許蓬娟，于志超，褚曉倩，高靜，譚俊珍△

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 301617；2.天津中德應(yīng)用技術(shù)大學(xué)科研處，天津 300350)

1 引 言

納米材料是指其結(jié)構(gòu)成分至少在一個(gè)維度上小于100 nm的材料[1]，因其獨(dú)特的物理化學(xué)特性被廣泛應(yīng)用。盡管納米材料有其優(yōu)越性，但其對(duì)人體的毒性及與決定細(xì)胞命運(yùn)的細(xì)胞機(jī)制的相互作用的認(rèn)識(shí)仍極其有限。在此，我們對(duì)納米材料毒性與自噬的機(jī)制的關(guān)系及其潛在意義進(jìn)行歸納總結(jié)，旨在增加對(duì)納米材料與自噬機(jī)制的相互作用的理解。

2 納米材料的毒性作用

目前，商用納米材料越來(lái)越普遍，人們可以通過(guò)各種消費(fèi)品接觸到納米材料。同時(shí)，納米醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展將納米材料廣泛應(yīng)用于臨床診斷和治療，大量納米藥物被設(shè)計(jì)用于治療各種疾病，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、癌癥、傳染病和過(guò)敏等[2]。這使人體完全暴露在納米材料的環(huán)境中，因此，納米材料的生物安全性問(wèn)題引起越來(lái)越多的關(guān)注[3-4]。

納米材料一旦被人體吸收，可分布在心臟、腦實(shí)質(zhì)、肝臟、骨髓等多個(gè)器官[5-6]，由于其獨(dú)特的尺寸及高表面積，尤其是表面修飾后，納米材料還可以越過(guò)多個(gè)人體生物屏障，如血-腦屏障、血-睪屏障[7-8]。研究表明，多種納米材料對(duì)人類(lèi)健康存在潛在危害。

在大鼠及小鼠模型中均證實(shí)吸入或滴注納米碳黑或其他碳納米材料，可以造成過(guò)敏或肺部炎癥反應(yīng)[9-11]，并會(huì)誘發(fā)大鼠肺部腫瘤[12]。Belyanskaya等[13]發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes, SWNTs)對(duì)雞胚有明顯的神經(jīng)毒性作用，可以顯著減少神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目，且使細(xì)胞電生理功能降低。此外，SWNTs還可以抑制胚胎發(fā)育，甚至導(dǎo)致胚胎死亡[14]。Lara-Martínez等[15]則發(fā)現(xiàn)功能化多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes, MWNTs)對(duì)雞胚也具有嚴(yán)重的毒性作用。

典型的金屬納米材料，如納米銀(Ag)、納米金(Au)、納米銅(Cu)以及各類(lèi)納米氧化物等，也均被證實(shí)對(duì)細(xì)胞或機(jī)體有毒性作用。納米Ag對(duì)MCF-7細(xì)胞有毒性作用，低濃度納米Ag可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡，而高濃度納米Ag則會(huì)引發(fā)細(xì)胞壞死[16-17]。此外，納米Ag還可以造成人類(lèi)皮膚、纖維肉瘤和睪丸癌細(xì)胞等不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷募?xì)胞死亡[18-20]。納米氧化鋅(ZnO)對(duì)酵母、海魚(yú)胚胎及其發(fā)育均有較強(qiáng)的毒性作用[21-22]。納米ZnO和納米二氧化鈦(TiO2)等在各種動(dòng)物模型中均被發(fā)現(xiàn)可在大腦沉積，并產(chǎn)生神經(jīng)毒性[23-24]。納米TiO2對(duì)人體及環(huán)境健康都有較強(qiáng)的毒性作用。此外，納米Cu及納米氧化銅(CuO)對(duì)細(xì)胞及大鼠均有急性毒性效應(yīng)，會(huì)造成細(xì)胞死亡及動(dòng)物存活率降低等，且肝臟和腎臟是其影響最大的器官，也是其他多種納米材料毒性作用的靶器官[25-28]。

目前，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署報(bào)告將人工納米粒子歸為具有未知毒性物質(zhì)[29]。鑒于納米材料的廣泛應(yīng)用及其對(duì)人體、環(huán)境潛在的危害，為保證納米科技的健康發(fā)展，對(duì)納米技術(shù)的生物安全評(píng)估十分重要，而尋求納米材料普遍的毒性機(jī)制成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

