肖 帆,張利平*,吳建平,靳繼鵬,孫渭博,張?bào)闫G

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，蘭州 730070)

綿羊(ovisaries)的繁殖性能是其重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，直接決定著養(yǎng)羊業(yè)的生產(chǎn)成本和經(jīng)濟(jì)效益。提高綿羊每胎次的產(chǎn)羔數(shù)是提高生產(chǎn)效益的最直接方式，具有十分重要的意義。綿羊的產(chǎn)羔性狀在不同品種間存在明顯差異[1]，我國多數(shù)綿羊品種以產(chǎn)單羔為主，繁殖力較低，少數(shù)品種產(chǎn)多羔。例如，我國特有的小尾寒羊、湖羊等以產(chǎn)多羔為主，都屬于高繁殖力綿羊品種；而我國其它綿羊品種，如蒙古羊、藏羊等主要以單胎羊?yàn)橹鳎a(chǎn)雙羔的比例較低，一般在5%以下[2]。相比于傳統(tǒng)育種方法，通過分子遺傳標(biāo)記技術(shù)篩選出與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的分子標(biāo)記，就可在羔羊時(shí)期鑒定出具有高繁殖力的個(gè)體，從而實(shí)現(xiàn)綿羊繁殖性能的持續(xù)優(yōu)化提升[3]。綿羊產(chǎn)羔數(shù)是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀，遺傳力為0.03～0.10，受遺傳、表觀修飾和激素等的調(diào)控，綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀受主效基因控制的同時(shí)還受微效多基因的調(diào)控[4]。目前，已確定影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因有BMPR1B、BMP15、GDF9、B4GALNT2等[5-10]。但基于線粒體DNA(mitochondrion DNA，mtDNA)變異與表型性狀間的關(guān)聯(lián)分析報(bào)道較少。與核DNA遺傳不同的是，mtDNA結(jié)構(gòu)比較簡單，呈共價(jià)、閉合的雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從母體到后代通常不發(fā)生變化[11]。線粒體是能量代謝中心，通過氧化磷酸化系統(tǒng)產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，因此它們在細(xì)胞內(nèi)有自己的生命過程，其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄獨(dú)立進(jìn)行,不受細(xì)胞周期的限制[12]。

mtDNA在動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀方面的研究較少。Tess等[13]研究發(fā)現(xiàn)，牛的產(chǎn)乳性能與線粒體核苷酸變異具有顯著關(guān)聯(lián)。在豬肥育性狀研究中發(fā)現(xiàn)存在mtDNA的遺傳學(xué)效應(yīng)[14]。侯玲靈[15]研究了線粒體異質(zhì)性在不同品種間和固始雞資源群體中的分布及其對重要經(jīng)濟(jì)性狀的效應(yīng)。Zhang等[16]采用PCR-SSCP和DNA測序方法檢測了6個(gè)中國牛種714個(gè)個(gè)體的mtDNAND5基因多態(tài)性，結(jié)果表明，ND5基因變異與早期生長性狀差異顯著。Biase等[17]研究表明，牛mtDNA的tRNA基因變異與個(gè)體質(zhì)量顯著相關(guān)。Jeon等[18]研究得出，牛mtDNA的COI、COII、COIII 基因變異與重量性狀差異顯著相關(guān)。傅建軍等[19]研究得出，草魚D-loop序列變異對子代生長性狀具有顯著影響,推測可以利用mtDNA多態(tài)性信息進(jìn)行輔助選擇。Aljubouri和Al-Shuhaib[20]通過研究伊朗3種多胎綿羊的D-loop區(qū)遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)它們在地理分布和表型性狀上存在明顯差異。Wei等[21]研究發(fā)現(xiàn)，雖然BMPR1B基因與中國一些綿羊品種或品系的高繁殖力相關(guān)，但它并不是影響中國綿羊繁殖力的唯一基因。Niu等[22]比較了藏羊與其他綿羊線粒體全基因組序列，藏羊mtDNA的拷貝數(shù)顯著低于薩?？搜?，藏羊在12S rRNA的突變還未趨于穩(wěn)定，確定了藏羊耐缺氧的分子標(biāo)記。Reicher等[23]研究Afec-Assaf母羊D-loop區(qū)和細(xì)胞色素b(Cytb)后發(fā)現(xiàn)，HB和HC單倍型顯著影響母羊的產(chǎn)羔數(shù)性狀。陳曉勇等[24]在薩?？司d羊mtDNA編碼區(qū)中發(fā)現(xiàn)14個(gè)變異位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)。

