李富琴，石永新△，彭光耀，徐 舒，田學(xué)武

(1.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518106；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421001)

隨著生活水平的提高及生活工作壓力的增加，消化性潰瘍發(fā)生率越來(lái)越高，且消化性潰瘍復(fù)發(fā)率也較高[1]。目前，消化性潰瘍的治療主要為質(zhì)子泵抑制劑、中和胃酸藥物、抗幽門(mén)螺桿菌藥物和胃黏膜保護(hù)劑等傳統(tǒng)藥物的聯(lián)合治療[2]；但這種傳統(tǒng)藥物治療并沒(méi)有降低消化性潰瘍發(fā)病率和復(fù)發(fā)率。中醫(yī)在消化性潰瘍治療方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，骨貝類(lèi)制劑治療消化性潰瘍?cè)诿耖g較為流傳，但關(guān)于骨貝類(lèi)制劑治療消化性潰瘍的研究不多。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)在消化性潰瘍的愈合中發(fā)揮著重要作用[3]；EGF通過(guò)與其受體(EGFR)結(jié)合產(chǎn)生持續(xù)分裂信號(hào)，導(dǎo)致細(xì)胞分化增殖，從而促進(jìn)消化性潰瘍的愈合[4]。本研究采用新的工藝制備了骨貝類(lèi)制劑，研究了骨貝類(lèi)制劑對(duì)胃潰瘍模型豚鼠胃潰瘍的療效及對(duì)EGF、EGFR表達(dá)的影響，探討了骨貝類(lèi)制劑治療消化性潰瘍的可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2019年1月選取豚鼠80只，英國(guó)種，雌雄各半，普通級(jí)，短毛，體重150～210 g，購(gòu)自南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。豚鼠飼養(yǎng)條件：濕度50%～60%，溫度20～25 ℃，光照明暗各12 h，自由飲水、進(jìn)食，分籠喂養(yǎng)。

1.1.2主要試劑和儀器 伊紅-蘇木素(HE)染色液購(gòu)自安徽雷根生物技術(shù)有限公司，兔抗鼠EGF多克隆抗體、兔抗鼠EGFR多克隆抗體、生物素標(biāo)記抗體、二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，奧美拉唑腸溶膠囊為汕頭經(jīng)濟(jì)特區(qū)鮀濱制藥廠產(chǎn)品(國(guó)藥準(zhǔn)字：H10980308)，阿莫西林膠囊為山西同達(dá)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品(國(guó)藥準(zhǔn)字：H14033222)，水楊酸晶體為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品(批號(hào)：H31A10B96366)，BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟電子有限公司，動(dòng)物醫(yī)療內(nèi)窺鏡系統(tǒng)VET-9000購(gòu)自上海金旭醫(yī)療設(shè)備有限公司，病理切片及高倍電鏡為南華大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室有償使用。

1.2方法

1.2.1建立胃潰瘍動(dòng)物模型 將80只豚鼠取20只作為對(duì)照組，剩余60只建立胃潰瘍動(dòng)物模型，具體方法：將豚鼠禁食24 h，然后每天每只豚鼠給予100 mg/kg水楊酸拌入飼料中喂養(yǎng)，每天3次，并給予驚嚇及冷熱刺激等不良刺激，觀察豚鼠飲食及飲水情況、活動(dòng)量及精神狀態(tài)情況，7 d進(jìn)行電子胃鏡觀察建模情況，對(duì)建模沒(méi)有成功的豚鼠繼續(xù)上述方法至建模成功。對(duì)照組豚鼠每天正常飼養(yǎng),不給于不良刺激處理。