3 自噬途徑

自噬(Autophagy)是真核細(xì)胞中的固有信號(hào)活動(dòng)，可消除損傷、老化蛋白或細(xì)胞器，對(duì)維持細(xì)胞體內(nèi)平衡過(guò)程發(fā)揮重要作用。正常的生理狀態(tài)下，自噬扮演細(xì)胞保衛(wèi)者的角色用以抵抗意外死亡。自噬的保護(hù)作用有助于急性期細(xì)胞存活反應(yīng)，而長(zhǎng)期自噬會(huì)產(chǎn)生慢性損傷[30]。自噬有兩種基本類(lèi)型，即選擇性和非選擇性自噬，選擇性自噬又可以根據(jù)如何轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)及其機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步分類(lèi)，如大自噬、小自噬及分子伴侶介導(dǎo)的自噬。其中，大自噬是最典型的、最主要的自噬途徑。自噬一般分為四個(gè)階段：?jiǎn)?dòng)階段、延伸階段、成熟階段和降解階段。首先，泛素蛋白復(fù)合物或其它細(xì)胞垃圾可以刺激自噬途徑啟動(dòng)。其中，Beclin-1是自噬起始階段一種關(guān)鍵蛋白質(zhì)，Beclin-1首先與磷脂酰肌醇3-激酶(the class III phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)和自噬相關(guān)(autophagy-related, Atg)蛋白14結(jié)合進(jìn)而招募其他相關(guān)蛋白，因此，Beclin-1常被視為自噬啟動(dòng)的標(biāo)志蛋白。接下來(lái)，自噬的組裝依賴(lài)于A(yíng)tg7、Atg12和Atg5等，Atg12可以被Atg7激活并結(jié)合在A(yíng)tg5上，形成復(fù)合物參與自噬體的組裝。在自噬體伸展擴(kuò)張期間，細(xì)胞質(zhì)型的LC3-I會(huì)發(fā)生裂解，繼而結(jié)合磷脂酰乙醇胺形成自噬小體膜型的LC3-II，故研究中通常將LC3染色作為自噬標(biāo)記物，將LC3-II/LC3-I比值用于評(píng)估自噬水平的高低。最后在自噬晚期，p62與LC3-II結(jié)合并作為自噬底物在溶酶體內(nèi)被降解，因此，p62常被看做自噬體降解的重要指標(biāo)，最后在LAMP2調(diào)節(jié)下自噬完成[31]。整個(gè)過(guò)程稱(chēng)為自噬通量。

自噬受多種分子信號(hào)調(diào)節(jié)，如mTOR(雷帕霉素激酶的調(diào)節(jié)靶點(diǎn))，它是自噬的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子。而AMP依賴(lài)的蛋白激酶(5′AMP-activated protein kinase, AMPK)和PI3K則是兩種常見(jiàn)促進(jìn)自噬的激酶。

4 自噬途徑參與納米材料的毒性作用

近幾年，隨著對(duì)自噬認(rèn)識(shí)的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)自噬紊亂參與了納米材料的毒性作用[32]。研究指出，大量納米材料的作用過(guò)程均有自噬參與，且納米材料的不同大小或濃度會(huì)產(chǎn)生不同的自噬反應(yīng)[33-34]。自噬途徑在納米材料毒性機(jī)制中的表現(xiàn)是雙向的，一方面，部分納米材料可在細(xì)胞內(nèi)積累，并通過(guò)干擾囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞骨架形成來(lái)影響自噬通量，并降低或抑制溶酶體的穩(wěn)定性和酶活性，最終導(dǎo)致自噬受阻，納米材料誘導(dǎo)的自噬阻滯的結(jié)果可能是受損DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的累積[35-37]。另一方面，部分納米材料可以激活細(xì)胞自噬途徑，增加細(xì)胞自噬通量，并引導(dǎo)細(xì)胞死亡[34,38]。

4.1 納米金屬及金屬氧化物

Ma等[39]發(fā)現(xiàn)納米Au通過(guò)誘導(dǎo)自噬體在細(xì)胞內(nèi)積累，同時(shí)阻斷p62的降解并阻斷自噬通量。Khan等[40]證實(shí)納米氧化鐵(Fe3O4)的細(xì)胞毒性也是依賴(lài)于自噬體的積累及自噬通量的異常阻斷。此外，在缺氧情況下，進(jìn)入細(xì)胞的納米Au增加并誘導(dǎo)過(guò)度自噬聚集在巨噬細(xì)胞中，引起細(xì)胞死亡率增加，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性小體活化，引起炎癥反應(yīng)[41]。Eri等[42]發(fā)現(xiàn)納米Ag和納米鈀可通過(guò)誘導(dǎo)溶酶體損傷和自噬功能障礙來(lái)激活NLRP3炎癥小體造成口腔黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)苔蘚樣病變。

多項(xiàng)研究證實(shí)，納米ZnO誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的主要途徑之一就是自噬，如納米ZnO可誘導(dǎo)大鼠氣管上皮細(xì)胞發(fā)生自噬導(dǎo)致其細(xì)胞損傷，且其對(duì)自噬的影響比SWNTs更明顯，毒性作用更強(qiáng)[43]。納米TiO2可以通過(guò)激活自噬對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[44]。此外，納米CuO、納米氧化鋁(Al2O3)等均通過(guò)激活自噬而發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[45]。納米鉭對(duì)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1的毒性作用也是通過(guò)激活自噬造成的[46]。

