羅海艷 陸清 謝康 鄒永毅 黃婷 劉艷秋

江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心（南昌330006）

地中海貧血（地貧）是一種高發(fā)于中國南方地區(qū)的血液系統(tǒng)常染色體隱性疾病，主要類型有α-地貧和β-地貧［1-2］。根據(jù)受累的α-珠蛋白基因個數(shù)，可將α-地貧分為靜止型、輕型、中間型和重型四類。血紅蛋白H（HbH）病是一組中間型α-地貧，患者由于缺失3 個α-珠蛋白基因或因缺失2 個α-珠蛋白基因且復(fù)合α-珠蛋白基因非缺失突變導(dǎo)致α-鏈合成顯著減低，多余的β-鏈聚合為四聚體（β4）即HbH。四聚體易解離并沉積形成包涵體，引起紅細胞破壞發(fā)生慢性溶血性貧血，是可存活的α-地貧中最嚴重的一種［3-5］。HbH 病是一種分子遺傳學(xué)機制異質(zhì)性較大的疾病，其基因變異類型與頻率存在著明顯的種族與地域差異［6-7］。此外，HbH 患者臨床表型個體差異較大，貧血程度各異，通常表現(xiàn)為輕度至中度貧血，輕者血紅蛋白可為正常，重者可出現(xiàn)肝脾腫大、骨骼畸形與發(fā)育異常，甚至需依賴輸血維持生命［8］。目前，在我國一些地貧高發(fā)省份如廣西、廣東、海南等，已有不同人群HbH 病基因型頻率以及血液學(xué)特點相關(guān)研究，為當(dāng)?shù)氐牡刎氝z傳咨詢與出生缺陷防控提供依據(jù)［9-11］。江西地區(qū)地處中國南方，是國家地貧防控的重點區(qū)域，目前尚缺乏該地區(qū)HbH 病的基因型頻率與臨床表型相關(guān)研究。本研究對江西地區(qū)育齡人群HbH 患者的基因型及血液學(xué)表型進行分析，同時為符合地貧產(chǎn)前診斷指征的HbH 患者提供產(chǎn)前診斷，不僅可為江西省HbH 病的臨床遺傳咨詢提供指導(dǎo)，對出生缺陷防控的實踐也具有重要參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇自2017年3月至2019年12月在江西省婦幼保健院就診的育齡受檢者9 883 例（年齡18 ～46 歲），研究對象主要來自于常規(guī)體檢、孕前檢查、產(chǎn)前檢查、優(yōu)生遺傳咨詢、輔助生殖術(shù)門診，所有受檢者均否認近1年內(nèi)有輸血史，所有檢測均獲得受檢者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 血常規(guī)檢測采用邁瑞2000 血液分析儀分析患者血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、平均紅細胞體積（mean corpuscular volume，MCV）、平均血紅蛋白含量（mean corpuscular volume，MCH）等參數(shù)。成人MCV 參考區(qū)間為82 ～92 fL，MCH 參考區(qū)間為27 ～31 pg。當(dāng)男性Hb ＜120 g/L 或女性＜110 g/L，MCV ＜82 fL 或/且MCH ＜27 pg 時可判斷為小細胞低色素性貧血。

1.2.2 血紅蛋白電泳檢測采用法國Sebia 公司生產(chǎn)的CAPPILLARY S2 FLEX PIERCING 全自動毛細管電泳儀及配套試劑行血紅蛋白電泳檢測，分析患者HbA2、HbH、Hb Bart′s 帶含量，成人HbA2值的參考區(qū)間為2.2%～3.5%。

1.2.3 介入性產(chǎn)前診斷穿刺于合適孕周在B 超引導(dǎo)下行介入性穿刺術(shù)采集胎兒標(biāo)本，排除胎兒標(biāo)本中母體細胞污染后行地貧基因檢測。絨毛膜穿刺術(shù)的適用孕周為11 ～13+6周，羊膜腔穿刺術(shù)為18 ～28 周，臍帶血穿刺術(shù)為＞28 周。

1.2.4 外周血及羊水gDNA提取嚴格按照Qiagen血液組織DNA 提取試劑盒（Qiagen，德國）說明書提取外周血與羊水細胞gDNA，使用微量紫外分光光度計（Nanodrop 2000）測定DNA 濃度并調(diào)節(jié)濃度至50 ～100 ng/μL 備用。

