)測，迫切需要能夠鑒別這四種病毒的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法。而在多病原鑒別檢驗(yàn)方法中，熒光定量PCR方法是目前最可靠和準(zhǔn)確的方法之一。對于以上四種犢牛腹瀉常見病毒的Real-time PCR方法，現(xiàn)已建立同時(shí)檢測BVDV與牛傳染性鼻氣管炎病毒[26-27]，BVDV與HoBi樣瘟病毒[28]，BVDV與牛細(xì)小病毒[29]，BCV與環(huán)曲病毒[21]以及BCV與BRV[30]等兩種病原的方法，甚至同時(shí)檢測BVDV、牛傳染性支氣管炎病毒與口蹄疫病毒[31]以及BVDV、BCV和牛腸道病毒[32]等三種病原的方法。而對于BAstV，由于研究較少，暫時(shí)未有建立與其他病原同時(shí)檢測的Real-time PCR方法。由于現(xiàn)有的Real-time PCR方法暫未能涵蓋在國內(nèi)流行的四種犢牛腹瀉常見病毒，作者選擇BAstV、BVDV、BCV和BRV這四種病毒建立四重?zé)晒舛縍T-PCR方法，以減少檢測次數(shù)，進(jìn)而縮短診斷時(shí)間，為及時(shí)治療作出指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病毒株和菌株 BAstV B76-2/HK株、BVDV 1型JL 株(BVDV-JL)、BVDV 2型HLJ-10株(BVDV-HLJ-10)、BCV Aks-01新疆南疆株(BCV-Aks-01)、BRV G8P[1]型NX23株(BRV-NX23)、牛腺病毒3型HLJ0955株和牛副流感病毒3型SD0835株由本實(shí)驗(yàn)室保存。牛支原體PG45株購自美國模式菌種收集中心。牛支原體NM2012株、牛傳染性鼻氣管炎病毒BK1295株、腸炎沙門菌CVCC3949株、多殺性巴氏桿菌CVCC391株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 臨床樣品 北京市大興區(qū)奶牛糞樣88 份，北京市昌平區(qū)奶牛糞樣20 份，天津市武清區(qū)牛糞樣17 份，?？鼓?7 份，牛胃內(nèi)容物10 份，牛肺研磨液10 份，牛脾研磨液10 份，牛口腔黏液7 份。

1.1.3 主要試劑 病毒基因組RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)公司，One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)購自寶生物(大連)公司，氨芐青霉素、pEASY-T1 克隆質(zhì)粒，Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell，EasyTaq PCR Mix，TransTaq HiFi PCR Mix I，TransScript cDNA合成Mix，TransScript?Ⅱ One-Step RT-PCR SuperMix等購自北京全式金生物技術(shù)公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒等購自北京艾德萊生物科技公司。

1.1.4 儀器設(shè)備 Biometra GmbH PowerCycler SL 96 Gradient常規(guī)PCR儀、LightCycler?96 Real-time PCR儀、ThermoFisher NanoDrop 2000c 全自動(dòng)核酸微量測定儀。

1.1.5 引物與探針 分別在BAstVORF2基因、BVDV-1 5′端非編碼區(qū)、BCVNpro基因和BRV基因VP6保守區(qū)域設(shè)計(jì)并合成引物及探針，并采用擴(kuò)增星狀病毒的pol基因[34]、BVDV的5′UTR[35]、BCV的Npro[36]和A群輪狀病毒的VP6基因[30]的方法作為對照，相應(yīng)序列見表1。

表1 引物及探針信息Table 1 Primer and probe information

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的制備 使用病毒基因組RNA提取試劑盒，分別提取BAstV B76-2/HK株、BVDV JL株、BCV Aks-01株、BRV NX23株的全基因組RNA，將BAstV、BVDV和BCV的全基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別使用引物C-BAstVF-2、C-BAstVR-2，BVDVF-1、BVDVR-1和BCVF-2、BCVR-2對BAstV、BVDV、BCV的cDNA進(jìn)行PCR，電泳并膠回收獲得目的片段。BRV的全基因組RNA在95 ℃ 5 min后置于冰上，采用One-Step RT-PCR使用引物BRV-F6、BRV-R6對處理后的BRV的RNA進(jìn)行PCR,電泳并膠回收獲得BRV的目的片段。將回收產(chǎn)物連接到pEASY-T1克隆質(zhì)粒上，通過大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1轉(zhuǎn)化，涂板，挑取白色菌落，提質(zhì)粒，PCR鑒定并送生工測序，確認(rèn)序列正確后，增殖陽性菌，大量提取質(zhì)粒DNA，測其濃度及純度后，凍存于-20 ℃，作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測四種病毒的重組質(zhì)粒。