4.2 碳納米材料

碳納米材料主要由一個(gè)或多個(gè)尺寸在100 nm以下的碳組成。目前，碳納米材料包括但不限于碳量子點(diǎn)、納米炭黑、富勒烯、納米金剛石，以及最新的石墨烯。其中，富勒烯是碳納米顆粒中最成熟的一種，而石墨烯則被認(rèn)為是具有劃時(shí)代意義的一種新材料，均是目前的研究重點(diǎn)與熱點(diǎn)[47]。

根據(jù)國(guó)際提純及化學(xué)應(yīng)用聯(lián)盟(International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC)的定義，富勒烯包括C60、SWNTs和MWNTs等[48]。在細(xì)胞毒性方面，研究發(fā)現(xiàn)SWNTs、MWNTs、氧化石墨烯等納米材料會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)LC3-II蛋白的表達(dá)，同時(shí)p62表達(dá)也會(huì)增加，出現(xiàn)自噬體積累并阻止自噬通量的現(xiàn)象[17,43,49-50]。功能化MWNTs可以通過(guò)抑制mTOR激活自噬造成NR8383大鼠肺泡巨噬細(xì)胞存活率降低[51]。C60暴露的貽貝中，LC3B蛋白增強(qiáng)，溶酶體/細(xì)胞質(zhì)體積比增加，最終導(dǎo)致對(duì)貽貝的毒性作用[52]。

氧化石墨烯納米片通過(guò)激活自噬水平，造成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞周期阻滯，且其毒性作用存在劑量依賴(lài)性[53]。氧化石墨烯納米顆粒導(dǎo)致的自噬體異常積累與Toll樣受體途徑(toll-like receptor, TLR)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[54]。

4.3 量子點(diǎn)

量子點(diǎn)(quantum dot, QD)是一種半導(dǎo)體納米材料，它由周期表中Ⅲ～Ⅳ或Ⅵ化學(xué)元素族的化學(xué)元素組成，其尺寸一般在1～10 nm。由于其在熒光和光學(xué)穩(wěn)定性方面的優(yōu)越性，QD被認(rèn)為在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在的診斷和治療手段[55-57]。然而，QD對(duì)人體健康的潛在威脅阻礙了量子點(diǎn)在生命醫(yī)學(xué)科學(xué)中的廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)有研究指出，自噬在QD造成細(xì)胞毒性中起著重要作用。

Stephan等[58]證實(shí)以硒化鎘(CdSe)和磷化銦鎵(InGaP)為核心的兩種QD可以通過(guò)誘導(dǎo)自噬造成豬腎近端小管細(xì)胞的毒性作用，并指出誘導(dǎo)自噬可能是部分納米材料的共有特性。石墨烯量子點(diǎn)(GQD)可以通過(guò)激活p-p38MAPK激活自噬進(jìn)而促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞的死亡[59]。此外，CdSe/ZnS量子點(diǎn)暴露會(huì)通過(guò)提高自噬水平，進(jìn)而損害精母細(xì)胞的修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和精子產(chǎn)量下降[60]。

4.4 其他納米材料

自噬功能障礙被認(rèn)為是對(duì)納米材料的主要細(xì)胞毒性反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，納米二氧化硅(SiO2)通過(guò)調(diào)節(jié)CDK7-CDK4級(jí)聯(lián)誘導(dǎo)過(guò)度自噬導(dǎo)致自噬功能障礙進(jìn)而引起毒性作用[61]。PAMAM聚酰胺樹(shù)枝狀大分子通過(guò)誘導(dǎo)自噬體積累，阻斷自噬通量殺傷細(xì)胞[62]。黑磷(black phosphorus, BP)納米片屬于二維材料家族的新成員，研究發(fā)現(xiàn)其可以通過(guò)抑制自噬，增強(qiáng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)巨噬細(xì)胞以及肝細(xì)胞造成毒性作用[63]。

5 結(jié)語(yǔ)

隨著材料科學(xué)的發(fā)展，新型納米材料的出現(xiàn)使人們?cè)絹?lái)越關(guān)注其安全性。但納米材料的毒性評(píng)價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于材料應(yīng)用的發(fā)展，其毒性作用的具體機(jī)制尚未明確，尤其需要注意納米材料體內(nèi)外毒性與臨床的差異性，如何確定人們生活中接觸的納米材料的安全濃度，是當(dāng)前社會(huì)的迫切需要。未來(lái)的研究應(yīng)該努力解決目前細(xì)胞毒性測(cè)試中的不足，并利用這些發(fā)現(xiàn)去設(shè)計(jì)改進(jìn)納米材料，最終使其能更為安全地應(yīng)用于人們的生活。