1.2.2制備骨貝類(lèi)制劑 根據(jù)民間配方取豬股骨和牡蠣按1∶1比例磨粉制備骨貝類(lèi)制劑。

1.2.3豚鼠分組及處理 將60只建模豚鼠隨機(jī)分為安慰劑組、抑酸組和骨貝類(lèi)組，每組20只。于建模15 d開(kāi)始，對(duì)照組、安慰劑組豚鼠每天給予淀粉20 g灌胃，抑酸組豚鼠每天給予奧美拉唑1.5 g/kg、每天3次灌胃，骨貝類(lèi)組豚鼠每天給予骨貝類(lèi)制劑1.5 g/kg、每天3次灌胃(劑量根據(jù)民間配方，成人劑量0.3 g/kg轉(zhuǎn)換為動(dòng)物劑量，轉(zhuǎn)換公式參照文獻(xiàn)[5])，共灌胃14 d。每天觀察各組豚鼠飲食情況、活動(dòng)量、情緒變化等。

1.2.4測(cè)定胃黏膜損傷情況 灌胃14 d后處死各組豚鼠，取胃組織，置于冰上，剪開(kāi)胃大彎，用游標(biāo)卡尺測(cè)定胃潰瘍最大橫經(jīng)和縱經(jīng)，計(jì)算胃潰瘍面積，并采用顯微鏡觀察胃黏膜肌層缺損寬度。計(jì)算胃潰瘍指數(shù)，斑點(diǎn)糜爛計(jì)1分，糜爛長(zhǎng)度小于1 mm計(jì)2分，糜爛長(zhǎng)度1～2 mm計(jì)3分，糜爛長(zhǎng)度2～4 mm計(jì)4分，糜爛長(zhǎng)度大于4 mm計(jì)5分。糜爛寬度大于1 mm時(shí)分值×2。糜爛分值之和為潰瘍指數(shù)。測(cè)定胃黏膜損傷情況后迅速將胃黏膜組織放入多聚甲醛中固定，用于HE、免疫組織化學(xué)(免疫組化)染色測(cè)定。

1.2.5HE染色測(cè)定胃黏膜組織病理形態(tài)學(xué)變化 將固定后的各組豚鼠胃黏膜組織進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋，冠狀連續(xù)切成厚5 μm切片，選擇有胃潰瘍的切片進(jìn)行HE染色，將石蠟切片經(jīng)脫蠟入水后蘇木素染色10 min，鹽酸乙醇分色30 s，伊紅染色10 min，乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察胃黏膜病理形態(tài)學(xué)變化。

1.2.6免疫組化染色測(cè)定胃黏膜EGF、EGFR表達(dá) 將各組豚鼠含胃潰瘍的石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇入水，加入過(guò)氧化氫孵育10 min，微波修復(fù)抗原，牛血清白蛋白孵育15 min，加入一抗∶兔抗鼠EGF抗體(1∶200)、兔抗鼠EGFR抗體(1∶200)過(guò)夜孵育，加入羊抗兔免疫球蛋白G孵育1 h，加入鏈霉親和素生物素辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物孵育60 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色10 min，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。采用HPIAS-1000高清晰彩色圖像分析儀分析免疫組化染色圖片，計(jì)算EGF、EGFR光密度值。EGF、EGFR主要在胃黏膜頸部細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和壁細(xì)胞中表達(dá)，細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1各組豚鼠一般情況比較 各組豚鼠建模前攝食量、精神活動(dòng)狀態(tài)均正常；建模各組豚鼠建模第3天攝食量逐漸下降，活動(dòng)量持續(xù)減少，精神狀態(tài)逐漸變差，建模14 d攝食量不到正常豚鼠的1/2。建模15 d模型組豚鼠給予相應(yīng)藥物處理后安慰劑組豚鼠攝食量、活動(dòng)量仍繼續(xù)減少，精神狀態(tài)繼續(xù)變差，用藥14 d攝食量不足正常豚鼠的1/4；抑酸組、骨貝類(lèi)組豚鼠從用藥7 d攝食量、活動(dòng)量均逐漸增加，精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，用藥后14 d攝食量、活動(dòng)量、精神狀態(tài)基本恢復(fù)至正常豚鼠水平。對(duì)照組豚鼠攝食量、活動(dòng)、精神狀態(tài)一直處于正常狀態(tài)。