因此，本試驗(yàn)采用PCR結(jié)合DNA測序技術(shù)對小尾寒羊、湖羊、蒙古羊、歐拉羊以及甘肅高山細(xì)毛羊的mtDNA多態(tài)性進(jìn)行檢測，并結(jié)合產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，旨在探索mtDNA與綿羊產(chǎn)羔性狀的相關(guān)性，尋找影響綿羊繁殖性能的分子遺傳標(biāo)記，為高繁殖力綿羊的選育提供理論依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取健康、有產(chǎn)羔記錄的3～4歲小尾寒羊多羔母羊(multiple Small tailed han sheep，XM)63只、湖羊多羔母羊(multiple Hu sheep，HM)47只、蒙古羊雙羔母羊(twins Mongolian sheep，MT)42只、蒙古羊單羔母羊(singletons Mongolian sheep，MS)46只、歐拉羊雙羔母羊(twins Oula sheep，OT)52只、歐拉羊單羔母羊(singletons Oula sheep，OS)50只、甘肅高山細(xì)毛羊雙羔母羊(twins Gansu alpine fine wool sheep，GT)42只和甘肅高山細(xì)毛羊單羔母羊(singletons Gansu alpine fine wool sheep，GS)48只為試驗(yàn)對象，取其頸靜脈血5 mL，用EDTA抗凝，迅速送回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 提取血液基因組DNA

采用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取基因組DNA，并通過分光光度計(jì)與瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量及濃度檢測。

1.3 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

從GenBank(NCBI)中選取綿羊線粒體DNA序列(登錄號為AF 010406.1)，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由金唯智有限公司合成，具體如表1所示。

表1 引物序列信息Table 1 Primers sequence information

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL：Taq Mix 10 μL，RNase-free ddH2O 7 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。引物P1的PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。引物P2的PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。引物P3的PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃總延伸10 min,35個(gè)循環(huán)。將檢測合格的PCR產(chǎn)物送至生物公司(北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行DNA測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測序結(jié)果通過DNAMAN軟件對其數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，運(yùn)用NCBI BLAST將試驗(yàn)綿羊序列與綿羊線粒體DNA標(biāo)準(zhǔn)序列(GenBank AF 010406.1)比對分析，通過DNAsp和MEGA軟件對多態(tài)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用SPSS 21.0軟件Duncan′s法進(jìn)行多重比較顯著性檢驗(yàn)，單因素方差分析(One-Way ANOVA)多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊血液基因組DNA檢測

采用DNA提取試劑盒從采集的綿羊冷凍血中提取DNA，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰，無雜帶等現(xiàn)象，并且分光光度計(jì)檢測OD值為1.70～1.90，說明提取的DNA無降解，完整性好(圖1)。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)M.DL2000 DNA marker圖1 綿羊血樣基因組DNA的檢測結(jié)果Fig.1 Detection results of sheep blood genomic DNA

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

運(yùn)用引物及其反應(yīng)程序，以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。P1、P2、P3引物擴(kuò)增結(jié)果見圖2A、2B、2C，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小(分別為321、736、1 421 bp)與預(yù)期相近，符合目的片段大小，且條帶清晰無雜帶，可進(jìn)行下一步測序反應(yīng)。

2.3 測序結(jié)果比對分析

運(yùn)用NCBI BLAST將試驗(yàn)綿羊序列與綿羊線粒體DNA標(biāo)準(zhǔn)序列(GenBank AF 010406.1)進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示，同源性達(dá)99%以上，證明此序列為目的序列，且在所有個(gè)體中沒有檢測到雜合型變異位點(diǎn)。

2.4 綿羊變異位點(diǎn)分析

試驗(yàn)綿羊群體共有309個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡約信息位點(diǎn)212個(gè)。小尾寒羊194個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡約信息位點(diǎn)128個(gè)；湖羊139個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡約信息位點(diǎn)106個(gè)；蒙古羊198個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡約信息位點(diǎn)133個(gè)；歐拉羊204個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡約信息位點(diǎn)137個(gè)；甘肅高山細(xì)毛羊177個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡約信息位點(diǎn)122個(gè)。從變異位點(diǎn)中篩選出16個(gè)與產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)的變異位點(diǎn)并進(jìn)行分析。變異位點(diǎn)的具體分布情況見表2。

