鄭備紅 孫艷 邱淑敏 陳曉菁 杜生榮 楊春梅

1福建省婦幼保健院，福建醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（福州350001）；2福建省生殖醫(yī)學(xué)中心（福州350001）

遺傳性痙攣性截癱（hereditary spastic paraplegias，HSP）是一組具有高度臨床和遺傳異質(zhì)性的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾?。?-2］，發(fā)病率約為1.8/100 000［3］。根據(jù)其臨床表型，HSP 可分為單純型和復(fù)雜型，單純型HSP 主要臨床特征為漸行性雙下肢痙攣性肌無力、肌張力增高、腱反射活躍亢進(jìn)及痙攣步態(tài)；復(fù)雜型HSP 除了表現(xiàn)出痙攣性截癱的癥狀外，還可伴有其他神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀，如小腦共濟(jì)失調(diào)、智力遲鈍、癲癇、耳聾、視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)萎縮、肌肉萎縮、皮膚病和周圍神經(jīng)病等［4-6］。HSP 遺傳方式有常染色體顯性遺傳（autosomal dominant，AD），常染色體隱性遺傳（autosomal recessive，AR）和X連鎖遺傳（X-linked，XL），也可見母系遺傳（maternal inheritance）（或線粒體相關(guān)遺傳）［7-8］，其中以AD-HSP最為常見。截止目前，已報(bào)道的HSP亞型有70 多種，并已鑒定出超過80 個(gè)基因與HSP 相關(guān)聯(lián)，根據(jù)其基因型被發(fā)現(xiàn)的順序命名為SPG1-77［9-13］。

中國人群AD-HSP 主要以痙攣性截癱類型4（SPG4）和痙攣性截癱類型3A（SPG3A）為主［14］。AD-HSP 常見致病基因有SPAST、ATL1、REEP1 和KIF5A 等［13-14］。典型的SPG4 發(fā)病年齡都在青少年或成年后發(fā)病，并且進(jìn)展緩慢。而SPG3A 主要表現(xiàn)為單純型HSP，極少數(shù)患者表現(xiàn)為復(fù)雜型HSP，該病發(fā)病年齡主要集中于兒童時(shí)期（＜10 歲），ATL1（OMIM182600）基因變異是引起SPG3A 型主要致病原因。本研究應(yīng)用全外顯子測(cè)序技術(shù)在一個(gè)三代遺傳性痙攣性截癱家系中鑒定了一個(gè)ATL1 基因雜合錯(cuò)義突變c.715C ＞T，Sanger 測(cè)序驗(yàn)證該突變?cè)诩蚁抵斜憩F(xiàn)出基因型與表型共分離，明確致病突變可為家系成員提供準(zhǔn)確可靠的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象本研究家系來自福州（圖1），連續(xù)三代發(fā)病，共4 名患者，其中女性患者2 名，男性患者2名，先證者（Ⅳ：13）為35歲女性，自幼雙下肢便開始出現(xiàn)僵硬、活動(dòng)不便、行走無力，主要癥狀表現(xiàn)為雙下肢肌張力增高、腱反射活躍亢進(jìn)、病理征陽性，行走呈剪刀步態(tài)，且癥狀隨著年齡增長(zhǎng)呈進(jìn)行性加重，能緩慢獨(dú)立行走，患者智力正常，精神發(fā)育正常，余未見異常，符合典型的單純性痙攣性截癱。家系中先證者的外公（Ⅱ：1）、母親（Ⅲ：8）和舅舅（Ⅲ：3）3 名成員皆有類似癥狀，據(jù)先證者自述，其母親和舅舅自學(xué)會(huì)走路卻出現(xiàn)行走困難的臨床表現(xiàn)，家系中其余成員均無相似臨床癥狀，根據(jù)家系圖譜（圖1）可初步推斷該病呈常染色體顯性遺傳模式。本研究中所有參與者均簽署了知情同意書，并得到了福建省婦幼保健院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

圖1 遺傳性痙攣性截癱家家系圖Fig.1 Family diagram of hereditary spastic paraplegia.The arrow indicates the proband

1.2 方法

1.2.1 外周血基因組DNA 提取采集先證者及其家系成員靜脈血2 mL，利用DNA 提取試劑盒（Blood Genomic DNA Mini Kit，德國Qiagen 公司）提取基因組DNA，用Nanodrop 2000（美國Thermo 公司）超微量核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)樣本DNA 進(jìn)行質(zhì)控。使用Qubit 核酸定量?jī)x（美國Thermo 公司）對(duì)DNA 濃度進(jìn)行精確定量。

