涂容芳，何振華，譚小武，陳 哲，羅 卿，陳 林，陳 偉，謝 莉，楊艷霞

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，湖南 衡陽 421001)

支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是一種全球常見、多發(fā)的慢性氣道炎性反應(yīng)性疾病，絕大部分哮喘患者可經(jīng)吸入性糖皮質(zhì)激素治療得到控制，但仍有部分哮喘患者需大劑量吸入甚至口服糖皮質(zhì)激素才能控制或仍未獲控制，稱之為重癥哮喘(Severe asthma,SA)。最新流行病學(xué)調(diào)查研究表明全球約有3 億成年哮喘患者[1-2],重癥哮喘發(fā)生率高達(dá)5%～10%，其產(chǎn)生的醫(yī)療負(fù)擔(dān)已超過哮喘總費(fèi)用的 50%，給人們造成了極大的痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，探討一種能早期預(yù)測SA 的簡便指標(biāo)，以盡早識別 SA 患者并予以準(zhǔn)確干預(yù)治療，對改善患者預(yù)后具有重要意義。本研究擬通過研究重癥哮喘患者、普通哮喘患者及健康對照人群外周血組蛋白去乙?；?(HDAC2)、白細(xì)胞介素-17A(IL-17A)表達(dá)水平的差異及重癥哮喘患者中兩者的相關(guān)性，探討其對重癥哮喘早期診斷及激素治療是否敏感的預(yù)測價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料：選擇2018年1月～2019年1月在我院治療、隨訪的哮喘患者60例為研究對象，其中重癥哮喘患者30例設(shè)為重癥哮喘組，普通哮喘患者30例設(shè)為普通哮喘組。重癥哮喘組中男16例，女14例，年齡22～63歲，平均(40.1±8.52)歲；普通哮喘組中男13例，女17例，年齡20～60歲，平均(39.2±7.68)歲。選取同期在本院進(jìn)行健康體檢的30例健康志愿者作為對照組，其中男18例，女12例，年齡18～60歲，平均(40.3±7.56)歲。三組研究對象的性別構(gòu)成比、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已獲南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)實(shí)施，全部研究對象均知情同意。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：①哮喘診斷明確，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組《支氣管哮喘防治指南》和 GINA 2015；②年齡 18～65歲，性別不限。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～65歲，性別不限；②無變態(tài)反應(yīng)性疾病，無吸煙史，無哮喘病史、癥狀及體征，近2周內(nèi)無呼吸道感染史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①認(rèn)知能力低影響自評量表填寫者；②有嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙，或其他感染性疾?。虎塾袊?yán)重氣胸不能進(jìn)行肺功能檢測者。

1.2方法

1.2.1受試者血清HDAC2、IL-17A水平檢測：于清晨空腹時(shí)采集肘靜脈全血4 ml置于未加抗凝劑的試管中，標(biāo)本采集后在室溫下靜置2 h，離心機(jī)離心后(3 000 r/min)取上清分裝，并將標(biāo)本放于-20℃冰箱儲存待測。采用ELLSA法測定血清HDAC2(試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司)及IL-17A(試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司)水平，具體步驟嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.2肺功能檢測最大呼氣峰流速(PEF)值、1 s用力呼氣容積(FEV1)及最大呼氣中期流量(MMEF )：患者靜息20 min后抬頭挺胸，手持儀器，口含咬嘴。囑患者深吸氣，然后用爆發(fā)力吹氣，吹氣時(shí)儀器右側(cè)指示燈會快速閃爍，保持穩(wěn)定吹氣6 s至燈滅則吹氣完成。采用德國Master Screen肺功能測試系統(tǒng)連續(xù)檢測3次肺通氣功能，所檢測到的結(jié)果中若用力肺活量(FVC)和FEV1的變異度均<5%則判定為合格，最終結(jié)果取3次結(jié)果中的最佳值記錄。

2 結(jié)果

2.1三組受試者血清HDAC2表達(dá)對比：重癥哮喘組患者外周血血清中HDAC2的水平低于普通哮喘組及對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，普通哮喘組和對照組外周血血清中HDAC2表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2三組受試者外周血血清中IL-17A表達(dá)對比：重癥哮喘患者外周血血清中IL-17A的水平高于普通哮喘組及對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，普通哮喘組和對照組外周血血清中IL-17A表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 三組受試者外周血中HDAC2、IL-17A表達(dá)水平對比