表2 不同產(chǎn)羔類型綿羊變異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of variation sites of sheep with different lambing types

2.5 不同繁殖力綿羊的變異位點(diǎn)基因型分布差異分析

采用SPASS 21.0軟件檢測試驗(yàn)綿羊A1099T、T1112C、C13576T、T13837C、T13855C、T15445C、T15627C、T15657C、T15668C、A15714G、T15732C、A15923G、T15956C、G15977A、A16101G和C16429T位點(diǎn)基因型分布差異，如表3～表9所示。T15445C、T15627C位點(diǎn)基因型分布一致。在A1099T位點(diǎn)，小尾寒羊多羔母羊(XM)與蒙古羊單羔母羊(MS)、歐拉羊雙羔母羊(OT)、歐拉羊單羔母羊(OS)、甘肅高山細(xì)毛羊雙羔母羊(GT)、甘肅高山細(xì)毛羊單羔母羊(GS)之間基因型分布均有顯著性差異(P<0.05)；湖羊多羔母羊(HM)也與蒙古羊單羔母羊(MS)、歐拉羊雙羔母羊(OT)、歐拉羊單羔母羊(OS)、甘肅高山細(xì)毛羊雙羔母羊(GT)、甘肅高山細(xì)毛羊單羔母羊(GS)之間基因型分布均有顯著性差異(P<0.05)。在T1112C、C13576T、T13837C和T13855C位點(diǎn)，小尾寒羊多羔母羊(XM)與湖羊多羔母羊(HM)之間基因型分布均無顯著差異(P>0.05)，但小尾寒羊多羔母羊(XM)與其余試驗(yàn)組綿羊群體之間基因型分布均有顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)湖羊多羔母羊(HM)與其余試驗(yàn)組綿羊群體之間基因型分布也均有顯著性差異(P<0.05)。

表3 A1099T和T1112C位點(diǎn)基因型分布差異檢測結(jié)果Table 3 Results of genotype distribution difference at A1099T and T1112C sites

表4 C13576T、T13855C和T13837C位點(diǎn)基因型分布差異檢測結(jié)果Table 4 Results of genotype distribution difference at C13576T,T13855C and T13837C sites

從表5中可知，在T15445C、T15627C位點(diǎn)，歐拉羊雙羔母羊(OT)與蒙古羊單羔母羊(MS)之間基因型分布無顯著差異(P>0.05)，與其余試驗(yàn)組的綿羊群體之間基因型分布均有顯著性差異(P<0.05)；在T15657C位點(diǎn)，歐拉羊雙羔母羊(OT)與小尾寒羊多羔母羊(XM)、歐拉羊單羔母羊(OS)、湖羊多羔母羊(HM)、蒙古羊雙羔母羊(MT)之間基因型分布均有顯著性差異(P<0.05)。

表5 T15445C、T15627C和T15657C位點(diǎn)基因型分布差異檢測結(jié)果Table 5 Results of genotype distribution difference at T15445C,T15627C and T15657C sites

從表6中可知，在T15668C位點(diǎn)，蒙古羊雙羔母羊(MT)與其余試驗(yàn)組綿羊群體之間基因型分布均有顯著性差異(P<0.05)。在A15714G位點(diǎn)，蒙古羊雙羔母羊(MT)與小尾寒羊多羔母羊(XM)、湖羊多羔母羊(HM)、甘肅高山細(xì)毛羊雙羔母羊(GT)之間基因型分布均有顯著性差異(P<0.05)。

表6 T15668C和A15714G位點(diǎn)基因型分布差異檢測結(jié)果Table 6 Results of genotype distribution difference at T15668C and A15714G sites

A.P1擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果；B.P2擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果；C.P3擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果。M.DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)A.The amplification products of P1;B.The amplification products of P2;C.The amplification products of P3.M.DL2000 DNA marker圖2 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果Fig.2 Detection results of amplification products

