梁冰，嚴(yán)玉蘭

（1. 昆山市中醫(yī)醫(yī)院 呼吸科，江蘇 昆山 215300；2. 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院 呼吸科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

0 引言

小細(xì)胞肺癌（Small cell lung cancer，SCLC）是目前惡性程度較高、治療效果較差的腫瘤之一，溶瘤治療主要通過溶瘤病毒選擇性地感染靶細(xì)胞，不斷復(fù)制，最終摧毀宿主細(xì)胞[1]；新城疫病毒（Newcastle disease vires，NDV）是眾多溶瘤病毒中最常見且最具潛力的一種。相較于其他溶瘤病毒，NDV可以選擇性地殺死癌細(xì)胞，它在癌細(xì)胞中復(fù)制效率是正常細(xì)胞的1萬倍[2]。為此，我們將重組新城疫病毒rL-RVG感染至NCI-H446細(xì)胞株中，探討rL-RVG對SCLC的溶瘤作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料。NDV、rL-RVG（哈爾濱獸醫(yī)研究所）；人肺小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞株（中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞中心）；胎牛血清（WISENT公司）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco公司）；HRP-兔抗雞二抗（Earthox 公司）；FITC-山羊抗鼠二抗、Cy3-山羊抗雞二抗、RIPA裂解緩沖液（康為世紀(jì)公司）；PVDF膜（PALL公司）；顯影液（Millipore公司）；核熒光染料（Hoechst33342）、Triton X-100、MTT、（Sigma-Aldrich 公司）；（Santa Cruz公司）、兔抗人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）（ImmunoWay公司）；ECL增強(qiáng)型試劑盒（Amersham Bioseiences公司）

1.2 方法

1.2.1 免疫熒光法檢測病毒蛋白的表達(dá)[3-4]：將NCI-H446接種在24孔板內(nèi)蓋玻片上培養(yǎng)4 h，加入稀釋好的病毒液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，洗滌3次。用4%的多聚甲醛4℃固定。洗滌10 min×3次，用0.3%的TritonX-100作用8 min，3%BSA室溫封閉1h。洗滌3次，加入1∶150的雞抗NDV一抗或1∶100的小鼠抗RVG一抗，4℃過夜。洗滌3次。加入1∶300的Cy3-山羊抗雞二抗或1∶100的FITC-山羊抗鼠二抗，孵育1h。細(xì)胞核用0.2μmol/L Hoechst 33342作用30 min。封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 MTT法檢測病毒的抗增殖情況：用DMEM將病毒原液稀釋到10-1、10-2、10-3、10-4濃度，將NCI-H446種植96孔板上，每孔100 μL，恒溫箱過夜，第二天換DMEM維持液，在NDV和rL-RVG組分別加入相應(yīng)的病毒稀釋液，PBS為陰性對照組，設(shè)5個平行孔/組，調(diào)零孔為DMEM，培養(yǎng)24 h，加入20 μL MTT/孔，培養(yǎng)4h，用150 μL DMSO/孔溶解，搖床振蕩，酶標(biāo)儀上測定吸光度，重復(fù)實驗3次，計算細(xì)胞生長抑制率[5]。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡：NCI-H446接種至6孔板，用NDV病毒（10-3稀釋度）和、rL-RVG重組病毒（10-3稀釋度）、PBS分別感染24 h后，PBS洗2次，按照試劑盒說明操作，上機(jī)。每組均設(shè)同種型對照，Cell quest軟件獲取數(shù)據(jù)，Win MDI 2.9 軟件分析數(shù)據(jù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot法檢測凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)[6]：將NCI-H446種植于6孔板上，加入病毒液（10-3稀釋度）及PBS。培養(yǎng)24 h后提取蛋白。PBS沖洗3次，加入細(xì)胞裂解液100 μL/孔，置于冰上裂解20 min，收集細(xì)胞，12000 g/min離心15 min，取上清到新的EP管，按5∶1加20 μL loading buffer煮沸5 min后-20℃儲存?zhèn)溆?。蛋白樣?0 μL/孔上樣，電泳，80V電壓積聚蛋白，待Marker分開后調(diào)至120V。SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)至PVDF膜時間為90min。25℃下用5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗（1∶200）過夜。TBST洗10 min×3次后孵育HRP標(biāo)記的二抗（1∶1000）60 min，TBST洗10 min×3次，內(nèi)參為小鼠抗GAPDH（1∶10000），ECL發(fā)光劑在Typhoon9400掃描儀上掃描。掃描結(jié)果用北京賽制公司的LANE.1D軟件進(jìn)行灰度比值定量分析。重復(fù)3次后分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間數(shù)據(jù)的比較依據(jù)資料的性質(zhì)，采用t檢驗或方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光法檢測rL-RVG及NDV在NCI-H446的表達(dá)。rL-RVG及NDV分別感染NCI-H446細(xì)胞24 h后，在熒光顯微鏡下可見，rL-RVG組NDV可在NCI-H446細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，并且rL-RVG的感染效率較NDV高。

