陳鵬，王超麗，王雪嬌，吳紅，楊鋒△

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)與分析教研室，西安 710000;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科，西安 710000)

1 引 言

2004年，Xu等[1]在分離單壁碳納米管的過程中，首次發(fā)現(xiàn)了能發(fā)出熒光的碳量子點(diǎn)(carbon quantum dots, CQDs)。CQDs作為碳納米材料的新成員，其尺寸一般小于10 nm[2]。與傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)和有機(jī)熒光染料相比，CQDs在生物成像領(lǐng)域具有以下明顯優(yōu)勢：(1)光學(xué)性能優(yōu)異；(2)物理、化學(xué)性能穩(wěn)定，不易分解，耐光漂白；(3)生物相容性高[3]。因此，CQDs被越來越多地應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌等生物檢材的熒光成像和熒光追蹤當(dāng)中。

CQDs的合成方法大致可分為：自下而上和自上而下的兩種方法[4-5]。自下而上法包括燃燒法、水熱碳化法、微波輔助合成、化學(xué)氧化法等。這些方法一般以小分子前驅(qū)體如葡萄糖、氨基酸、離子液體等為碳源進(jìn)行碳化聚合[6]。Bayat等[7]僅使用葡萄糖作為碳源，去離子水作為溶劑在200℃下水熱處理合成了具有綠色熒光的CQDs。另外，自上而下的方法主要以剝離和分解相對較大的富碳物質(zhì)，如石墨、碳纖維、石墨烯和碳納米管等，并通過電化學(xué)氧化、電弧放電、激光燒蝕等多種方法將炭基質(zhì)的大顆粒轉(zhuǎn)化為直徑小于10 nm的碳量子點(diǎn)[8-9]。然而，這些方法不可避免加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和強(qiáng)氧化性的有毒溶劑，增加了CQDs的提純難度和生物安全風(fēng)險(xiǎn)。此外，昂貴的原材料及生產(chǎn)設(shè)備也增加了其制備成本。因此，開發(fā)綠色、環(huán)保和低成本的CQDs很有必要。最近，以含碳量豐富的天然產(chǎn)物為碳源制備的CQDs被廣泛報(bào)道[10-11]，成為目前的研究熱點(diǎn)。Yan等[12]在300℃下的高壓水熱反應(yīng)處理淀粉，并將獲得的產(chǎn)物通過強(qiáng)氧化劑和超聲處理，在120℃中回流過濾得到CQDs。而Wang等[13]使用榴蓮在水熱反應(yīng)過程中輔助鉑催化合成了硫摻雜的CQDs。這些研究證實(shí)以天然產(chǎn)物為原料的CQDs合成方法具有較好的可行性和研究前景。

本研究探索了一種新的成本低廉、生物安全性高的CQDs合成方法。該方法以淀粉作為碳源，通過水熱法一步生成CQDs，簡單高效。此外，本研究對材料的理化性能及生物成像能力進(jìn)行了多個(gè)方面的表征，初步證實(shí)該方法合成的CQDs在生物成像領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2 材料與方法

2.1 材料

淀粉(純度≥ 99%)，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)試劑，包括胎牛血清(FBS)、杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶和磷酸鹽緩沖液生理鹽水(PBS)購自于美國Gibco BRL 公司。金葡萄球菌(E. coli, ATCC 25922)購自于美國ATCC公司。

透射電子顯微鏡(TEM，F(xiàn)EI Talos F200X, 美國Bruker公司)；原子力顯微鏡(AFM,美國Bruker公司)；傅里葉紅外光譜儀(FT-IR) (Bruker，德國)；X射線光電子能譜(XPS, Kratos Axis Supra)；紫外-可見分光度計(jì)(UV-2550，日本Shimadzu公司)；FS5熒光光譜儀(英國Edinburgh Instruments公司)；A1R共聚焦熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

2.2 方法

2.2.1碳量子點(diǎn)的制備過程 將0.03 g淀粉溶于50 mL的去離子水中，充分?jǐn)嚢柚敝寥芙?。同時(shí)，將混合溶液轉(zhuǎn)移至100 mL的高壓反應(yīng)釜中，在210℃下進(jìn)行水熱反應(yīng)。反應(yīng)過程保持6 h。反應(yīng)所得棕黑色產(chǎn)物通過纖維素過濾膜和高速離心(12 000 rpm)的方法進(jìn)行分離純化。最終所得淡黃色液體為CQDs溶液。