1.2.2 四重Real-time RT-PCR的優(yōu)化 先對每種病毒的Real-time PCR反應(yīng)單獨(dú)進(jìn)行優(yōu)化，模板為每種病毒的重組質(zhì)粒，反應(yīng)體系為2×One Step RT-PCR BufferⅢ 10 μL，TaKaRa ExTaqHS(5 U·μL-1)0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.4 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，探針(10 μmol·L-1)0.8 μL，RNase Free dH2O 5.6 μL，模板2 μL。反應(yīng)程序：42 ℃ 5 min反轉(zhuǎn)錄后，95 ℃ 10 s滅活反轉(zhuǎn)錄酶；然后95 ℃變性5 s，退火10 s，72 ℃延伸10 s，45個(gè)循環(huán)。首先優(yōu)化退火溫度，BAstV、BVDV和BCV的退火溫度設(shè)置48.0、48.3、49.0、50.0、51.2、52.4、53.6、54.8、56.0、57.0、57.7、58.0 ℃ 12個(gè)溫度梯度，BRV的退火溫度設(shè)置48.0、48.3、48.7、49.3、50.0、50.7、51.3、52.0、52.5、52.8、53.0 ℃ 11個(gè)溫度梯度，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果確定最適退火溫度。反應(yīng)程序采用最適退火溫度后，優(yōu)化單重Real-time RT-PCR的引物濃度，BAstV和BCV的引物濃度設(shè)50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 nmol·L-1共11個(gè)梯度，BVDV和BRV的引物濃度設(shè)100、200、300、400、500、600 nmol·L-1共6個(gè)梯度。然后以等量4種病毒重組質(zhì)粒的混合液為模板，并將單重反應(yīng)中的最適退火溫度，引物及探針濃度應(yīng)用于四重反應(yīng)后，BVDV和BAstV兩種病毒的反應(yīng)出現(xiàn)相互抑制現(xiàn)象，其他病毒無相互抑制，因此對四重Real-time RT-PCR反應(yīng)再進(jìn)行優(yōu)化。首先試驗(yàn)了30、45、60 s 3種退火時(shí)間，確定了最佳退火時(shí)間。所有優(yōu)化反應(yīng)針對每種變量均做了3個(gè)重復(fù)，且以RNase Free dH2O為模板，作為陰性對照。然后對四重Real-time RT-PCR反應(yīng)體系中BVDV和BAstV的引物和探針濃度進(jìn)行再優(yōu)化。BVDV探針設(shè)50、100、150、200、250 nmol·L-1共5個(gè)梯度，BAstV探針設(shè)100、150、200、250、300、400 nmol·L-1共6個(gè)梯度，每種變量做4個(gè)重復(fù)，2個(gè)重復(fù)的模板為4種病毒的重組質(zhì)粒，2個(gè)重復(fù)的模板為BVDV和BAstV的重組質(zhì)粒。將濃度300～700 nmol·L-1的BAstV引物與濃度100～500 nmol·L-1的BVDV引物做棋盤式優(yōu)化，每種變量做6個(gè)重復(fù)，2個(gè)重復(fù)的模板為4種病毒的重組質(zhì)粒，2個(gè)重復(fù)的模板為BVDV的重組質(zhì)粒，2個(gè)重復(fù)的模板為BAstV的重組質(zhì)粒。根據(jù)Ct值和曲線峰值確定最優(yōu)引物濃度和探針濃度。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性分析 將4種病毒的引物和探針均加入PCR管內(nèi)進(jìn)行四重Real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRa ExTaqHS (5 U·μL-1)0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，引物及探針為之前優(yōu)化的最優(yōu)體積，模板2 μL，RNase Free dH2O 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：反轉(zhuǎn)錄42 ℃ 5 min，滅活反轉(zhuǎn)錄酶95 ℃ 10 s，三步法45個(gè)循環(huán)(變性95 ℃ 5 s，退火50 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 10 s)。模板分別為1010～100copies·μL-1的BAstV、BVDV、BCV、BRV重組質(zhì)粒。所有反應(yīng)均做了3個(gè)重復(fù)，且以RNase Free dH2O為模板，作為陰性對照。構(gòu)建重組質(zhì)?？截悢?shù)-Ct值標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定方法檢測4種病毒的最低檢測限。