1.2.5 常規(guī)地貧基因檢測使用Gap-PCR 結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測α-珠蛋白基因3 種常見缺失（--SEA/、-α3.7/、-α4.2/），采用PCR 結(jié)合反向斑點雜交法（DOT-RDB）檢測α-珠蛋白基因的3 種常見點突變（αWSα/、αCSα/和αQSα/）及β-珠蛋白基因的17 種常見點突變，即CD41-42（-TTCT）、CD43（G→T）、IVS-II-654（C→T）、-28（A→G）、-29（A→G）、-30（T→C）、-32（C→A）、CD71-72（+A）、βE（GAG→AAG）、CD17（A→T）、CD31（-C）、CD14-15（+G）、CD27/28（+C）、IVS-I-1（G→C）、IVS-I-5（G→C）、CAP（-AAAC）和IntM（ATG.→AGG），PCR 反應(yīng)體系及擴增條件嚴格按照試劑盒（亞能生物技術(shù)公司，深圳）進行操作。

1.2.6 罕見地貧基因檢測對經(jīng)血紅蛋白電泳提示HbH 帶而常規(guī)地貧基因檢測為非HbH 基因型的患者，行進一步罕見地貧基因檢測。使用Gap-PCR 結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測HKαα、--THAI（泰國型）、anti4.2、-α27.6、-α21.9、α fusion gene（α融合基因）等罕見α-地貧，檢測試劑盒購自深圳亞能生物技術(shù)有限公司。使用PCR 結(jié)合Sanger 測序的方法檢測α2 與α1 基因上的罕見點突變或新突變，引物序列參照徐湘民《地中海貧血預(yù)防控制操作指南》［12］。

1.3 妊娠結(jié)局隨訪對行產(chǎn)前診斷的孕婦行妊娠結(jié)局隨訪，對出生的新生兒定期行血常規(guī)結(jié)果隨訪。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用Microsoft Excel 2003 軟件對基因型與血液學(xué)檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 江西地區(qū)育齡HbH患者基因型分析9 883例育齡受檢者中共檢出34例HbH患者，共計8種基因型，檢出率為0.34%（34/9 883）。其中缺失型HbH患者31例（91.2%），非缺失型HbH患者3例（8.8%）。按是否合并β-地貧，可將缺失型HbH 患者分為單純性HbH 病與合并β-地貧HbH 病兩類。其中單純性缺失型HbH 患者共28 例，19 例基因型為-3.7α/--SEA（67.9%），9 例基因型為-4.2α/--SEA（32.1%）；合并β-地貧缺失型HbH 病患者3 例，其基因型分別為-3.7α/--SEA 合并β-地貧CD41-42 雜合突變，-3.7α/--SEA 合并β-地貧IVS-II-654 雜合突變，以及αQSα/--SEA 合并β-地貧CD41-42 雜合突變。3 例非缺失型HbH 患者基因型分別為αWSα/--SEA，CSα/--SEA 與國內(nèi)首次報道的非缺失型αCD61（AAG ＞TAG）α/--SEA，江西地區(qū)34 例育齡HbH 患者的基因型分析見表1。

表1 江西地區(qū)34 例育齡HbH 患者的基因型構(gòu)成及頻率Tab.1 Genotypes and frequency of 34 patients with HbH disease in Jiangxi province

2.2 34例HbH患者血液學(xué)表型分析血常規(guī)結(jié)果顯示34 例HbH 患者均表現(xiàn)出小細胞低色素的血液學(xué)特點，MCV與MCH參數(shù)較參照值相比明顯降低，其MCV值為（62.61±9.86）fL（范圍為48.3 ～71.6 fL），MCH 值為（17.4 ± 2.1）pg（范圍為13.8 ～21 pg），不同基因型之間MCV與MCH值存在一定差異。34例HbH 患者除1 例HbH-WS 女性Hb 值正常外，其余33 例HbH 患者貧血程度表現(xiàn)出個體差異，其Hb 值介于71 ～117 g/L之間，呈輕度貧血者12例（36.4%），呈中度貧血者21 例（63.6%）。血紅蛋白電泳結(jié)果顯示31 例單純性HbH 患者HbA2 值降低，為（1.35±0.25）%，范圍為0.7%～1.8%，表現(xiàn)出α-地貧血液學(xué)特點，而3 例合并β-地貧HbH 患者經(jīng)血紅蛋白電泳檢測HbA2 值均升高（＞3.5%），僅表現(xiàn)出β-地貧的特點而掩蓋了α-地貧的血液學(xué)特征。34 例HbH患者中僅有30例經(jīng)血紅蛋白電泳出現(xiàn)HbH帶，其含量為（6.8±1.2）%，范圍為2.1%～11.9%，4例未出現(xiàn)HbH 條帶的患者分別為WS-HbH 病1 例，合并β-地貧HbH 病3 例；僅23 例患者經(jīng)血紅蛋白電泳出現(xiàn)Hb Bart′s 帶，其含量為（1.0 ± 0.1）%，范圍為0.3%～2.0%；HbH 與Hb Bart′s 條帶的含量未表現(xiàn)出與基因型或貧血程度的明顯相關(guān)性。對同一基因型的HbH 患者而言，整體上女性Hb 值明顯低于男性，貧血程度比男性嚴重，這可能與女性的妊娠或營養(yǎng)等生理狀態(tài)相關(guān)；而相同HbH 基因型的女性患者與男性患者相比，其MCV 值、MCH 值及HbA2值與性別無明顯相關(guān)性。由于本研究中不同基因型的育齡HbH 患者病例數(shù)差異較大，未對不同基因型之間的血液學(xué)表型差異行統(tǒng)計學(xué)分析。34 例HbH 患者的基因型及相關(guān)血液學(xué)表型詳見表2。