2.2.2細(xì)胞毒性測試 根據(jù)之前的報(bào)道[14-15]，將大鼠NRK細(xì)胞和A549細(xì)胞(1×104/孔)加入含有胎牛血清(10%)的培養(yǎng)液中。同時(shí)將細(xì)胞放入37℃下和含有5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。然后換用含有CQDs和不含CQDs的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。孵育24 h后，用CCK-8法評價(jià)細(xì)胞的活度。

2.2.3細(xì)菌活性檢測 為了研究CQDs對細(xì)菌活性的影響，使用肉湯培養(yǎng)基 (LB)對金葡萄球菌進(jìn)行培養(yǎng)[16]。在加入CQDs前，將細(xì)菌懸浮液按照1∶100重新接種到新鮮的LB肉湯培養(yǎng)基中。然后將CQDs加入上述培養(yǎng)液，同時(shí)在搖動(dòng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用酶標(biāo)儀測試不同時(shí)間段混合培養(yǎng)液在600 nm(OD600)波長處的吸光度。對照組除不加CQDs外，其它條件不變。

2.2.4熒光成像測試 將制備好的CQDs粉末分別加入到A549細(xì)胞培養(yǎng)皿和金葡萄球菌培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)12 h后，使用共聚焦熒光顯微鏡對細(xì)胞和細(xì)菌分別成像。

2.2.5體內(nèi)生物相容性測試 使用兔皮膚組織進(jìn)行皮下包埋實(shí)驗(yàn)。將CQDs和磷酸緩沖液分別注射到兔皮下組織中，飼養(yǎng)28 d后取皮下組織，常規(guī)HE染色[17]，以判斷CQDs的生物相容性。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 CQDs的制備與表征

由圖1可知，僅使用淀粉和水在210℃的條件下，一步水熱法合成了碳量子點(diǎn)(CQDs)。圖2(a)中，TEM觀察到CQDs分散性良好且粒徑較均一。圖2(b)中CQDs具有較明顯的晶格條紋，表明成功地合成了結(jié)晶性良好的CQDs。圖2(c)的原子力顯微鏡數(shù)據(jù)表明CQDs形貌近圓形或橢圓形，與TEM表征的形貌一致。圖2(d)為CQDs的粒徑分布圖，其平均粒徑約為2.3 nm。而圖2(e)展示了由原子力顯微鏡測量所得到的高度分布圖，主要分布在2 nm，說明所制備的CQDs為近球形或橢球形納米粒子。

圖1 CQDs的合成路線以及生物成像過程

圖2 CQDs的形貌表征

然后，對CQDs的表面和光學(xué)性質(zhì)作了表征。圖3(a)為CQDs的紫外光譜圖，在225 nm左右的峰被指定為sp2雜化核區(qū)域，這屬于CQDs的芳香環(huán)內(nèi)C=C雙鍵的π-π*躍遷。此外，280 nm左右的吸收峰被指定為C=O雙鍵的n-π*躍遷[18]。用裝有氙燈的熒光光度計(jì)測量CQDs的光致發(fā)光光譜，并在360 nm到440 nm波長下激發(fā)CQDs溶液，間隔為20 nm。對應(yīng)的熒光譜圖，見圖3(b)，樣品在不同激發(fā)波長處的發(fā)射峰發(fā)生了紅移，表明CQDs的熒光與激發(fā)波長密切相關(guān)，這可能是CQDs的表面缺陷導(dǎo)致的結(jié)果。圖3(c)為CQDs的紅外光譜圖，CQDs的O—H拉伸和彎曲振動(dòng)對應(yīng)于3 663和1 343 cm-1的吸收峰，表明制備的CQDs表面含有豐富的羥基基團(tuán)，保證了良好的親水性和穩(wěn)定性。同時(shí)，1 617 cm-1處的峰與芳香環(huán)(C=C)的骨架振動(dòng)有關(guān)，1 676 cm-1處的峰與C=O的拉伸振動(dòng)有關(guān)。而在1 390 cm-1處的峰與羧基(—COO)的對稱拉伸振動(dòng)有關(guān)。為了證明CQDs的內(nèi)在特征，我們使用拉曼光譜對CQDs進(jìn)行了測試。CQDs的拉曼光譜中出現(xiàn)了1 345和1 574 cm-1的兩個(gè)強(qiáng)峰峰，見圖3(d)，這可歸因于無序的sp3(D帶)和石墨化的sp2雜化碳(G帶)。D帶的相對強(qiáng)度與G帶的相對強(qiáng)度之比約為0.79，表明GQDs與石墨的結(jié)構(gòu)類似[19]。