從表7中可知，在T15732C位點(diǎn)，歐拉羊單羔母羊(OS)與歐拉羊雙羔母羊(OT)、甘肅高山細(xì)毛羊單羔母羊(GS)之間基因型分布均有顯著性差異(P<0.05)。在A15923G位點(diǎn)，甘肅高山細(xì)毛羊雙羔母羊(GT)與歐拉羊雙羔母羊(OT)、甘肅高山細(xì)毛羊單羔母羊(GS)之間基因型分布均有顯著性差異(P<0.05)。

表7 T15732C和A15923G位點(diǎn)基因型分布差異檢測結(jié)果Table 7 Results of genotype distribution difference at T15732C and A15923G sites

從表8中可知，15956C位點(diǎn)小尾寒羊多羔母羊(XM)與湖羊多羔母羊(HM)之間基因型分布差異不顯著(P>0.05)，湖羊多羔母羊(HM)與蒙古羊雙羔母羊(MT)之間基因型分布差異不顯著(P>0.05)，但小尾寒羊多羔母羊(XM)和湖羊多羔母羊(HM)與其余試驗(yàn)組綿羊群體之間基因型分布均有顯著性差異(P<0.05)；蒙古羊雙羔母羊(MT)與歐拉羊雙羔母羊(OT)之間基因型分布有顯著性差異(P<0.05)。G15977A位點(diǎn)小尾寒羊多羔母羊(XM)與湖羊多羔母羊(HM)、歐拉羊雙羔母羊(OT)之間基因型分布有顯著性差異(P<0.05)，歐拉羊雙羔母羊(OT)和歐拉羊單羔母羊(OS)之間基因型分布有顯著性差異(P<0.05)。

表8 T15956C和G15977A位點(diǎn)基因型分布差異檢測結(jié)果Table 8 Results of genotype distribution difference at T15956C and G15977A sites

從表9中可知，在A16101G位點(diǎn)，歐拉羊雙羔母羊(OT)與小尾寒羊多羔母羊(XM)、湖羊多羔母羊(HM)、蒙古羊雙羔母羊(MT)、蒙古羊單羔母羊(MS)、歐拉羊單羔母羊(OS)、甘肅高山細(xì)毛羊雙羔母羊(GT)之間基因型分布均有顯著性差異(P<0.05)。在C16429T位點(diǎn)，歐拉羊雙羔母羊(OT)僅與蒙古羊單羔母羊(MS)之間基因型分布差異不顯著(P>0.05)，與其余試驗(yàn)組綿羊群體之間基因型分布均有顯著性差異(P<0.05)。

表9 綿羊A16101G和C16429T位點(diǎn)基因型分布差異檢測結(jié)果Table 9 Results of genotype distribution difference at A16101G and C16429T sites

2.6 綿羊變異位點(diǎn)與產(chǎn)羔性狀的相關(guān)性分析

對試驗(yàn)綿羊群體的變異位點(diǎn)與產(chǎn)羔性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表10，結(jié)果顯示，在T15445C和T15627C位點(diǎn)，歐拉羊產(chǎn)羔數(shù)C型(2.000只)均顯著高于T型(1.489只)(P<0.05)。T15657C位點(diǎn)，歐拉羊產(chǎn)羔數(shù)C型(1.800只)顯著高于T型(1.459只)(P<0.05)。T15668C位點(diǎn)，蒙古羊產(chǎn)羔數(shù)C型(2.000只)顯著高于T型(1.452只)(P<0.05)。T15732C位點(diǎn)，歐拉羊產(chǎn)羔數(shù)T型(1.530只)顯著高于C型(1.000只)(P<0.05)。A15923G位點(diǎn)，甘肅高山細(xì)毛羊產(chǎn)羔數(shù)G型(1.800只)顯著高于A型(1.425只)(P<0.05)。T15956C位點(diǎn)，歐拉羊產(chǎn)羔數(shù)T型(1.550只)顯著高于C型(1.230只)(P<0.05)。G15977A位點(diǎn)，歐拉羊產(chǎn)羔數(shù)A型(1.736只)顯著高于G型(1.457只)(P<0.05)。C16429T位點(diǎn)，歐拉羊產(chǎn)羔數(shù)T型(1.695只)顯著高于C型(1.455只)(P<0.05)。

表10 綿羊mtDNA變異位點(diǎn)與產(chǎn)羔性狀的相關(guān)性Table 10 Correlation between mtDNA variation sites and litter size in sheep