表2 34 例HbH 患者的基因型與血液學(xué)表型Tab.2 Genotypes and hematological parameters of 34 patients with HbH disease

2.3 HbH患者產(chǎn)前診斷結(jié)果分析對34例HbH 患者的配偶行地貧基因檢測，發(fā)現(xiàn)有5 對夫妻為同型地貧攜帶者，3 對為同型α-地貧攜帶者，2 對為同型β-地貧攜帶者，符合地貧產(chǎn)前診斷指征。產(chǎn)前診斷結(jié)果顯示1 例胎兒為Hb Bart′s 水腫胎，其基因型為--SEA/--SEA，1 例胎兒為重型β-地貧，其基因型為βIVS-II-654β-28，1 例胎兒為缺失型HbH 病，其基因型為-3.7α/--SEA，其余2 例胎兒分別為α-地貧與β-地貧攜帶者，5 個行地貧產(chǎn)前診斷的家系信息及產(chǎn)前診斷結(jié)果見表3。

表3 行地貧產(chǎn)前診斷的5 個家系Tab.3 Five families with prenatal diagnosis of thalassemia

2.4 妊娠結(jié)局隨訪家系1 與家系2 中的2 例孕婦選擇終止妊娠，其余3 個家系選擇繼續(xù)妊娠。胎兒出生后進行隨訪，3 例胎兒均足月順產(chǎn)，阿氏評分為10 分。家系3 中胎兒6月齡血常規(guī)結(jié)果示Hb 值為107 g/L，MCV 為72 fL，MCH 為24 pg，呈輕度小細胞低色素貧血，家系4 中胎兒6月齡體檢時血常規(guī)結(jié)果未見異常，家系5 中胎兒6月齡體檢時血常規(guī)結(jié)果示Hb 值為120 g/L，MCV 為70 fL，MCH為25 pg，僅表現(xiàn)出小細胞低色素而無貧血的血液學(xué)特點。后期將對上述5 個家系繼續(xù)隨訪。

3 討論

地中海貧血是一種隨地理區(qū)域與種族不同而存在明顯基因型差異的疾病，HbH 病作為一種可存活的最嚴重的α-地貧，在不同的α-地貧高發(fā)地區(qū)具有其獨特的發(fā)生率與基因突變譜。此外，HbH 病分子基礎(chǔ)異質(zhì)性高，不同基因型的個體、相同基因型的不同個體、甚至同一個體在不同階段的貧血程度均有較大差異，這給臨床遺傳咨詢帶來了很大的困難。江西省位于中國南部，是國家地貧防控的十個重點省份之一。HbH 病在該地區(qū)人群中也有一定的發(fā)生率［13］，但目前尚缺乏關(guān)于該地區(qū)HbH 病的基因型頻率與血液學(xué)分析的研究，因此對該地區(qū)育齡人群進行HbH 病的基因檢測與遺傳咨詢至關(guān)重要。

本研究針對9 883例大樣本量的育齡受檢者進行地貧基因檢測，檢出江西地區(qū)育齡人群HbH病的發(fā)生率約為0.34%（34/9 883）。與廣西［9］、廣東［14-15］、海南［16］、云南［17］等地的發(fā)生率相比，明顯低于上述幾個區(qū)域。在基因型頻率方面，江西省缺失型HbH病-α3.7/--SEA 與-α4.2/--SEA 所占比例明顯高于非缺失型，與相鄰的廣東與福建兩省相似，而與廣西地區(qū)差異較大。在黃雅莉等［18］關(guān)于廣東湛江地區(qū)HbH 病的研究中，該地區(qū)缺失型HbH 頻率均高于非缺失型HbH；在付春云等［19］對廣西地區(qū)HbH病的研究中，最常見的基因型為-α3.7/--SEA，其次為αCSα/--SEA，非缺失型αCSα/--SEA 發(fā)生率高于缺失型-α4.2/--SEA。此外，江西地區(qū)也具有其獨特的HbH病基因突變譜，如本研究中檢出了目前國內(nèi)尚未報道過的αCD61（AAG＞TAG）α/--SEA 基因型。隨著后續(xù)樣本量的擴大，可能檢出更多具有地區(qū)特異性的HbH 基因型。