2.3三組受試者PEF、FEV1及MMEF表達(dá)對比：重癥哮喘組和普通哮喘組患者PEF、FEV1及MMEF水平均低于對照組，以重癥哮喘組最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組受試者PEF、FEV1及MMEF水平對比

2.4重癥哮喘組患者肺功能、HDAC 2、IL-17A之間相關(guān)性分析：重癥哮喘患者肺功能PEF、FEV1及MMEF與其外周血中HDAC2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.750、0.782、0.708，P<0.05)，與IL-17A表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r= -0.719、-0.748、-0.711，P<0.05)，HDAC2與IL-17A之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.892，P<0.05)。見表3。

表3 重癥哮喘組患者肺功能與HDAC2、IL-17A之間相關(guān)性分析

3 討論

支氣管哮喘特別是重癥哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，既往研究認(rèn)為哮喘的主要發(fā)病機(jī)制是TH1/TH2細(xì)胞免疫失衡[3]，即抗原經(jīng)過樹突狀細(xì)胞等呈遞后誘導(dǎo)T細(xì)胞分化成為TH2細(xì)胞，分泌TH2型炎性細(xì)胞因子如IL-4、IL-5和IL-13，這些炎性因子導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞募集，從而誘導(dǎo)哮喘氣道高反應(yīng)性和黏液高分泌。然而，最近的臨床研究發(fā)現(xiàn)40%以上的哮喘以中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)浸潤為主[4-5]，同時(shí)約有10%～15%重度哮喘患者對吸入糖皮質(zhì)激素治療不敏感，存在激素抵抗(GC 抵抗)[6]，激素抵抗機(jī)制成為近年來研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來已有研究表明：GR SNPs、GR 修飾(磷酸化、亞硝基化、泛素化、巰基化、氧化還原應(yīng)激等)、GR-α基因表達(dá)減少、GR-β表達(dá)增加、GCs 細(xì)胞外排增加、促炎轉(zhuǎn)錄如JNK/AP-1、JAK3/STAT5、NF-κB、HDAC2、IL-17A等過度激活及促炎轉(zhuǎn)錄因子過度表達(dá)都可能影響糖皮質(zhì)激素的生物學(xué)效應(yīng)，引起 SA 對激素抵抗[7-10]。本研究擬通過研究重癥哮喘患者、普通哮喘患者及健康對照人群外周血HDAC2、IL-17A表達(dá)水平的差異及重癥哮喘患者中兩者的相關(guān)性，探討它們對重癥哮喘早期診斷及激素治療是否敏感的預(yù)測價(jià)值。