2.2各組豚鼠胃潰瘍情況比較 對(duì)照組豚鼠胃黏膜無(wú)潰瘍，建模各組豚鼠胃黏膜均有不同程度潰瘍。與安慰劑組比較，抑酸組、骨貝類(lèi)組豚鼠胃潰瘍指數(shù)、潰瘍面積、黏膜肌層缺損寬度均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；抑酸組豚鼠胃潰瘍指數(shù)、潰瘍面積、黏膜肌層缺損寬度與骨貝類(lèi)組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組豚鼠胃潰瘍情況比較

2.3各組豚鼠胃黏膜病理形態(tài)學(xué)比較 對(duì)照組豚鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)正常、腺體排列有序、無(wú)自發(fā)性潰瘍、無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；安慰劑組豚鼠建模8 d肌層纖維結(jié)構(gòu)不清，出現(xiàn)大量壞死組織，潰瘍底部有瘢痕和肉芽組織形成等；抑酸組、骨貝類(lèi)組豚鼠建模8 d肌層增厚，潰瘍底部有肉芽組織形成，潰瘍比較淺，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、潰瘍程度均較輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組豚鼠胃黏膜病理形態(tài)學(xué)比較(HE，200×)

2.4各組豚鼠胃黏膜EGF、EGFR表達(dá)情況比較 對(duì)照組豚鼠胃黏膜EGF、EGFR均弱陽(yáng)性表達(dá)；抑酸組、骨貝類(lèi)組豚鼠潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR表達(dá)均增強(qiáng)，骨貝類(lèi)組豚鼠潰瘍旁胃黏膜中EGF表達(dá)較抑酸組強(qiáng)。與對(duì)照組比較，安慰劑組豚鼠潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR光密度值均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與安慰劑組比較，抑酸組、骨貝類(lèi)組豚鼠潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR光密度值均明顯升高，且骨貝類(lèi)組豚鼠潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR光密度值均明顯高于抑酸組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、3，表2。

圖2 各組豚鼠胃黏膜EGF表達(dá)情況比較(免疫組化，400×)

圖3 各組豚鼠胃黏膜EGFR表達(dá)情況比較(免疫組化，400×)

表2 各組豚鼠胃黏膜EGF、EGFR光密度值比較

3 討 論

消化性潰瘍是臨床常見(jiàn)病之一，主要包括胃潰瘍和十二指腸潰瘍；胃潰瘍主要由胃酸分泌過(guò)多所致，幽門(mén)螺桿菌感染和非甾體抗炎藥物濫用也可引起胃黏膜防御功能下降，導(dǎo)致胃潰瘍的發(fā)生[6]。奧美拉唑在治療胃潰瘍中被廣泛應(yīng)用，其為質(zhì)子泵抑制劑，可有效抑制胃酸分泌，保護(hù)胃黏膜，緩解病情，在臨床治療胃潰瘍中效果顯著[7]。本研究通過(guò)水楊酸和冷熱、驚嚇刺激建立豚鼠胃潰瘍模型，并給予奧美拉唑治療，證實(shí)奧美拉唑?qū)ξ笣冸嗍蟑熜э@著。

西藥治療胃潰瘍可促進(jìn)潰瘍愈合，防止復(fù)發(fā)，但西藥應(yīng)用費(fèi)用較高，療程較常，且長(zhǎng)期服用抗生素易導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，增加幽門(mén)螺桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性[8-10]。