圖3 CQDs光譜圖

此外，X射線光電子能譜圖證實(shí)了GQDs的化學(xué)結(jié)構(gòu)。由圖4(a)和表1可知，譜圖中出現(xiàn)了兩個(gè)強(qiáng)峰，分別屬于284.8 eV的C 1s峰和530.2 eV的O 1s峰。C和O的原子質(zhì)量百分含量分別63.53%和36.47%。圖4(b)中CQDs的絕對量子產(chǎn)率在配備積分球的穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀上測量，最終測得該CQDs在360 nm激發(fā)下的絕對量子產(chǎn)率為2.48%。

表1 C和O的相對含量

圖4 (a).X射線光電子能譜圖;(b).絕對熒光量子產(chǎn)率圖

3.2 CQDs的生物成像研究

共聚焦熒光顯微鏡下CQDs處理過的金葡萄球菌，使用408 nm激發(fā)通道的金葡萄球菌發(fā)出藍(lán)色熒光，將局部圖放大后，可以清楚地看到金葡萄球菌的圓球形形貌，見圖5(a)，而且在明場和暗場下的形貌基本保持一致。CQDs(CCQDs=100 μg/mL)與金葡萄球菌共培養(yǎng)過程中，金葡萄球菌在OD600處的吸光強(qiáng)度，見圖5(b)，證實(shí)CQDs存在的情況下，金葡萄球菌的OD600值與對照組基本一致，說明CQDs對金葡萄球菌基本無破壞作用，并能很好地對其進(jìn)行熒光成像。共聚焦熒光顯微鏡下CQDs處理過的A549腫瘤細(xì)胞，在使用408 nm激發(fā)通道的A549腫瘤細(xì)胞發(fā)出藍(lán)色熒光，CQDs能夠進(jìn)入細(xì)胞膜，對細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行成像，見圖6。而且在明場和暗場下的A549腫瘤細(xì)胞形貌基本保持一致。另外使用CCK-8法對A549細(xì)胞的活度進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)CQDs(CCQDs=100 μg/mL)對A549細(xì)胞無明顯毒性，其活度大于90%。

圖5 (a).CQDs對金葡萄球菌進(jìn)行熒光成像；(b).CQDs對金葡萄球菌的活性影響

圖6 (a).CQDs對A549腫瘤細(xì)胞進(jìn)行熒光成像；(b).CQDs對A549腫瘤細(xì)胞的活性影響

3.3 CQDs的生物相容性研究

本研究選用了大鼠腎細(xì)胞(NRK)作為體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，研究CQDs的潛在不良反應(yīng)。當(dāng)CQDs的濃度從50 μg/mL增加至800 μg/mL時(shí)，NRK細(xì)胞的活度均保持在90%以上，表明CQDs無明顯的細(xì)胞毒性。此外，我們還將CQDs被包埋到兔皮下組織，4周后在采集的標(biāo)本上未觀察到明顯的病理變化，見圖7。

圖7 (a).CQDs對NRK正常細(xì)胞活性影響；(b).使用蘇木精和曙紅(H&E)染色分析CQDs對兔皮下組織的影響

4 結(jié)論

本研究使用低成本、綠色環(huán)保、生物安全性高的淀粉作為碳源，通過一步水熱法快速制備了水溶性高的CQDs。表征發(fā)現(xiàn)該CQDs粒徑均一，其平均尺寸僅為2.3 nm。本研究亮點(diǎn)在于：僅使用淀粉和水作為原料，未摻雜任何有毒和有污染的試劑。制備的CQDs具有很好的生物相容性，其濃度高達(dá)800 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活度仍然保持90%以上。圖5和圖6的結(jié)果說明CQDs對金葡萄球菌和腫瘤細(xì)胞基本無破壞作用，并能很好地對金葡萄球菌和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行熒光成像。細(xì)胞毒性和組織炎癥的研究進(jìn)一步證明該CQDs能夠應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。以上優(yōu)勢將為CQDs在納米載藥，醫(yī)學(xué)成像，生物標(biāo)記等領(lǐng)域提供潛在的應(yīng)用。