2.7 綿羊mtDNA單倍型與產(chǎn)羔性狀的相關(guān)性分析

試驗(yàn)綿羊mtDNA有9個(gè)與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)的突變位點(diǎn)(15445、15627、15657、15668、15732、15923、15956、15977、16429)形成28個(gè)單倍型，個(gè)體數(shù)大于試驗(yàn)綿羊總數(shù)5%的單倍型有4種，其在群體中的具體分布如表11所示。

表11 顯著變異位點(diǎn)單倍型群體分布Table 11 Population distribution of haplotype at significant variation sites

表12顯示了mtDNA顯著突變位點(diǎn)形成的單倍型與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果，歐拉羊的TTCTTACGC(Hap_2)單倍型母羊產(chǎn)羔數(shù)(1.778只)顯著大于TTTTTACGC(Hap_1)單倍型和TTTTTATGC(Hap_4)單倍型母羊產(chǎn)羔數(shù)(1.386和1.167只)。但歐拉羊的TTCTTACGC(Hap_2)單倍型母羊產(chǎn)羔數(shù)與TTTTTACAT(Hap_3)單倍型母羊產(chǎn)羔數(shù)(1.625只)無顯著性差異。通過從整體上分析所有不同產(chǎn)羔類型試驗(yàn)綿羊單倍型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，TTTTTATGC(Hap_4)單倍型母羊產(chǎn)羔總數(shù)(2.254只)顯著大于其他單倍型。

表12 顯著變異位點(diǎn)單倍型與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性Table 12 Correlation between haplotypes at significant variation sites and litter size

3 討 論

綿羊繁殖力的高低取決于排卵的數(shù)量、卵子的受精能力、性成熟的時(shí)間、胎產(chǎn)羔數(shù)等。綿羊繁殖性狀中的胎產(chǎn)羔數(shù)性狀存在3種方式：一胎產(chǎn)一羔，也稱單胎性狀，是指母羊一生中每胎都只產(chǎn)1只羔羊，其母羊稱單胎母羊；一胎產(chǎn)雙羔，也稱雙胎性狀或雙羔性狀，是指母羊一生中有過一胎產(chǎn)2只羔羊的，其母羊稱雙羔羊或雙胎羊；一胎產(chǎn)多羔也稱多胎性狀或多胎性，是指母羊一生中有過一胎產(chǎn)3只或3只以上羔羊的，其母羊稱多胎羊。mtDNA的多態(tài)性與人類各種疾病及動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀，如雞的增重與產(chǎn)蛋量，奶牛產(chǎn)奶量、乳脂量、乳脂率和蛋白含量，豬的增重，羊的增重與產(chǎn)毛量等性狀，都存在著核外基因效應(yīng)。李楊等[25]采用DNA測序和PCR-RFLP方法，對瓢雞線粒體DNACOX3基因變異與生長、屠體性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，C10669T位點(diǎn)基因型間生長性狀差異顯著。Qin等[26]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦奶牛產(chǎn)奶量與ATPASE8/6的單倍型顯著相關(guān)，因此ATPASE8/6的單倍型可能是影響荷斯坦奶牛產(chǎn)奶量的分子標(biāo)記。線粒體DNA有拷貝數(shù)多、突變率高、母系遺傳且參與氧化磷酸化合成ATP等特點(diǎn)，且ATP是細(xì)胞最重要的能量來源，因此mtDNA直接影響ATP的合成，進(jìn)而影響與體內(nèi)能量代謝密切相關(guān)的重要經(jīng)濟(jì)性狀[27]。由此可見，mtDNA的遺傳變異可用來分析畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀核外基因效應(yīng)，并進(jìn)一步將其應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇來改良畜禽品種，提高動(dòng)物生產(chǎn)效率。產(chǎn)羔數(shù)是綿羊生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟(jì)性狀。線粒體是卵母細(xì)胞內(nèi)最多的細(xì)胞器，其mtDNA拷貝數(shù)變異及結(jié)構(gòu)突變累積可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP合成減少，從而影響卵母細(xì)胞質(zhì)量、受精能力及胚胎的發(fā)育潛能[28]。由此可見，mtDNA突變使線粒體結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生改變，從而影響線粒體代謝和氧化呼吸功能，直接影響ATP含量，從而影響卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和卵母細(xì)胞受精率[29]。牟天伊等[30]討論了卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)與卵母細(xì)胞質(zhì)量、胚胎發(fā)育的相關(guān)性，研究結(jié)果顯示，mtDNA突變可引起線粒體結(jié)構(gòu)、功能的改變，同時(shí)也與卵母細(xì)胞受精有關(guān)。產(chǎn)羔數(shù)性狀在核基因上的研究非常豐富，但線粒體DNA變異與產(chǎn)羔數(shù)性狀的關(guān)系研究較少。因此，本試驗(yàn)分析mtDNA編碼區(qū)及D-loop 區(qū)變異與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性具有重要意義。