1.2.4 特異性分析 以優(yōu)化好的四重體系及四重反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)，模板依次加入牛傳染性鼻氣管炎病毒BK1295株、牛腺病毒3型HLJ0955株、牛支原體PG45株、牛支原體NM2012株、腸炎沙門菌CVCC3949株、多殺性巴氏桿菌CVCC391株全基因組DNA和BVDV 2型HLJ-10株、牛副流感病毒3型SD0835株全基因組RNA，以BAstV、BVDV-1、BCV和BRV G8P[1]型的重組質(zhì)粒作為陽性模板，所有反應(yīng)均做了3個(gè)重復(fù)，且以RNase Free dH2O為模板，作為陰性對照。

1.2.5 重復(fù)性分析 以優(yōu)化好的四重體系及四重反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)，模板分別加入107copies·μL-1的BAstV、BVDV、BCV、BRV的重組質(zhì)粒，所有反應(yīng)均做了3個(gè)重復(fù)，且以RNase Free dH2O為模板，作為陰性對照，重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)。

1.2.6 同時(shí)檢測四種模板與只檢測單種模板的差異 以優(yōu)化好的四重體系與反應(yīng)程序進(jìn)行Real-time PCR，模板分別為BAstV、BVDV、BCV和BRV的重組質(zhì)?；旌湍０澹珺AstV重組質(zhì)粒，BVDV重組質(zhì)粒，BCV重組質(zhì)粒，BRV重組質(zhì)粒為陽性對照，所有反應(yīng)均做了3個(gè)重復(fù)，且以RNase Free dH2O為模板，作為陰性對照，對比單種模板存在的四重Real-time PCR與四種模板同時(shí)存在的四重Real-time PCR的Ct值差異。

1.2.7 熱處理解鏈對四重Real-time PCR檢測病原效果的影響 以優(yōu)化好的四重體系及反應(yīng)程序進(jìn)行Real-time PCR，模板分別采用BVDV JL株的RNA，95 ℃ 5 min水浴后置于冰上的BVDV JL株的RNA，所有反應(yīng)均做了3個(gè)重復(fù)，且以RNase Free dH2O為模板，作為陰性對照。

1.2.8 臨床樣品檢測 采集了北京市大興區(qū)3月齡以內(nèi)犢牛糞樣X1～X13共13份，3～6月齡犢牛糞樣M1～M33共33份，成年奶牛糞樣C1～C39共39份，成年奶牛腹瀉糞樣B1～B3共3份；北京市昌平區(qū)成年奶牛腹瀉糞樣150035、150120等共20份；天津市武清區(qū)成年奶牛腹瀉糞樣19056、19083、19087等共17份，抗凝血1～17共17份，胃內(nèi)容物1～10共10份，肺研磨液1～10共10份，脾研磨液1～10共10份，口腔黏液1～7共7份。對各待檢樣品提取RNA并95 ℃ 5 min水浴解鏈后置于冰上，進(jìn)行四重Real-time PCR和PCR檢測，所有反應(yīng)均做了3個(gè)重復(fù)，且以RNase Free dH2O為模板，作為陰性對照。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的制備

BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的克隆質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳，分別獲得了146、142、179和121 bp的目的條帶(圖1)，測序并BLAST鑒定表明與目的基因序列相符。質(zhì)粒濃度分別為2.52×1010、6.14×1010、4.05×1010和2.05×1010copies·μL-1。