圖1 重組新城疫病毒rL-RVG及NDV感染NCI-446細(xì)胞的表達(dá)及轉(zhuǎn)染效率（×400）

2.2 rL-RVG和NDV分別感染NCI-H446細(xì)胞24h的細(xì)胞抑制率。稀釋不同濃度的rL-RVG和NDV均對NCI-H446細(xì)胞的生長具有一定的抑制作用，且病毒濃度越高，對癌細(xì)胞的抑制作用越高，其中rL-RVG對SCLC的抑制效果較強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 不同濃度的病毒感染NCI-H446細(xì)胞24h的生長抑制率

2.3 rL-RVG感染NCI-H446細(xì)胞后的細(xì)胞早期凋亡增多。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測病毒感染后的NCI-H446細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)rL-RVG組細(xì)胞早期凋亡較多，而NDV組和PBS組細(xì)胞早期凋亡較少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 重組新城疫病毒rL-RVG及NDV感染NCI-H446細(xì)胞24 h對細(xì)胞早期凋亡的影響

2.4 促凋亡蛋白caspase-3表達(dá)量增加。如圖4A所示，caspase-3在rL-RVG組表達(dá)最高，并且高于NDV和PBS組。加入caspase-3抑制劑后，caspase-3表達(dá)量下降，rLRVG組表達(dá)最低。

圖4 A rL-RVG及NDV感染NCI-H446細(xì)胞24 h后加入抑制劑前后凋亡蛋白caspase-3DE表達(dá)；圖4B 加入抑制劑前后的灰度值

3 討論

新城疫病毒隸屬禽副粘病毒屬，是一種主要感染禽類的雞瘟病毒。相對與其他病毒載體，NDV載體還有如多優(yōu)勢，首先NDV是一種鳥類病原體，而我們選取的NDV LaSota為弱毒株，這就避免了病毒對人類的固有免疫力。其次，NDV能夠穩(wěn)定在不影響本身病毒特性的同時穩(wěn)定表達(dá)外源基因。例如rL-RVG具有安全、穩(wěn)定表達(dá)的特點。多項研究發(fā)現(xiàn)其NDV有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長作用，重組新城疫病毒比單獨用NDV的腫瘤凋亡率顯著升高或效果顯著。NDV誘導(dǎo)的溶瘤機(jī)制之一是可以通過NDV病毒不斷擴(kuò)增，直接脹破腫瘤細(xì)胞，另一種是通過誘導(dǎo)凋亡途徑實現(xiàn)，有實驗研究發(fā)現(xiàn)NDV-HN能致人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，可以誘導(dǎo)Bcl-2下降[7]。謝曉娟等研究發(fā)現(xiàn)，NDV能夠誘導(dǎo)NCI-H1299細(xì)胞的凋亡，可能與微絲骨架密切相關(guān)的RhoA/ROCK信號通路有關(guān)[8]。

本實驗發(fā)現(xiàn)rL-RVG能夠較強(qiáng)的抑制NCI-H446細(xì)胞株的生長，隨著病毒濃度降低，抑制作用也減弱；免疫熒光法檢測結(jié)果顯示rL-RVG及NDV均能在NCI-H446內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，RVG能夠提高NDV的轉(zhuǎn)染效率，從而促進(jìn)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，發(fā)揮溶瘤作用[9]。而細(xì)胞死亡主要通過細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡兩種方式，其中本實驗的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明相較PBS組，rL-RVG、NDV組細(xì)胞早期凋亡數(shù)增多，且rL-RVG組較NDV組細(xì)胞早期凋亡增多（P<0.05），提示了rL-RVG的溶瘤作用可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)。我們采用Western blot法檢測了caspase-3的表達(dá)，結(jié)果顯示，rL-RVG組caspase-3表達(dá)量最高，加入抑制劑后，caspase-3蛋白表達(dá)量減弱，由此可以證明，rL-RVG誘導(dǎo)的凋亡可能是caspase途徑依賴的，并且rL-RVG的caspase凋亡途徑作用更明顯。

綜上所述，rL-RVG可能是通過RVG增加NDV病毒的轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而增加了其抗增殖及促凋亡的作用，發(fā)揮較強(qiáng)的溶瘤作用。