孟靚 魏益謙 高晶 李麗 邵紫萱 孟智睿 高學(xué)敏 王景霞

由于遺傳因素、飲食習(xí)慣、生活方式和年齡、絕經(jīng)、疾病及藥物等原因引起的血清膽固醇或甘油三酯的水平過高或高密度脂蛋白水平過低，稱為血脂代謝異常[1]。脂質(zhì)代謝異常與許多疾病都密切相關(guān)，如動脈粥樣硬化[2]、肥胖癥[3]、胰島素抵抗[4]、高脂血癥[5]、脂肪肝[6]等，因此對血脂代謝異常的防治有著極為重要的意義。沙苑子(SemenAstragaliComplanati)為豆科植物扁莖黃芪(AstragaluscomplanatusR.Br.)的干燥成熟種子，是中醫(yī)傳統(tǒng)補陽藥，功能補腎助陽、滋補腎精[7]。藥理研究顯示[8-10]，沙苑子的總黃酮有明顯的調(diào)脂作用，能夠降低血清甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，TC)水平，沙苑子苷A是含量較高的黃酮類成分之一[11]，本實驗選擇沙苑子苷A為研究對象，采用游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)誘導(dǎo)的肝脂肪變L02細(xì)胞模型，觀察沙苑子苷A對肝脂質(zhì)異常的調(diào)節(jié)作用，并針對TG的合成途徑深入探討沙苑子苷A的降脂機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞

正常人肝細(xì)胞株L02，購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物與試劑

沙苑子苷A(美國Apexbio公司，批號：A8425)，高糖DMEM培養(yǎng)基(hyclone，批號：sh30284.01)、胰蛋白酶-EDTA消化液(批號：T4299)、青鏈霉素(批號：V900929)，牛血清白蛋白(批號：V900933)、棕櫚酸鈉(Sodium Palmitate，PA，批號：P9575)、油酸鈉(Sodium Oleate，OA，批號：07501)、二甲基亞礬(Dimethyl sulfoxide，DMSO，批號：C6295)、蛋白裂解液(RIPA，批號：r0278)均購自美國Sigma公司，胎牛血清(美國Gibco公司，批號：10099-141)、CCK8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所，批號：CK04)，油紅O細(xì)胞染色試劑(北京索萊寶生物公司，批號：g1262)，BCA法蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒(凱基生物公司，批號：KGP902)，TG試劑盒(批號：A110-1-1)、TC試劑盒(批號：A111-1-1)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase，ALT)試劑盒(批號：C00902-1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic oxaloacetic transaminase，AST)試劑盒(批號：C010-2-1)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(批號：A020-2-2)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒(批號：A003-1-2)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)試劑盒(批號：A001-3-2)均來源于南京建成生物工程研究所；實時熒光定量 PCR 檢測主要實驗材料：引物(北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成)，Trizol(美國Invitrogen公司，批號：15596018)，RNase Inhibitor(批號：eo0382)，RNase-free H2O(批號：en0521)均購自美國Fermentas(MBI)公司，轉(zhuǎn)錄酶、qPCR Mix(APEXBIO，批號：k1070-5000)，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein 1C，SREBP-1c)抗體(批號：ab133125)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)抗體(批號：EPR5700)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα)抗體(批號：epr18516)、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A(carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT-1A)抗體(批號：ab189182)、抗兔IgG HRP辣根過氧化物酶(批號：ab6721)均購自英國Abcam公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

超凈工作臺(青島海爾股份有限公司)，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，高速低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，倒置顯微鏡(德國Leica)，全自動生化分析儀(Rayto)，酶標(biāo)儀(Thermo)，7500時實定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad) ，凝膠成像系統(tǒng)(美國 UVP)。

1.4 脂肪變肝細(xì)胞模型的建立

1.4.1 CCK8檢測確定FFA濃度范圍 將L02細(xì)胞鋪于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待貼壁后，分別加入不同濃度的FFA(OA∶PA為2∶1)，誘導(dǎo)24小時，用CCK8試劑盒測定細(xì)胞增殖情況，測出OD值，篩選出FFA濃度范圍。

