李紅梅，張素文，羅西友，尹弢，郈秀菊

(山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省醫(yī)用高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101)

1 引 言

外科手術(shù)中快速有效地控制出血，降低創(chuàng)傷，防止細(xì)菌感染具有重要意義。傳統(tǒng)止血材料種類較多，但均存在一定的缺點(diǎn)，如對傷口處組織的粘附性差，不控制出血可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥,并增加患者的死亡率，止血時間相對較長，可能會導(dǎo)致二次出血，容易產(chǎn)生病毒感染和保存期限較短等。

近年來，生物醫(yī)用材料的研究取得了很大進(jìn)步，同時也加快了接觸止血材料的發(fā)展[1-4]。目前臨床應(yīng)用的接觸止血材料主要為可吸收性止血材料[5-7]，包括以下幾種：

(1)可吸收性明膠海綿、膠原蛋白海綿、微纖維膠原蛋白粉[8-11]：它們來源于動物組織提取物，含異種蛋白，易引起過敏反應(yīng)和發(fā)熱癥狀，人體吸收在4周以上，期間會增加感染率，影響傷口愈合，臨床局限性大。

(2)改性纖維素止血紗布：代表產(chǎn)品為強(qiáng)生公司的速即紗TM(SURGICEL)。正常的人體組織因缺乏代謝纖維素的酶導(dǎo)致吸收速度相對較慢，且產(chǎn)品呈酸性，臨床上可能引起局部的感染及影響局部組織愈合。

(3)微孔止血球[12]：代表產(chǎn)品有美國的AristaTM和山東賽克賽斯藥業(yè)科技有限公司的“瞬時”復(fù)合微孔多聚糖止血粉。生物相容性好，無過敏反應(yīng)，不會感染動物源性疾病。但活動性出血時難附著。

鑒于此，本研究旨在開發(fā)一種快速止血兼具生物相容性和抗菌功能的安全[13-18]、有效的植物多糖手術(shù)止血材料。

2 材料和方法

2.1 原料試劑

季銨鹽改性淀粉聚合物(季銨鹽和淀粉的質(zhì)量摩爾比為0.3∶1時的反應(yīng)產(chǎn)物，其中季銨鹽是由環(huán)氧氯丙烷和N,N-二甲基辛基叔胺合成所得)，北京化工大學(xué)；甘油、聚山梨酸酯60，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

2.2 儀器設(shè)備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，DF-101S型，上海雷磁儀器廠；冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)D-1A-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

取季銨鹽改性淀粉聚合物8.0 g，甘油3.0 g，蒸餾水88 g，55℃水浴加熱溶解4 h，然后加入聚山梨酸酯601 g。物理發(fā)泡后經(jīng)低溫冷凍干燥，得季銨鹽改性止血海綿。

2.4 吸水倍率測試

稱取季銨鹽改性止血海綿0.8 g[19]，置于潔凈干燥的培養(yǎng)皿中，稱重m1，加入適量去離子水，待海綿吸水飽和后，倒出多余水分，稱重m2，根據(jù)式(1)計(jì)算吸水倍率(A)：

A= (m2-m1)/0.8

(1)

2.5 吸水速率測試

稱取季銨鹽改性止血海綿0.2 g，加入水，開始計(jì)時，到樣品完全吸水停止計(jì)時，記錄時間(s)。

3 結(jié)果與討論

3.1 配方工藝研究[20-24]

按照季銨鹽改性淀粉聚合物和甘油的質(zhì)量比分別為8∶1、8∶3、8∶5混合，加適量水，55℃水浴加熱溶解4 h，然后按照季銨鹽改性淀粉聚合物和聚山梨酸酯60的質(zhì)量比分別為8∶0.3、8∶0.5、8∶1、8∶1.2的比例加入聚山梨酸酯60，物理發(fā)泡后經(jīng)低溫冷凍干燥，制得季銨鹽改性止血海綿，測試不同配方的吸水倍率和吸水速率，結(jié)果見表1，最優(yōu)配方為季銨鹽改性淀粉聚合物∶甘油∶聚山梨酸酯60=8∶3∶1。

表1 季銨鹽改性止血海綿的吸水倍率和吸水速率Table 1 Water absorption ratio and water absorption rate of sponge

3.2 冷凍干燥成型工藝研究

季銨鹽改性淀粉止血海綿的冷凍干燥工藝中，冷凍溫度分別選擇-20℃、-38℃、-56℃和-66℃，冷凍時間分別選擇8、12、20、24 h，冷凍干燥結(jié)束后觀察海綿的狀態(tài)并測試其吸水倍率，結(jié)果見表2。冷凍干燥的最優(yōu)工藝為冷凍溫度-56℃、冷凍時間20 h。

表2 冷凍條件對海綿性能的影響

3.3 抑菌性試驗(yàn)[25]研究

根據(jù)季銨鹽和淀粉的不同質(zhì)量摩爾比所得的醚化產(chǎn)物(北京化工大學(xué)提供)進(jìn)行常溫和加速3月的抑菌性研究，按照GB 15979-2002 中附錄C4的方法進(jìn)行。篩選出抑菌性良好的工藝條件，結(jié)果見表3。當(dāng)季銨鹽和淀粉的質(zhì)量摩爾比大于0.3∶1時，其對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的常溫和加速3月的樣品抑菌率大于90%，說明抑菌率及穩(wěn)定性良好。