1.2.2 建庫捕獲和高通量測(cè)序本研究采用安捷倫v6 捕獲芯片系統(tǒng)（Agilent SureSelect Human All ExonV6 試劑盒）進(jìn)行建庫和捕獲實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格按照最新優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)步驟操作：首先使用Covaris 破碎儀將基因組DNA 隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度為180 ～280 bp的片段，片段兩端經(jīng)末端修復(fù)和加A 尾后分別連接上接頭制備成DNA 文庫。帶有特異index 的文庫pooling 后與生物素標(biāo)記探針完成液相雜交，再采用帶鏈霉素的磁珠將基因上的外顯子捕獲下來，PCR 線性擴(kuò)增后構(gòu)建文庫，經(jīng)Agilent 2100 生物分析儀器（美國Agilent 公司）對(duì)文庫質(zhì)量檢測(cè)合格后，在Illumina HiSeq 2500 測(cè)序儀（美國Illumina 公司）上完成高通量測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)篩選和生物信息學(xué)分析目標(biāo)區(qū)域測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制后，應(yīng)用BWA 軟件與人基因組數(shù)據(jù)庫（HGl9）進(jìn)行比對(duì)，采用GATK 和VarScan 軟件對(duì)單個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（SNP）、小片段缺失/插入（InDels）進(jìn)行分析，重點(diǎn)關(guān)注呈常染色體顯性遺傳的基因，應(yīng)用dbSNP 數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫、HapMap 數(shù)據(jù)庫、千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫完成數(shù)據(jù)過濾篩選，保留突變頻率小于1%的位點(diǎn)，通過SIFT 和Polyphen-2 等在線功能預(yù)測(cè)工具對(duì)可疑突變位點(diǎn)進(jìn)行致病性預(yù)測(cè)，檢索HGMD 和Clinvar 等相關(guān)基因突變數(shù)據(jù)庫對(duì)可疑致病位點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)，同時(shí)依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)發(fā)布的《序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南》對(duì)序列變異位點(diǎn)判讀，基于先證者表型篩選出有害變異。

1.2.4 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證采用Sanger 測(cè)序方法對(duì)全外顯子測(cè)序分析篩選出的可疑基因致病突變位點(diǎn)進(jìn)行家系共分離驗(yàn)證。利用premier 5 軟件設(shè)計(jì)引物對(duì)gDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，正向引物：5′-TGTGAGAAGAGCAGGTTTCAGGAGT-3′，反向引物：5′-TCCTCAAGATAAAAGGGGACAATA-3′。擴(kuò)增體系及條件，總體系20 μL，包括7.5 μL Q×Buffer，2.0 μL 10×Buffer，1.0 μL MgCl2，四種dNTPs（10 mmol/L）0.4 μL，Hotstar Taq（5 U/L）0.1 μL，上下游引物（100 ng/L）各2 μL，DNA 模板（100 ng/L）1 μL，ddH2O 加至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃30 s，32 個(gè)循環(huán)，最終72 ℃延伸10 min，PCR 產(chǎn)物純化后經(jīng)ABI 3170 測(cè)序儀（美國ABI 公司）完成雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與ATL1 基因（轉(zhuǎn)錄本序列NM_015915.4）進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

通過全外顯子測(cè)序和生物信息學(xué)分析，在數(shù)據(jù)庫中分析比對(duì)后發(fā)現(xiàn)先證者（Ⅳ：13）ATL1 基因第10 號(hào)外顯子存在c.715C ＞T 雜合突變，引起編碼蛋白的第239 位氨基酸由精氨酸變成半胱氨酸（p. R239C），該變異位點(diǎn)在dbSNP、ExAC、ESP6500和1000 Genomes 等均未見收錄，依據(jù)ACMG 判讀該位點(diǎn)為疑似致病，既往已有文獻(xiàn)報(bào)道ATL1 基因c.715C ＞T 雜合突變與致遺傳性痙攣性截癱3A型相關(guān)。采用Sanger 測(cè)序方法對(duì)先證者及其家系成員gDNA 進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)家系中患者（Ⅱ：1，Ⅲ：3，Ⅲ：8）均攜帶該雜合突變位點(diǎn)，先癥者突變位點(diǎn)遺傳自母親，而其他正常成員均未攜帶此突變，從而證實(shí)基因型和疾病表型完全共分離，表明ATL1 基因c.715C ＞T 為該家系發(fā)生遺傳性痙攣性截癱致病原因。