組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)最初是由 Taunton 等[11]人1996 年發(fā)現(xiàn)的一類蛋白酶，其在修飾染色體結(jié)構(gòu)和調(diào)控遺傳基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)等方面發(fā)揮了重要的作用，HDACs 共有四大類，組蛋白去乙?；?2(HDAC2) 是第 I 類組蛋白去乙酰化酶，含有一個(gè)保守的、約 400 個(gè)氨基酸殘基的催化結(jié)構(gòu)域，由 1 個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)、1 個(gè)鋅離子結(jié)合位點(diǎn)和 2 個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)成胞核內(nèi)的一種對染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要作用的蛋白酶。Trevor 等[12]報(bào)告糖皮質(zhì)激素可通過募集HDAC2使GR去乙?；?，GC 與核因子κB(NF-κB)結(jié)合并激活 AP-1形成 GC-NFκB/AP-1 復(fù)合體，抑制促炎因子轉(zhuǎn)錄，促炎因子合成減少，炎性反應(yīng)減輕或受抑；此外，HDAC2 可使組蛋白去乙酰化，組蛋白與帶負(fù)電荷的促炎性反應(yīng)因子 DNA結(jié)合更緊密，促炎性反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子不能與 DNA 特異位點(diǎn)結(jié)合，轉(zhuǎn)錄受到抑制，表達(dá)下調(diào)，從而發(fā)揮抗炎作用。當(dāng) HDAC2 表達(dá)下調(diào)時(shí)，可能引起激素抵抗，抗炎作用減弱。Hao M等在6周齡BALB/c小鼠哮喘模型的研究中發(fā)現(xiàn)，暴露于吸煙組(SEA)小鼠肺組織活檢標(biāo)本中 HDAC2 表達(dá)較卵清蛋白(OVA)激發(fā)哮喘組小鼠低[13]。Ito等在40名受試者的支氣管黏膜活檢組織中也發(fā)現(xiàn) HDAC2 表達(dá)水平與重癥哮喘患者的激素療效有關(guān)[14]。白細(xì)胞介素-17(IL-17)是 Th17 細(xì)胞分泌的一種炎性反應(yīng)介質(zhì)[15]，Semlali 等發(fā)現(xiàn) IL-17A 可促進(jìn)GR-β 在外周血單核細(xì)胞中表達(dá)增多，使 GR-β/GR-α 的比例倒置，最終產(chǎn)生激素抵抗[16]。以中性粒細(xì)胞浸潤為主的哮喘，對糖皮質(zhì)激素治療的反應(yīng)差，而在募集中性粒細(xì)胞的過程中，IL-17 起著至關(guān)重要的作用[17-18]。 高水平的 IL-17 與中性粒細(xì)胞氣道炎性反應(yīng)的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且這類哮喘患者在糖皮質(zhì)激素治療后中性粒細(xì)胞的數(shù)量并不降低，因此IL-17不僅可誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌造成氣道重塑，還在重癥哮喘激素抵抗中起了重要作用[19]。SA嚴(yán)重程度常規(guī)采用肺功能評估，其中PEF表示最大呼氣流速率是判斷哮喘嚴(yán)重度最簡便可靠的客觀手段，當(dāng)PEF<0.2 L/min提示氣道存在嚴(yán)重阻塞；而FEV1、MMEF是反映氣道阻力最常用的指標(biāo)，當(dāng)FEV1<1.0 L時(shí)提示病情嚴(yán)重，當(dāng)FEV1<0.5 L時(shí)則有發(fā)生窒息的可能。但肺功能檢查操作復(fù)雜還對患者要求較高，如遇SA急性發(fā)作時(shí)不僅會因患者病情重配合不佳而無法準(zhǔn)確反映病情，還存在病情加重甚至窒息、死亡風(fēng)險(xiǎn)，因此尋求簡單、無創(chuàng)、高特異性檢查指標(biāo)或方法意義重大。本研究表明：重癥哮喘患者血清HDAC2水平顯著低于普通哮喘患者和對照組人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且與其PEF、FEV1及MMEF呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。重癥哮喘患者血清IL-17A水平顯著高于普通哮喘患者(P<0.05)和對照組人群(P<0.05)，且與其PEF、FEV1及MMEF呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。而普通哮喘與對照組外周血血清中HDAC2、IL-17A水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，進(jìn)一步提示外周血 HDAC2、IL-17A水平作為評估哮喘表型的生物標(biāo)志是可行的，因其簡單、方便和安全，在預(yù)測激素治療效果和識別“真”“假”重癥哮喘患者方面有較好的臨床運(yùn)用前景。

綜上所述，重癥哮喘患者的外周血中存在HDAC2、IL-17A表達(dá)增加，并且HDAC2、IL-17A表達(dá)水平與患者的肺功能密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚。最近的一項(xiàng)研究表明，敲除 HDAC2 基因后，能使屋塵螨誘導(dǎo)的氣道炎性反應(yīng)及黏液分泌進(jìn)一步加重，并能調(diào)控 Th17 細(xì)胞分化促進(jìn) IL-17A的分泌，而敲除 IL-17 基因或使用 IL-17A 中和抗體后能使由 HDAC2 基因缺失誘導(dǎo)的氣道炎性反應(yīng)得到緩解[20]，顯示 HDAC2 可以通過抑制氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A 的表達(dá)來減弱氣道炎性反應(yīng)。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道IL-17A 可在氣道上皮中誘導(dǎo)糖皮質(zhì)激素不敏感，其機(jī)制可能與 PI3K 信號通路激活導(dǎo)致 HDAC2 活性降低有關(guān)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)重癥哮喘患者中HDAC2、IL-17A表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，由此推測HDAC2、IL-17A參與重癥哮喘的機(jī)制可能與下調(diào)HDAC2、上調(diào)IL-17A參與激素抵抗有關(guān)。