M.Trans DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)I;1.BAstV重組質(zhì)粒;2.BVDV-1重組質(zhì)粒;3.BCV重組質(zhì)粒;4.BRV重組質(zhì)粒;5.陰性對照M.Trans DNA marker I;1.BAstV plasmids;2.BVDV-1 plasmids;3.BCV plasmids;4.BRV plasmids;5.Negative control圖1 4種重組質(zhì)粒的PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR amplification of four recombinant plasmids

2.2 四重Real-time PCR的優(yōu)化

根據(jù)四重Real-time PCR優(yōu)化結(jié)果，最適退火溫度和時(shí)間分別為50.0 ℃和45 s，BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的引物濃度分別為300、300、400和500 nmol·L-1。BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的探針濃度分別為250、150、100和300 nmol·L-1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性分析

BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，其斜率分別為-3.262 1、-3.290 3、-3.313 3和-3.401 0，相關(guān)系數(shù)均為0.99，擴(kuò)增效率分別為103%、101%、100%和97%，說明標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性關(guān)系。BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的敏感性擴(kuò)增曲線見圖3，BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的最低檢測限分別為103、102、102和102copies·μL-1。

A.BAstV標(biāo)準(zhǔn)曲線;B.BVDV-1標(biāo)準(zhǔn)曲線;C.BCV標(biāo)準(zhǔn)曲線;D.BRV標(biāo)準(zhǔn)曲線A.The standard curve of BAstV;B.The standard curve of BVDV-1;C.The standard curve of BCV;D.The standard curve of BRV圖2 四重Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curves of the Quadruple Real-time PCR

A.BAstV靈敏度擴(kuò)增曲線;B.BVDV-1靈敏度擴(kuò)增曲線;C.BCV靈敏度擴(kuò)增曲線;D.BRV靈敏度擴(kuò)增曲線A.The sensitivity amplification curves of BAstV;B.The sensitivity amplification curves of BVDV-1;C.The sensitivity amplification curves of BCV;D.The sensitivity amplification curves of BRV圖3 四重Real-time PCR靈敏度擴(kuò)增曲線Fig.3 The sensitivity amplification curves of the Quadruple Real-time PCR

2.4 特異性分析

四重Real-time PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，除四種重組質(zhì)粒有熒光擴(kuò)增曲線外，其余核酸及ddH2O均無熒光擴(kuò)增曲線，說明建立的四重Real-time PCR方法有較強(qiáng)的特異性。

圖4 四重Real-time PCR特異性擴(kuò)增曲線Fig.4 The specific amplification curves of the Quadruple Real-time PCR

2.5 重復(fù)性分析

四重Real-time PCR檢測結(jié)果見表2，批內(nèi)Ct值變異系數(shù)為0.52%～0.78%，批間Ct值變異系數(shù)為1.18%～2.48%，均小于10.0%，說明該Real-time PCR方法的重復(fù)性良好。

表2 四重Real-time PCR重復(fù)性檢測結(jié)果Table 2 The reproducibility of the Quadruple Real-time PCR

2.6 同時(shí)檢測四種模板與只檢測單種模板的差異

每種單種模板存在的四重Real-time PCR與四種模板同時(shí)存在的四重Real-time PCR的Ct值差異均小于3，即拷貝數(shù)差異小于10倍，且差異不顯著(P>0.05)，可進(jìn)行10的倍數(shù)的拷貝數(shù)定量。

2.7 熱處理解鏈對四重Real-time PCR檢測病原效果的影響

BVDV JL株的RNA可檢出，其Ct值為18.05，RNA濃度為111.80 ng·μL-1，TCID50為10-4.5·0.1 mL-1，所對應(yīng)的拷貝數(shù)為1.41×106copies·μL-1，檢測的2 μL病毒含2.5×103個(gè)TCID50。95 ℃ 5 min水浴后置于冰上的BVDV JL株的RNA的Ct值為17.37，差異不大，則前期BRV病毒RNA高溫解鏈操作不影響B(tài)VDV病毒RNA的檢測。高志強(qiáng)等[33]檢測得到IDEXX的BVDV抗原檢測試劑盒檢測50 μL病毒液的敏感度為1.2×103個(gè)TCID50。則本方法檢測病毒培養(yǎng)液敏感度高于IDEXX的BVDV抗原檢測試劑盒的敏感度。