mtDNA是細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)，共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈DNA具有結(jié)構(gòu)簡單、分子拷貝數(shù)高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、進(jìn)化速度快、分子質(zhì)量小、無組織特異性等特點(diǎn)[31]。Reicher等[23]在mtDNA編碼區(qū)序列發(fā)現(xiàn)的245個(gè)變異位點(diǎn)中，有26個(gè)是非同義突變，有8個(gè)序列在22個(gè)tRNA 中也出現(xiàn)了變異。本試驗(yàn)采用PCR結(jié)合DNA直接測序技術(shù)對試驗(yàn)綿羊多態(tài)性進(jìn)行檢測，并結(jié)合產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，5個(gè)品種試驗(yàn)綿羊群體共有309個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡約信息位點(diǎn)212個(gè)；試驗(yàn)綿羊群體在D-loop區(qū)共有264個(gè)變異位點(diǎn)，簡約信息位點(diǎn)194個(gè)。陳曉勇等[24]以杜泊、陶賽特、薩?？司d羊?yàn)檠芯繉ο?，通過線粒體基因組測序發(fā)現(xiàn)，杜泊羊的mtDNA編碼區(qū)存在25個(gè)突變位點(diǎn)，陶賽特羊mtDNA編碼區(qū)存在20個(gè)突變位點(diǎn)，薩福克羊mtDNA編碼區(qū)存在77個(gè)突變位點(diǎn)。本試驗(yàn)結(jié)果與陳曉勇等[24]的研究相比，mtDNA D-loop 區(qū)序列不編碼蛋白，因而該區(qū)域在進(jìn)化上受選擇壓力較小，表現(xiàn)出更為豐富的多態(tài)性。

本試驗(yàn)篩選出16個(gè)與產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)的變異位點(diǎn)并進(jìn)行分析。A1099T、T1112C、C13576T、T13837C和T13855C位點(diǎn)在XM與HM之間基因型分布均無顯著差異(P>0.05)，XM與MS、OT、OS、GT、GS之間基因型分布均有顯著性差異(P<0.05)。陳曉勇等[24]分析了薩福克綿羊mtDNA的17個(gè)變異位點(diǎn)，結(jié)果顯示，16S rRNA區(qū)域的A1099T、T1112C、T1932G、C2443T以及多肽編碼區(qū)的A3949G、A8039G、A8515G、A8779G、C13576T、T13837C、C13855T位點(diǎn)對產(chǎn)羔數(shù)影響顯著(P<0.05)。根據(jù)不同繁殖力綿羊變異位點(diǎn)基因型分布差異分析推測，A1099T、T1112C、C13576T、T13855C和T13837C位點(diǎn)對于小尾寒羊和湖羊產(chǎn)羔性狀有一定的影響，T15668C位點(diǎn)影響蒙古羊產(chǎn)羔數(shù)，T15445C、T15627C、T15657C、T15732C、G15977A、A16101G和C16429T位點(diǎn)影響歐拉羊產(chǎn)羔數(shù)，A15923G位點(diǎn)影響甘肅高山細(xì)毛羊產(chǎn)羔數(shù)。