圖2 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 Sanger sequencing results

3 討論

遺傳性痙攣性截癱是一組與神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變相關(guān)的單基因遺傳病，可發(fā)病于任何年齡段，但以兒童和青春期多見［3-4］。由于亞型多且表型復(fù)雜，臨床上極易誤診漏診，需與遺傳性共濟(jì)失調(diào)、肌萎縮側(cè)索硬化癥及腎上腺脊髓神經(jīng)病相鑒別診斷。所有遺傳性痙攣性截癱類型中，文獻(xiàn)報(bào)道研究最多的是常染色體顯性遺傳痙攣性截癱（AD-HSP），其中以痙攣性截癱類型3A（SPG3A）、痙攣性截癱類型4（SPG4）最為常見，分別占40%和10%［13］。

SPG3A 是由ATL1 基因突變導(dǎo)致的單純性ADHSP，ATL1基因定位于14q22.1，包含14個(gè)外顯子，編碼一個(gè)由553 個(gè)氨基酸組成的Atlastin-1 蛋白［15］。Atlastin-1 蛋白是一種與動(dòng)力蛋白相關(guān)的GTP 酶，主要表達(dá)于腦部組織的皮質(zhì)、海馬和皮層脊髓束神經(jīng)元，參與管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形成和軸突的伸長(zhǎng)［16］。NAMEKAWA 等［17］發(fā)現(xiàn)ATL1 基因變異可造成GTP酶活性缺失，可通過顯性負(fù)效應(yīng)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形成及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸囊泡至高爾基體，形態(tài)異常的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體會(huì)引起皮質(zhì)脊髓束等神經(jīng)元的死亡，從而造成SPG3A 疾病的發(fā)生。通常ATL1基因缺陷的患者發(fā)病年齡較早，本研究中的患者剛學(xué)走路時(shí)即表現(xiàn)出行走困難，其臨床表型符合SPG3A 型診斷特征。

迄今為止，國內(nèi)外已報(bào)道了ATL1 基因致病突變類型90 余種，絕大多數(shù)為錯(cuò)義突變，少數(shù)為剪接位點(diǎn)、小片段缺失/插入和大片段缺失突變，錯(cuò)義突變分布較為平均。本研究通過對(duì)先證者全外顯子組測(cè)序檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)先證者（Ⅳ：13）ATL1 基因第10 號(hào)外顯子存在c.715C ＞T 雜合突變，引起編碼蛋白的第239 位氨基酸由精氨酸變成半胱氨酸（p. R239C）。既往已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道該位點(diǎn)與遺傳性痙攣性截癱3A 型相關(guān)［18-20］，ZHAO 等［21］在對(duì)142 個(gè)遺傳性痙攣性截癱家系A(chǔ)TL1 基因篩查中發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)突變發(fā)生在ATL1 基因的第4、7、8 和12 號(hào)外顯子上，其中有31 個(gè)家系均攜帶c.715C ＞T（p. R239C）雜合錯(cuò)義突變（21.83%），表明第239位氨基酸是一個(gè)高頻致病突變位點(diǎn)。

目前尚無有效的針對(duì)HSP 的治療方法，現(xiàn)階段常見做法是聯(lián)合藥物和物理療法來緩解HSP 的癥狀是，一定程度上改善患者的生活質(zhì)量［22］。藥物的作用主要是抑制突觸反射力，松弛肌張力及補(bǔ)充神經(jīng)營養(yǎng)；物理療法包括推拿按摩、電刺激和針灸等。對(duì)于嚴(yán)重的痙攣畸形可采用手術(shù)進(jìn)行矯正，以改善痙攣步態(tài)。

綜上所述，本研究在一個(gè)三代遺傳性痙攣性截癱家系中采用全外顯子測(cè)序技術(shù)鑒定了一個(gè)已報(bào)道的ATL1 基因c.715C ＞T（p.R239C）雜合錯(cuò)義突變，明確致病突變可為家系成員提供準(zhǔn)確可靠的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。HSP 在家系中呈常染色體顯性遺傳，患者的子女中將有50%的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，且男女患病的機(jī)會(huì)相等。因此，建議家系中的患者生育時(shí)須行產(chǎn)前診斷或植入前遺傳學(xué)診斷，以阻斷遺傳病向子代傳遞。