2.8 臨床樣品檢測

179份樣品的檢測結(jié)果及分析見表3。在臨床糞樣的檢測中，本方法能夠檢出并定量3.91×104copies·μL-1及其以上拷貝數(shù)的BAstV，而PCR方法檢測中4.00×104copies·μL-1及其以下拷貝數(shù)的BAstV就顯示為陰性；對于BCV，1.26×103copies·μL-1及其以上拷貝數(shù)本方法能夠檢出并定量，而PCR方法檢測該拷貝數(shù)的BCV為陰性，因此本方法對臨床糞樣的陽性檢出率高于PCR方法。同時(shí)，能夠看出BAstV和BRV在3月齡內(nèi)犢牛的陽性率遠(yuǎn)高于其他年齡段，而BCV在犢牛中陽性率較高，但成年牛也有檢出。

表3 臨床樣本檢測結(jié)果Table 3 The detection results of clinical samples %

3 討 論

目前，同時(shí)檢測相關(guān)牛病原的方法存在多種，Asano等[37]的半嵌套式的多重RT-PCR方法以及Fukuda等[38]、柳強(qiáng)等[30]和侯佩莉等[32]的多重RT-PCR方法均需要在PCR反應(yīng)完成后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過是否有目的條帶來確定是否為陽性，過程較為繁瑣耗時(shí)，且需要在核酸膠中依次加樣，在樣品較多時(shí)容易混亂，而本方法所使用的多重Real-time PCR反應(yīng)在PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)即可得到結(jié)果，且可同時(shí)進(jìn)行96孔樣品的檢測。以SYBR Green作為染料的多重Real-time PCR反應(yīng)中，染料與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)射熒光信號，引物二聚體、錯(cuò)配以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物均能夠發(fā)射熒光信號，需要通過熔解曲線對產(chǎn)物的特異性進(jìn)行判定，而本方法采用的探針是與目的片段特異性結(jié)合的，當(dāng)DNA擴(kuò)增到探針結(jié)合區(qū)域時(shí)，探針才會(huì)斷裂釋放出熒光，特異性更強(qiáng)，不需要檢測熔解曲線的步驟，更節(jié)省時(shí)間。但多對引物及探針將混合在一個(gè)反應(yīng)體系中，反應(yīng)之間相互影響往往使得多重Real-time PCR反應(yīng)的定量不準(zhǔn)確，從而導(dǎo)致許多多重Real-time PCR反應(yīng)不能夠準(zhǔn)確定量，只能定性，而我們在設(shè)計(jì)和篩選引物及探針時(shí)，通過DNAstar的Primerselect將所用引物及探針逐一配對預(yù)測是否存在嚴(yán)重的二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)，PCR驗(yàn)證四種引物和單種引物存在下條帶的變化以及進(jìn)行單重和四重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)觀察其擴(kuò)增曲線是否呈S型且平臺(tái)對應(yīng)的熒光值較高，成功地建立了反應(yīng)之間影響不顯著、能夠準(zhǔn)確定量的四重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。且本方法中，BAstV、BVDV、BCV、BRV陽性時(shí)能夠分別通過FAM、HEX、Texas Red和CY5四種熒光發(fā)射基因發(fā)射不同的熒光，被實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的四個(gè)通道分別捕捉，能夠簡單易懂地區(qū)分陽性抗原和分別定量。相比于微陣列[39]、GeXP[40]等方法，本方法所需的平臺(tái)相對簡單，只需要實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀即可，現(xiàn)已有輕巧、便攜的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀投入使用。