1.4.2 油紅O染色的細(xì)胞形態(tài)觀察 油紅O染色可以對肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴進(jìn)行定性觀察，以0.8×105/mL的密度鋪于6孔板中，每孔2 mL，24小時貼壁后加入不同劑量的FFA(OA∶PA為2∶1)作用于L02細(xì)胞，培養(yǎng)24小時后，進(jìn)行染色處理，PBS漂洗2～3遍，4%多聚甲醛固定，光鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量和大小。

1.4.3 細(xì)胞內(nèi)TG的檢測 將L02細(xì)胞以1×105/mL種植于24孔板，每孔1 mL，分為對照組和模型組，每組3孔。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的FFA(OA∶PA為2∶1)干預(yù)，培養(yǎng)24小時后，檢測TG含量。

1.5 沙苑子苷A對L02 細(xì)胞活力的影響

稱取沙苑子苷 A 溶于 DMSO 中，獲得沙苑子苷 A 儲備液。分裝后放置于-20℃冰箱保存。臨用前用完全培養(yǎng)基稀釋，得到沙苑子苷 A 溶液。經(jīng)過直徑為 0.22 μm 的一次性針頭濾器，至容積為 15 mL 的經(jīng)過滅菌處理的離心管中。沙苑子苷 A 溶液終濃度為 1×10-6mM，1×10-5mM，1×10-4mM，1×10-3mM，1×10-2mM，1×10-1mM，1 mM。沙苑子苷 A 溶液中 DMSO 終濃度小于等于0.1%(V/V)。加入貼壁生長的 L02 細(xì)胞中，每個濃度設(shè)置 3 個重復(fù)孔。孵育 24 小時，隨后每孔加入 10μL 的 CCK8 試劑，避光室溫反應(yīng) 30 分鐘。使用酶標(biāo)儀 520 nm 波長檢測其 OD 值，計算細(xì)胞活力百分率。

1.6 分組與給藥

用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的高糖DMEM)傳代培養(yǎng)正常人肝細(xì)胞株L02，待細(xì)胞呈對數(shù)生長是即開始實驗。以0.5×105/mL的密度鋪板種植，將體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞分為對照組(Control)、模型組(Model)、沙苑子低、中、高劑量組(S-Low 25 μM、S-Middle 50 μM、S-High 100 μM)。對照組：加入完全培養(yǎng)基；模型組：待細(xì)胞貼壁后，加入1 mM FFA(1.4.1中確定的造模濃度)孵育24 小時；沙苑子低、中、高劑量組：細(xì)胞貼壁后，沙苑子低、中、高劑量先預(yù)處理24小時，再加入1 mM FFA干預(yù)24小時。然后測定相關(guān)指標(biāo)。

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1 L02細(xì)胞TG、TC、ALT、AST、LDH、MDA含量，SOD活性水平的測定 收集各組細(xì)胞，PBS沖洗并1000 r/min離心2～3遍，酶標(biāo)儀測出相應(yīng)OD值，同時用BCA蛋白濃度試劑盒檢測蛋白含量。嚴(yán)格按照試劑盒說明書，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測。

1.7.2 L02細(xì)胞炎性因子IL-6、TNF-α的測定 收集各組細(xì)胞，ELISA法檢測白細(xì)胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的含量。

1.7.3 實時熒光定量PCR檢測SREBP-1c、FAS、PPARα、CTP-1A mRNA表達(dá) 提取各組細(xì)胞總RNA，根據(jù)產(chǎn)品說明書操作。用生物分光光度計測定 RNA濃度和純度。取 2 μg RNA 樣本，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，并以此為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄和 PCR反應(yīng)條件按照試劑盒說明書設(shè)置。PCR進(jìn)行35～40個循環(huán)：預(yù)變性 95℃，2分鐘；變性95 ℃，30秒；58 ℃退火，30秒 ；72 ℃延伸30秒。以β-actin 為內(nèi)參，所得 CT 值按照2-△△CT的方法進(jìn)行均一化處理后再進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7.4 蛋白免疫印跡法檢測SREBP-1c、FAS、PPARα、CTP-1A蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，5000 rpm 離心去除沉淀，BCA 法測定蛋白含量，總蛋白50 μg上樣，經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至 NC膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉后加入1∶1000稀釋的相應(yīng)的一抗，4℃搖床孵育過夜，TBST洗3次，加入1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時，TBST洗3次后，用Western blot熒光檢測試劑盒顯影、定影。結(jié)果用圖象分析儀分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 L02細(xì)胞脂肪變模型的建立