以往研究［20］認為，基因型為-α3.7/--SEA 或-α 4.2/--SEA 的個體，臨床表現(xiàn)呈輕度到中度貧血，而基因型為αCSα/--SEA、αQSα/--SEA 的個體較-α3.7/--SEA 及-α4.2/--SEA 個體相比可表現(xiàn)為更嚴重的貧血，對于基因型為αWSα/--SEA 的個體，雖然為3 個α-基因受累的HbH 病類型，但此類患者一般不貧血或僅為輕度貧血。在本研究中，除1 例αWSα/--SEA女性HbH 患者Hb 值正常，其余患者均由基因型、年齡、性別等因素不同而表現(xiàn)出不同程度的小細胞低色素貧血，與既往研究中HbH 患者的臨床表型相似。33 例有貧血表型的HbH 患者中，輕度貧血者12 例（36.4%），中度貧血者21 例（63.6%），表明在育齡人群HbH 患者的貧血程度主要為中度貧血，少部分表現(xiàn)出輕度貧血。對同一HbH 基因型的患者而言，整體上女性貧血比男性嚴重，可能與女性的特殊生理因素或妊娠因素有關(guān)。此外，單純性HbH 患者HbA2 值降低（＜2.2%），表現(xiàn)出α-地貧特點，而合并有β-地貧的HbH 患者HbA2 值升高（＞3.5%），僅表現(xiàn)出典型的β-地貧而掩蓋了α-地貧血液學(xué)特征。這提示了對血液學(xué)提示HbA2 值升高的受檢者，一定要同時檢測α-地貧避免漏檢；30 例HbH 患者經(jīng)血紅蛋白電泳后出現(xiàn)HbH 帶，4例HbH者電泳后未出現(xiàn)HbH帶。4例未出現(xiàn)HbH條帶的患者中，1 例WS-HbH 患者由于未表現(xiàn)出貧血而無HbH 條帶，3 例合并β-地貧的HbH 患者可能由于攜帶了β-地貧而導(dǎo)致β4 聚合體含量降低，血紅蛋白電泳后未出現(xiàn)HbH 條帶。這提示基于HbH 條帶等血液學(xué)指標(biāo)篩查HbH 病可能存在漏檢，其診斷需依賴基因檢測。臨床上，HbH 患者的配偶必須行地貧基因檢測，因為僅通過篩查配偶血常規(guī)與血紅蛋白電泳無法評估該家庭生育嚴重HbH 患兒的風(fēng)險。本研究中行產(chǎn)前診斷的5 個家系中，胎兒為重型α-地貧與重型β-地貧的兩個家庭選擇了終止妊娠。胎兒基因型為-α3.7/--SEA 的家庭在充分知情前提下，選擇繼續(xù)妊娠，建議父母對其定期行血常規(guī)檢查監(jiān)測貧血并特殊護理，以及成年后婚育時進行遺傳咨詢。其余2 例胎兒為α-與β-地貧攜帶者的家庭，建議其成年后婚育時進行遺傳咨詢。

本研究仍然存在一定的局限性。首先，要系統(tǒng)地對江西地區(qū)育齡HbH 患者進行基因型頻率分析，尚有待更大規(guī)模受檢者樣本量的積累；其次，在檢測方法上，采用高通量捕獲測序（next generation sequencing，NGS）結(jié)合Gap-PCR 可更有效地檢測出罕見HbH 病，而在本研究中，僅基于患者血紅蛋白電泳出現(xiàn)HbH 帶的血液學(xué)特點時，才對受檢者行罕見地貧基因檢測，可能存在漏檢罕見HbH患者的情況。

綜上，本研究首次報道了江西地區(qū)育齡HbH患者的發(fā)生率與基因型構(gòu)成及臨床表型，發(fā)現(xiàn)了目前國內(nèi)尚未報道過的αCD61（AAG＞TAG）α/--SEA 基因型，豐富了江西地區(qū)地中海貧血的基因突變譜；同時為有生育中、重型地貧患兒的家庭提供產(chǎn)前診斷，為育齡人群HbH 病的遺傳咨詢及后續(xù)產(chǎn)前診斷提供了重要的參考價值，對完善出生缺陷防控具有重要意義。