本方法首次將可能導(dǎo)致犢牛腹瀉的BAstV、BVDV、BCV、BRV四種病毒放在一起，只需一個(gè)反應(yīng)便能同時(shí)檢測這四種病毒，更加方便、快捷，而且不同于普通RT-PCR顯示的PCR擴(kuò)增后結(jié)果[30,32,37-38]，本方法所測量的是所加初始模板的量，能夠較為準(zhǔn)確地定量樣品中的病毒含量，便于通過排毒量判斷感染處于哪個(gè)階段，是持續(xù)感染還是急性感染等。由于這四種病毒急性感染成年牛，大多是一過性感染，且急性感染時(shí)排毒時(shí)間短、量少，想要研究這四種病毒的急性感染期就必須能夠及時(shí)并準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)少量病毒感染。本方法的敏感性與其他已有方法[26-41]相似，且對于BVDV-1病毒培養(yǎng)液的檢測敏感度高于IDXX的BVDV抗原檢測試劑盒的敏感度[33]。并且本方法能夠檢測包括糞樣、組織、血液、血漿、胃內(nèi)容物和口腔黏液等在內(nèi)的各種樣品所提取的RNA，沒有樣品類型的局限性，能夠在采集樣品時(shí)選擇最早出現(xiàn)病毒的部位進(jìn)行采集，保證及時(shí)發(fā)現(xiàn)感染，也能夠從分泌物或排泄物中檢測病毒，有效地減少對牛的刺激和采樣時(shí)的工作量。同時(shí)，本方法一方面針對BRV是雙鏈RNA病毒，一般的預(yù)變性過程無法保證RNA雙鏈開鏈，從而導(dǎo)致引物難以結(jié)合的問題，我們使用95 ℃高溫解鏈然后置于冰上的RNA前期處理在保證其他病毒的檢測不受影響的同時(shí)，提高了檢測BRV的敏感性；另一方面，其他已有方法大多是提前以隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以反轉(zhuǎn)錄后的模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，以隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄，每次獲得的總cDNA量大致相同，但可能由于酶量或引物量的限制，未能反轉(zhuǎn)錄完全所要檢測的模板，致使定量不準(zhǔn)確，而本方法中反轉(zhuǎn)錄是包含在Real-time PCR反應(yīng)過程中的，以特異性引物反轉(zhuǎn)錄模板的，微量模板即可反應(yīng)，能夠更好地增加檢出率且定量初始模板量更準(zhǔn)確。同時(shí)，本方法不需要額外反轉(zhuǎn)錄，RNA直接反應(yīng)即可獲得結(jié)果，首先，減少了操作過程，更加節(jié)省時(shí)間；其次，由于cDNA比RNA更穩(wěn)定，長期檢測可能產(chǎn)生氣溶膠，而Real-time PCR作為更為靈敏的PCR檢測方法，環(huán)境中模板濃度稍高就能導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性，DNA氣溶膠一旦產(chǎn)生難以徹底去除，十分地費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而一步法很好地避免了這些錯(cuò)誤的發(fā)生。對于臨床檢測，前期我們篩選了諸多文獻(xiàn)的PCR引物，PCR擴(kuò)增驗(yàn)證其特異性，以這些驗(yàn)證后的PCR引物為對照[30,34-36]，檢測臨床樣品，對比發(fā)現(xiàn)本方法對臨床糞樣的陽性檢出率更高。臨床樣品的檢測結(jié)果也提示我們3月齡內(nèi)犢牛更易感染BAstV和BRV，而BCV主要感染犢牛，但成年牛也有一定程度的感染，有助于我們確定這四種病毒的易感年齡，從而通過牛的年齡提前判斷診斷方向。使用本方法進(jìn)行四種病毒的流行病學(xué)監(jiān)測，能夠快速、準(zhǔn)確地獲取疾病感染狀況，一方面便于及時(shí)采集相應(yīng)時(shí)期的樣品更深入地研究病原，如，研究這四種病毒急性感染期的免疫狀況，產(chǎn)生的記憶細(xì)胞等；另一方面，便于牛場對疾病流行狀況進(jìn)行掌控，能夠合理地制定防疫措施。

4 結(jié) 論

建立了同時(shí)定量、快速、靈敏地檢測BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的四重Real-time PCR方法，在牛場BAstV、BVDV-1、BCV和BRV監(jiān)測，特別是犢牛腹瀉原因確定中具有重要應(yīng)用價(jià)值。