2.1.1 CCK8法檢測不同濃度FFA對L02細(xì)胞活性的影響 分別將0.25 mM、0.5 mM、0.75 mM、1 mM、1.5 mM不同濃度FFA干預(yù)L02細(xì)胞培養(yǎng)24小時后觀察細(xì)胞存活狀況。實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)FA濃度在1 mM以下時，細(xì)胞死亡漂浮較少。CCK8結(jié)果顯示，當(dāng)FFA濃度超過1mM是吸光度顯著降低，細(xì)胞增殖影響較大(見表2)。

表2 CCK8檢測不同濃度的FFA對L02細(xì)胞活性的影響

2.1.2 油紅O染色觀察不同濃度FFA對L02細(xì)胞內(nèi)脂滴形成的影響 光鏡下觀察可見，對照組細(xì)胞邊緣完整，胞漿豐富，細(xì)胞內(nèi)未見紅色脂滴，實驗組隨著游離脂肪酸造模濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)脂滴呈遞增趨勢，當(dāng)FFA濃度大于1mM時，細(xì)胞數(shù)量明顯減少(見圖1)。

注：A：對照組；B：0.25 mM劑量組；C：0.50 mM劑量組；D：0.75 mM劑量組；E：1.00 mM劑量組；F：1.5 mM劑量組圖1 油紅O染色法觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴(油紅O染色，×200)

2.1.3 不同濃度FFA對L02細(xì)胞TG含量的影響 當(dāng)FFA作用濃度為1 mM時，細(xì)胞活性及增殖不受大的影響，且在該作用濃度時，細(xì)胞內(nèi)脂滴形成最多、甘油三酯含量最高。而當(dāng)FFA作用濃度高于1 mM時，細(xì)胞的活性與增殖均受到很大影響，且細(xì)胞內(nèi)脂滴與脂質(zhì)含量減少較多，因此，選擇1 mM作為FFA誘導(dǎo)造模的最佳濃度(見表3)。

表3 不同濃度的FFA對L02甘油三酯水平的影響

以上實驗結(jié)果可知，當(dāng)FFA作用濃度為1 mM時，細(xì)胞活性及增殖不受大的影響，且在該作用濃度時，細(xì)胞內(nèi)脂滴形成最多、甘油三酯含量最高。而當(dāng)FFA作用濃度高于1 mM時，細(xì)胞的活性與增殖均受到很大影響，且細(xì)胞內(nèi)脂滴與脂質(zhì)含量減少較多，因此，選擇1 mM FFA誘導(dǎo)24小時造模成功。

2.2 沙苑子苷A對正常L02細(xì)胞活性的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，當(dāng)沙苑子苷 A 濃度很小時，低濃度的沙苑子苷 A 對 L02 細(xì)胞有增強(qiáng)活性的作用，隨著沙苑子苷 A 濃度的升高，細(xì)胞活力逐漸與空白對照組相近(見表4)。

表4 CCK8檢測不同濃度沙苑子苷A對L02細(xì)胞活性的影響

2.3 沙苑子苷A對脂肪變L02細(xì)胞TG、TC、ALT、AST、LDH的影響

與空白對照組比較，模型組L02細(xì)胞TG、TC、ALT、AST、LDH含量均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，沙苑子低、中、高劑量組L02細(xì)胞TG、ALT、AST、LDH含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，沙苑子苷A中、高劑量組L02細(xì)胞TC含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表5)。