中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的中醫(yī)具有5 000多年歷史，在消化性潰瘍治療方面取得了巨大成果。民間骨貝類(lèi)制劑常采用豬股骨、牡蠣等，來(lái)源廣泛，費(fèi)用低廉，在藥物資料、經(jīng)濟(jì)條件和信息交流較匱乏的古代，在民間治療消化性潰瘍中廣為流傳，并取得了良好效果。但關(guān)于骨貝類(lèi)制劑治療消化性潰瘍的研究不多，作者曾于2009年就骨貝類(lèi)對(duì)豚鼠胃潰瘍的治療作用進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，骨貝類(lèi)在治療胃潰瘍中效果顯著，可促進(jìn)潰瘍面修復(fù)和愈合[11]。但進(jìn)行上述研究時(shí)作者尚處于學(xué)生階段，對(duì)消化性潰瘍的認(rèn)識(shí)及科研方法不是十分成熟，并且未對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行研究。本研究采用水楊酸和冷熱、驚嚇刺激等建立胃潰瘍模型，采用動(dòng)物電子胃鏡評(píng)價(jià)建模是否成功，將胃潰瘍模型豚鼠給予骨貝類(lèi)制劑治療，觀察了其療效及可能的作用機(jī)制，結(jié)果顯示，骨貝類(lèi)制劑可有效降低胃潰瘍指數(shù)、潰瘍面積、黏膜肌層缺損寬度，其對(duì)胃潰瘍指數(shù)、潰瘍面積、黏膜肌層缺損寬度的降低程度雖稍低于奧美拉唑組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明骨貝類(lèi)制劑對(duì)胃潰瘍的療效與奧美拉唑相當(dāng)。

為探討骨貝類(lèi)制劑對(duì)胃潰瘍可能的作用機(jī)制，本研究探討了骨貝類(lèi)制劑、奧美拉唑?qū)ξ笣僂GF、EGFR表達(dá)情況的影響，結(jié)果顯示，對(duì)照組豚鼠胃黏膜EGF、EGFR均弱陽(yáng)性表達(dá)，安慰劑組豚鼠潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR均表達(dá)增強(qiáng)，抑酸組、骨貝類(lèi)組豚鼠潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR表達(dá)均較安慰劑組增強(qiáng)，骨貝類(lèi)組豚鼠潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR表達(dá)均強(qiáng)于抑酸組。

胃潰瘍愈合是一種復(fù)雜的過(guò)程，涉及肉芽組織生長(zhǎng)、壞死組織清除、新生血管生成、瘢痕組織和纖維組織形成、上皮重構(gòu)等多種過(guò)程。與細(xì)胞分化、增殖、移行、新生血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)形成有關(guān)的多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子參與胃潰瘍的愈合過(guò)程。EGF是參與胃潰瘍預(yù)后的重要生長(zhǎng)因子，具有抑制壁細(xì)胞分泌胃酸、維持胃黏膜完整性、促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成等多種作用，是一種重要的胃黏膜保護(hù)因子，但EGF必須與胃黏膜細(xì)胞上的EGFR結(jié)合而發(fā)揮作用[12-13]。EGFR具有減少胃酸分泌、促進(jìn)胃黏膜增殖、修復(fù)等重要功能，對(duì)EGF具有高度親和力和特異性，當(dāng)EGF到達(dá)靶細(xì)胞表面時(shí)可快速與細(xì)胞上的EGFR結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)功能[14-15]。正常胃黏膜只有少量EGFR表達(dá)，胃潰瘍時(shí)EGFR表達(dá)增加，隨著胃潰瘍的愈合EGFR表達(dá)不斷增加；EGFR通過(guò)表達(dá)增加促進(jìn)胃黏膜增殖，增加黏膜厚度，加速潰瘍重新上皮化，從而促進(jìn)潰瘍愈合，并提高潰瘍愈合質(zhì)量[16-18]。因此，分析骨貝類(lèi)制劑保護(hù)胃潰瘍可能的作用機(jī)制為骨貝類(lèi)制劑具有促進(jìn)潰瘍旁胃黏膜EGF、EGFR表達(dá)的作用；骨貝類(lèi)制劑對(duì)潰瘍旁胃黏膜中EGF、EGFR表達(dá)的促進(jìn)作用高于奧美拉唑，表明骨貝類(lèi)制劑對(duì)胃潰瘍的愈合質(zhì)量高于奧美拉唑。

綜上所述，骨貝類(lèi)制劑治療胃潰瘍療效顯著，可能通過(guò)促進(jìn)EGF、EGFR的表達(dá)而促進(jìn)胃潰瘍愈合，其治療胃潰瘍的療效與奧美拉唑相當(dāng)，但對(duì)胃潰瘍的愈合質(zhì)量可能高于奧美拉唑。