表3 抑菌性研究

3.4 季銨鹽改性止血海綿的大鼠肝臟止血試驗(yàn)[26-27]和體內(nèi)降解試驗(yàn)

將大鼠按性別、體重隨機(jī)分為2組，分別為季銨鹽改性止血海綿組、膠原蛋白海綿組，每組10只大鼠，將大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉約40 mg/kg，麻醉后仰臥固定，逐層開腹，游離并暴露肝臟左葉，用組織鉗在肝臟左葉中間位置切取下一塊肝組織(5×3×2 mm)，造成敞開型傷口，自由出血5 s后，使用相應(yīng)的止血海綿，記錄時間，同時用10 g砝碼壓20 s，取下觀察30 s，記錄止血時間。手術(shù)中，使用稱重的無菌紗布收集用藥后所出的血液，計(jì)算術(shù)中總的出血量和止血時間，見表4。術(shù)后2、4周，分別將5只大鼠(雌雄均有)麻醉剖腹，觀察各大鼠創(chuàng)面的血腫、腹腔粘連和季銨鹽改性止血海綿的降解情況并拍照記錄。

表4 大鼠肝臟止血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，本研究制備的季銨鹽改性止血海綿是一種快速有效的止血敷料。

同時觀察得知，2周植入處含未降解的均質(zhì)淡染的樣品，組織未見壞死、水腫、炎細(xì)胞浸潤等組織病理學(xué)變化。剛果紅染色結(jié)果顯示，4周后植入部位無殘存的季銨鹽改性止血材料碎片，4周后的組織切片見圖1。

圖1 組織切片圖

3.5 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

細(xì)胞毒性試驗(yàn)[28-29]是用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評價。實(shí)驗(yàn)共設(shè)空白對照組、陰性對照組、陽性對照組與實(shí)驗(yàn)組，分別放于培養(yǎng)著L929小鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24 h和48 h后顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、陽性對照組及空白對照組培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，48 h后用MTT法測定各供試品組(樣品組、陰性對照組、陽性對照組)相對于空白對照組的細(xì)胞相對增殖率。

結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，基于MTT定量檢測法，未改性淀粉海綿的細(xì)胞相對增殖率為83%，細(xì)胞毒性分級為1級；季銨鹽改性淀粉止血海綿的細(xì)胞相對增殖率為200%，細(xì)胞毒性分級為4級。說明季銨鹽改性淀粉止血海綿有抑菌性，這也與其抑菌性能試驗(yàn)結(jié)果相對應(yīng)。

3.6 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)報(bào)告

采用家兔進(jìn)行皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)[30]，以評價試驗(yàn)樣品在試驗(yàn)條件下產(chǎn)生剌激反應(yīng)的潛能。采用0.9%氯化鈉注射液(SC)和棉籽油(CSO)對試驗(yàn)樣品進(jìn)行浸提，并同理制備不加試驗(yàn)樣品的空白對照液。在家兔脊椎兩側(cè)皮內(nèi)注射試驗(yàn)液及空白對照液，于注射后(24±2)、(48±2)、(72±2) h，對注射部位紅斑和水腫進(jìn)行評分，并計(jì)算試驗(yàn)樣品和對應(yīng)空白對照的皮內(nèi)反應(yīng)最終記分。

結(jié)果顯示，在本試驗(yàn)條件下，季銨鹽改性淀粉止血海綿經(jīng)浸提后的試驗(yàn)液在家兔皮內(nèi)反應(yīng)最終記分均不大于1.0，符合試驗(yàn)要求。

3.7 皮膚致敏試驗(yàn)報(bào)告

對試驗(yàn)樣品的0.9%氯化鈉注射液(SC)和棉籽油(CSO)試驗(yàn)液進(jìn)行了皮膚致敏[17]最大劑量試驗(yàn)，以評價試驗(yàn)樣品在試驗(yàn)條件下使豚鼠產(chǎn)生皮膚致敏反應(yīng)的潛能。按Magnusson和Kligman分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行描述并分級。對照組動物同法操作。

結(jié)果顯示，在本試驗(yàn)條件下，季銨鹽改性淀粉止血海綿經(jīng)浸提后的試驗(yàn)液未導(dǎo)致豚鼠出現(xiàn)皮膚致敏反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究選用季銨鹽改性淀粉聚合物為原料，進(jìn)行止血海綿的制備，季銨化修飾可以破壞細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜，賦予了淀粉抗菌的性能，加速傷口血小板和紅細(xì)胞的聚集，快速止血。季銨鹽改性淀粉止血海綿工藝中最優(yōu)配方為季銨鹽改性淀粉聚合物：甘油：聚山梨酸酯60=8∶3∶1。其冷凍干燥的最佳工藝為冷凍溫度為-56℃，冷凍時間為20 h。其中季銨鹽和淀粉的質(zhì)量摩爾比為0.3∶1及以上時(由北京化工大學(xué)提供)，其對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的抑菌率分別達(dá)99.98%以上和99.97%以上，抑菌性良好，且生物相容性好。大鼠止血試驗(yàn)以及體內(nèi)降解試驗(yàn)表明季銨鹽改性止血海綿具有良好的止血性能，降解時間能夠滿足臨床上對于止血海綿的性能要求。綜上，本研究制備的季銨鹽改性止血海綿具有很好的臨床應(yīng)用前景。