表5 沙苑子苷A對L02細(xì)胞內(nèi)TG、TC、ALT、AST、LDH含量的影響

2.4 沙苑子苷A對脂肪變L02細(xì)胞MDA、SOD、IL-6、TNF-α水平的影響

與空白對照組比較，模型組L02細(xì)胞MDA、IL-6、TNF-α含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，沙苑子苷A中、高劑量組L02細(xì)胞MDA含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，沙苑子苷A低、中、高劑量組L02細(xì)胞IL-6、TNF-α含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與空白對照組比較，模型組L02細(xì)胞SOD活力水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；沙苑子低、中、高劑量組L02細(xì)胞SOD活力水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表6)。

表6 沙苑子苷A對L02細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、IL-6、TNF-α含量的影響

2.5 沙苑子苷A對脂肪變L02細(xì)胞SPEBP-1c、FAS、PPARα、CPT-1A mRNA表達(dá)水平的影響

與對照組比較，模型組L02細(xì)胞SPEBP-1c、FAS mRNA的表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，PPARα mRNA的表達(dá)有升高趨勢，但是無統(tǒng)計學(xué)意義，CTP-1A mRNA的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，沙苑子苷A低、中、高劑量L02細(xì)胞FAS、SPEBP-1c mRNA的表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，沙苑子中、高劑量組L02細(xì)胞PPARα、CPT-1A mRNA的表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表7)。

表7 沙苑子苷A對L02細(xì)胞SPEBP-1c、FAS、PPARα、CTP-1α mRNA的影響

2.6 沙苑子苷A對脂肪變L02細(xì)胞SREBP-1c、FAS、PPARα、CPT-1A蛋白表達(dá)水平的影響

與對照組比較，模型組L02細(xì)胞SREBP-1c、FAS蛋白表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，PPARα蛋白的表達(dá)有升高趨勢，但是無統(tǒng)計學(xué)意義，CPT-1A蛋白的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，沙苑子苷A低、中、高劑量L02細(xì)胞SREBP-1c、FAS蛋白的表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，沙苑子中、高劑量組L02細(xì)胞PPARα、CPT-1A蛋白的表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表8，圖2)。

表8 沙苑子苷A對L02細(xì)胞SREBP-1c、FAS、PPARα、CPT-1A蛋白的影響

注：A:空白對照組；B:1mM游離脂肪酸；C:沙苑子苷A低劑量組；D:沙苑子苷A中劑量組；E:沙苑子苷A高劑量組圖2 甘油三酯代謝相關(guān)蛋白免疫印跡圖

3 討論

目前，西醫(yī)常用的調(diào)脂藥有他汀類、貝特類、膽酸螯合樹脂類、煙酸類及其衍生物等，但都有一定的胃腸道不良反應(yīng)、頭痛或者肌肉疼痛，嚴(yán)重的可出現(xiàn)肝功能損害或橫紋肌溶解癥[12]。黃酮類化合物是一種廣泛存在于自然界中的天然有機(jī)化合物，具有較高的安全性和廣泛的生物活性[13]，越來越多的研究顯示黃酮類化合物在調(diào)節(jié)血脂和預(yù)防冠心病方面發(fā)揮了重要作用[14]，如：羅布麻葉總黃酮能減輕高血脂導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷和改善體內(nèi)氧化應(yīng)激水平[15]，山楂葉總黃酮可調(diào)控法尼醇受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)/ SREBP-1c通路改善非酒精性脂肪肝大鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂[16]，還有沙棘總黃酮[17]，銀杏葉總黃酮[18]等等，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。沙苑子黃酮是沙苑子中含量較高的一類化合物，目前已經(jīng)從沙苑子中提取到超過16 種的黃酮類化合物，其中沙苑子苷A是含量較高的黃酮類成分之一[11,19]。目前國內(nèi)外學(xué)者對沙苑子總黃酮的藥理作用研究較多，但是對單體成分的藥理研究還未見報道。本實驗采用FFA誘導(dǎo) L02 構(gòu)建肝細(xì)胞脂肪變模型，觀察沙苑子苷A對脂肪變L02細(xì)胞的影響，探討其降脂作用及分子機(jī)制。

