劉杉杉，孫偉，郭盈盈，李加英，田維倩，冉鋼

（1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院 貴州銅仁 554300；2.民族中獸藥分離純化技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 貴州銅仁 554300）

健康動(dòng)物機(jī)體腸道內(nèi)存在的大腸桿菌，多數(shù)并不致病。作為動(dòng)物腸道內(nèi)的共棲菌，大腸桿菌還能夠產(chǎn)生抑制致病性大腸桿菌生長(zhǎng)的大腸桿菌素。近年來(lái)，隨著各種抗生素的濫用，大腸桿菌的耐藥性呈顯著增加的趨勢(shì)[1]，以往的很多特效藥效果變差甚至無(wú)效。寵物感染大腸桿菌不僅能影響到治療效果，而且攜帶耐藥基因的大腸桿菌可能會(huì)感染人，影響人類(lèi)健康和疾病治療效果[2-4]。我國(guó)多省份都有關(guān)于寵物犬大腸桿菌耐藥性嚴(yán)重情況的報(bào)道[5-7]。

銅仁市某養(yǎng)殖場(chǎng)從建立至現(xiàn)在已有數(shù)年，從未進(jìn)行大腸桿菌耐藥性試驗(yàn)分析。為了解該養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌耐藥的具體情況，本研究將從該養(yǎng)殖場(chǎng)采集2 只健康犬肛門(mén)拭子，分離大腸桿菌，進(jìn)行耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與培養(yǎng)基

頭孢噻吩、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、萘啶酸和氧氟沙星藥敏紙片由Oxoid 公司生產(chǎn)。

普通LB 瓊脂和液體培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基均由青島海博生物公司提供。

1.2 樣品采集

采集養(yǎng)殖場(chǎng)2 只健康犬肛門(mén)拭子樣品，置于裝有0.85%無(wú)菌生理鹽水的樣品采集管中，常溫保存?zhèn)溆谩２杉^(guò)程中要注意對(duì)樣品做好標(biāo)記，謹(jǐn)防樣品污染。

1.3 大腸桿菌分離鑒定

將含有肛門(mén)拭子的樣品采集管渦旋振蕩混勻，靜置后用接種環(huán)取上清液1～2 環(huán)進(jìn)行涂片，室溫下自然干燥，經(jīng)火焰固定后，進(jìn)行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

同時(shí)對(duì)采集的樣品進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，將其分別劃線(xiàn)接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h 后，觀察菌落形態(tài)，挑取疑似菌落再次進(jìn)行革蘭氏染色鑒定。菌落繼續(xù)做純化增菌后，利用大腸桿菌16S rDNA 特異性引物（F:5'-GCGGACGGGTGAGTAATGT-3'和R:5'-TCATCCTCTCAGA CCAGCTA-3'，引物由上海生工生物工程有限責(zé)任公司合成）進(jìn)行PCR 鑒定[8]。

1.4 藥敏試驗(yàn)

采用K-B 藥敏紙片法，對(duì)分離的犬大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)。最終判斷結(jié)果，參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)[9]。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌的分離鑒定

將兩只犬肛門(mén)拭子樣品進(jìn)行革蘭氏染色檢查，結(jié)果均顯示為革蘭氏陰性菌，且為桿狀，中等大小。接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，長(zhǎng)出半透明無(wú)色菌落，中等大小，邊緣整齊。接種麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，長(zhǎng)出紅色菌落，且表面光滑，邊緣整齊。

利用大腸桿菌16S rDNA 特異性引物檢測(cè)擴(kuò)增到陽(yáng)性菌，經(jīng)測(cè)序結(jié)果分析，成功分離到2 株犬源性大腸桿菌。

2.2 藥敏試驗(yàn)

對(duì)分離的2 株犬源大腸桿菌分別進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并測(cè)定抑菌圈直徑，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明不同犬只分離出來(lái)的大腸桿菌具有不同的耐藥性，其中一只犬分離的大腸桿菌對(duì)頭孢噻吩、四環(huán)素、環(huán)丙沙星和慶大霉素均耐藥，而對(duì)萘啶酸和氧氟沙星敏感；而另一只犬分離的大腸桿菌則對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星和和氧氟沙星均耐藥，對(duì)頭孢噻吩中度敏感，對(duì)萘啶酸和慶大霉素敏感。

表1 分離的兩株大腸桿菌抑菌圈直徑（mm）

3 討論與分析

多重耐藥表型一般定義為同時(shí)對(duì)3 類(lèi)及3 類(lèi)以上的抗生素耐藥[10]。本研究共選取了4 類(lèi)抗菌藥物，即喹諾酮類(lèi)、β -內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，其中一株大腸桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)抗菌藥物具有耐藥性，而另一株大腸桿菌則對(duì)以上4 類(lèi)抗菌藥物均出現(xiàn)不同程度的耐藥，即該養(yǎng)殖場(chǎng)已出現(xiàn)大腸桿菌的多重耐藥現(xiàn)象。

臨床上治療犬疫病時(shí)各類(lèi)抗生素被廣泛使用甚至濫用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥菌株不斷產(chǎn)生。研究表明，耐藥菌株在犬體內(nèi)極有可能會(huì)進(jìn)一步傳播給人，或者通過(guò)環(huán)境作為媒介，再傳播給人，危害人類(lèi)健康[11]。近年來(lái)，我國(guó)多地區(qū)均有較為嚴(yán)重的犬源大腸桿菌耐藥情況。該養(yǎng)殖場(chǎng)并沒(méi)有使用任何抗生素對(duì)犬只進(jìn)行過(guò)疫病防治，但分離到的兩株大腸桿菌依然顯示了較強(qiáng)的耐藥性，且有多重耐藥。這些結(jié)果提示應(yīng)該規(guī)范使用抗生素，以免造成更加嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

臨床上治療小動(dòng)物疾病，往往會(huì)選擇β -內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)和喹諾酮類(lèi)為主要抗菌藥物。但本研究顯示，其中一只犬分離的大腸桿菌對(duì)慶大霉素敏感，頭孢噻吩亦抗菌效果欠佳，提示應(yīng)引起獸醫(yī)臨床工作者的關(guān)注。

本研究?jī)H是對(duì)兩只犬進(jìn)行檢測(cè)就發(fā)現(xiàn)了抗生素的耐藥性，那么該養(yǎng)殖場(chǎng)是否存在更加廣泛的犬源性細(xì)菌耐藥性？有必要進(jìn)一步開(kāi)展犬源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)，并制訂抗菌藥物的使用規(guī)范。