在mtDNA分子中分編碼區(qū)和非編碼區(qū)。非編碼區(qū)即線粒體基因組的D-loop區(qū)，存在高度突變并控制著mtDNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄[31]。相比編碼區(qū)，D-loop區(qū)序列不編碼蛋白，是mtDNA的調(diào)控區(qū)域，但研究表明，它的突變與惡性腫瘤及動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀有關(guān)。近幾年，在腫瘤mtDNA突變的研究中，日益發(fā)現(xiàn)D-loop區(qū)也是很重要的熱點(diǎn)突變區(qū)域，D-loop區(qū)的突變可能是使線粒體功能紊亂既而促進(jìn)腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要因素[32]。Tsai等[33]研究表明，豬的mtDNA變異數(shù)與卵母細(xì)胞質(zhì)量有25%的相關(guān)性，發(fā)育正常卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)與16383位點(diǎn)變異水平正相關(guān)，該變異位點(diǎn)是mtDNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的調(diào)控區(qū)域，mtDNA單倍型影響豬的繁殖能力，可以作為一個(gè)標(biāo)記，以補(bǔ)充現(xiàn)有的選擇方法，識別高產(chǎn)豬。陳曉勇等[24]研究表明，杜泊羊mtDNA的13個(gè) 非同義突變對產(chǎn)羔數(shù)均無顯著影響，陶賽特綿羊mtDNA的9個(gè)非同義突變位點(diǎn)均與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)不顯著，薩?？司d羊中發(fā)現(xiàn)的14個(gè)變異位點(diǎn)與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)。本試驗(yàn)通過對試驗(yàn)綿羊群體變異位點(diǎn)與產(chǎn)羔性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，T15668C變異位點(diǎn)對蒙古羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著(P<0.05)，T15445C、T15627C、T15657C、T15732C、T15956C、G15977A和C16429T變異位點(diǎn)對歐拉羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著(P<0.05)，A15923G變異位點(diǎn)對甘肅高山細(xì)毛羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著(P<0.05)。陳曉勇[34]研究表示，mtDNA遺傳變異對產(chǎn)羔數(shù)性狀影響顯著(P<0.05)。Reicher等[23]研究Afec-Assaf母羊D-loop區(qū)和細(xì)胞色素b(Cytb)顯示，mtDNA多態(tài)性影響母羊的產(chǎn)羔數(shù)性狀，HB和HC單倍型顯著影響母羊的產(chǎn)羔數(shù)性狀。本研究顯示，Hap_2單倍型影響歐拉羊母羊產(chǎn)羔數(shù)，但通過從整體上分析所有試驗(yàn)綿羊單倍型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Hap_4型對綿羊產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響，而Hap_2和Hap_4單倍型的不同之處在T15657C位點(diǎn)(第3個(gè)堿基C-T)和T15956C位點(diǎn)(第7個(gè)堿基C-T)。試驗(yàn)綿羊群體在T15657C變異位點(diǎn)檢測到T→C突變，發(fā)生突變最多的是OT，最少的是OS；而T型個(gè)體數(shù)占比最高的是HM(93.62%)和XM(90.48%)，T型的OT個(gè)體數(shù)占比較低，為76.92%。在T15956C位點(diǎn)，各品種T型個(gè)體數(shù)占比從高到低依次是XM(52.38%)、HM(38.30%)、MT(23.81%)、OS(20.00%)、MS(15.22%)、GT(14.29%)、GS(12.50%)、OT(5.77%)；各品種C型個(gè)體數(shù)占比從高到低依次是OT(94.23%)、GS(87.50%)、GT(85.71%)、MS(84.78%)、OS(80.00%)、MT(76.19%)、HM(61.70%)、XM(47.62%)，本研究與Reicher等[23]的研究結(jié)果類似，都證實(shí)了mtDNA遺傳變異對綿羊產(chǎn)羔數(shù)性狀存在遺傳效應(yīng)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)篩選出16個(gè)與產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)的變異位點(diǎn)并進(jìn)行分析。在A1099T、T1112C、C13576T、T13837C和T13855C位點(diǎn)，HM與XM基因型分布基本一致。T15668C變異位點(diǎn)，MT與MS之間基因型分布有顯著性差異(P<0.05)，也對蒙古羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著(P<0.05)。在T15445C、T15627C、T15657C、T15732C、G15977A和C16429T位點(diǎn)，OS與OT之間基因型分布有顯著性差異(P<0.05)，也對歐拉羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著(P<0.05)。在A15923G位點(diǎn)，GT與GS之間基因型分布均有顯著性差異(P<0.05)，對甘肅高山細(xì)毛羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著(P<0.05)。Hap_2型顯著影響歐拉羊母羊產(chǎn)羔數(shù)，Hap_4對綿羊產(chǎn)羔數(shù)也具有一定的影響。