肝臟脂肪變的細(xì)胞模型較高脂飼養(yǎng)建立的動物模型個體差異較小，可較好的對實驗條件進(jìn)行把控，其中油酸和棕櫚酸以2∶1比例而成的FFA混合物建立細(xì)胞脂肪變模型更符合人體脂肪變的病理過程[20]。本實驗采用CCK8法測定了不同濃度FFA對細(xì)胞活性的影響，同時結(jié)合油紅O染色光鏡下細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況和定量檢測細(xì)胞內(nèi)TG水平，最終確定1 mM FFA誘導(dǎo)24小時可成功造模。沙苑子苷A干預(yù)治療后，能顯著降低L02細(xì)胞TG、TC、ALT、AST、LDH含量，同時降低MDA含量、提高SOD活性，降低IL-6、TNF-α的水平，說明沙苑子苷A能減輕脂毒性造成的肝細(xì)胞損傷，緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎癥反應(yīng)，提示沙苑子苷A是沙苑子降脂保肝的有效單體成分。

研究表明，TG合成途徑中兩個重要的核受體轉(zhuǎn)錄因子SPEBP-1c和PPARα對其起關(guān)鍵作用。SREBP-1c是脂肪酸和甘油三酯合成中的關(guān)鍵分解因子，主要參與肝臟脂肪酸合成和脂肪前體細(xì)胞的分化，其過表達(dá)會引起與脂質(zhì)異常相關(guān)的疾病如糖尿病、高脂血癥、代謝綜合征的發(fā)生[21-22]，可通過調(diào)節(jié)其下游靶基因FAS、ACC、GPAT的表達(dá)來調(diào)節(jié)肝臟中TG的合成[23]。其中乙酰輔酶A羧化酶(ACC)催化乙酰輔酶A形成丙二酰輔酶A，合成長鏈脂肪酸前體，脂肪酸合成酶(FAS)是一種多功能復(fù)合酶，催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A，參與長鏈脂肪酸生產(chǎn)的內(nèi)源性蛋白酶[24]，在合成脂肪酸方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[25]。GPAT是TG生物合成的限速酶[26]。本實驗結(jié)果顯示，給予沙苑子苷A預(yù)處理，模型細(xì)胞SREBP-1c、FAS mRNA和蛋白的表達(dá)量均顯著，表明沙苑子苷A可通過抑制肝臟SREBP-1c的表達(dá)，下調(diào)肝臟FAS，抑制肝臟中TG的合成。

PPARα是核受體超家族的成員之一，可顯著改善血脂異常和減輕動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的風(fēng)險[27]。PPARα激活后與配體形成異二聚體[27]，可調(diào)控與脂質(zhì)代謝相關(guān)的多種基因編碼的蛋白質(zhì)，如脂肪酸轉(zhuǎn)位酶、乙酰輔酶A氧化酶等[28]，從而介導(dǎo)TG和脂肪酸的代謝分解。CPT-1A是線粒體內(nèi)脂肪酸β氧化途徑的限速酶[29]，其作用是將長鏈脂肪酸從胞漿轉(zhuǎn)運如線粒體內(nèi)部，進(jìn)行β氧化[30]。本實驗結(jié)果顯示，給予沙苑子苷A預(yù)處理，模型細(xì)胞PPARα、CPT-1A mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著升高，說明沙苑子苷A通過上調(diào)肝臟PPARα的表達(dá)水平，提高CPT-1A的活性，加速了脂肪酸的β氧化分解，進(jìn)而使TG的合成減少。

綜上所述，沙苑子苷A對脂肪變性L02肝細(xì)胞模型具有良好的降脂和保肝作用，其降脂機(jī)制可能是沙苑子苷A通過抑制肝細(xì)胞SREBP-1c的表達(dá)，降低TG合成途徑中限速酶FAS水平，降低TG合成速度；同時上調(diào)PPARα蛋白表達(dá)，提高脂肪酸β氧化途徑中CPT-1A水平，加速脂肪酸的β氧化，減少TG合成，從兩方面共同作用從而達(dá)到降脂和保肝效果。