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        響應(yīng)面法優(yōu)化海洋細(xì)菌NTa產(chǎn)瓊膠酶的發(fā)酵條件

        2021-07-16 06:18:38陳艷紅王海琪馬芮萍姜澤東倪輝朱艷冰
        關(guān)鍵詞:浸膏瓊脂酵母

        陳艷紅,王海琪,馬芮萍,姜澤東,倪輝,朱艷冰

        (1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院,福建 廈門 361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室,福建 廈門 361021;3.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心,福建 廈門 361021;4.廈門市南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用與深加工重點實驗室,福建 廈門 361021)

        0 引言

        瓊脂是紅藻細(xì)胞壁的主要成分,主要由瓊脂糖和硫瓊膠組成[1]。瓊脂糖是不含有硫酸酯鹽的非離子型多糖,由D-半乳糖(G)和3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖(LA)以α-1,3-糖苷鍵和β-1,4-糖苷鍵反復(fù)交替連接形成的線性大分子,是形成凝膠的組分[1-2]。硫瓊膠和瓊脂糖的二糖單位類似,其中一些羥基被硫酸基、甲氧基和丙酮酸殘基等替代[1-2],是非凝膠組分。

        瓊膠酶屬于糖苷水解酶家族,它將瓊脂降解為具有重復(fù)二糖單位的寡糖。根據(jù)酶解類型,瓊膠酶分為α-瓊膠酶(EC 3.2.1.158)和β-瓊膠酶(EC 3.2.1.81)。α-瓊膠酶作用于瓊脂糖的α-1,3-糖苷鍵,產(chǎn)物是以3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖為還原性末端的瓊寡糖(agaro-oligosaccharide,AOs);β-瓊膠酶作用于瓊脂糖的β-1,4-糖苷鍵,產(chǎn)物是以D-半乳糖為還原性末端的新瓊寡糖(neoagaro-oligosaccharides,NAOs)[3]。瓊膠水解產(chǎn)生的寡糖表現(xiàn)出多種生物學(xué)活性[4],如益生元效應(yīng)、增白效應(yīng)、保濕效應(yīng)和抗氧化作用等,在食品、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)有廣泛的潛在應(yīng)用。瓊膠酶除了用于制備寡糖外,也可以用于瓊脂糖凝膠DNA的回收、海藻原生質(zhì)體的制備、海藻中生物物質(zhì)的提取等[3]。

        瓊膠酶主要從海洋微生物和海洋軟體動物的消化道中獲得,其中許多瓊膠酶已經(jīng)從細(xì)菌物種中被鑒定出來[5-10]。由于瓊膠酶的生產(chǎn)率低,瓊膠酶的商業(yè)用途受到限制,已經(jīng)有一些研究進(jìn)行產(chǎn)瓊膠酶微生物的培養(yǎng)條件或培養(yǎng)基組成的優(yōu)化[11-15]。

        在先前的研究中,本課題組從廈門的海洋泥土樣品中分離出瓊膠酶的高產(chǎn)菌株Stenotrophomonassp.NTa[16],并進(jìn)行了該菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶條件的初步優(yōu)化,利用單因素優(yōu)化的方法確定了菌株 NTa 產(chǎn)瓊膠酶的最佳碳源是瓊脂、氮源是酵母浸膏,培養(yǎng)基中NaCl的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,產(chǎn)酶的最佳溫度為28 ℃[17]。在此基礎(chǔ)上,本研究擬應(yīng)用一些統(tǒng)計設(shè)計包括Plackett-Burman試驗(Plackett-Burman design,PBD)、最陡爬坡試驗(steepest ascent method,SAM)和響應(yīng)面分析法(response surface methodology,RSM),進(jìn)一步建立Stenotrophomonassp.NTA發(fā)酵產(chǎn)酶的優(yōu)化方法,并鑒定菌株NTa瓊脂酶的酶解產(chǎn)物。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        種子培養(yǎng)基(g/L):NaCl 50.0,KNO35.0,MgSO4·7H2O 5.0,CaCl20.2,K2HPO40.1,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02,蛋白胨5.0,酵母浸膏1.0,瓊脂2.0。

        基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):NaCl 50.0,KNO35.0,MgSO4·7H2O 5.0,CaCl20.2,K2HPO40.1,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02,瓊脂2.0。通過1 mol/L NaOH將培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)至7.5。

        新瓊二糖(NA2)、新瓊四糖(NA4)、新瓊六糖(NA6)和新瓊八糖(NA8)等新瓊寡糖標(biāo)準(zhǔn)品,上海ZZBIO有限公司,其他試劑均為分析純產(chǎn)品。

        1.2 儀器與設(shè)備

        WFJ型可見分光光度計,尤尼柯儀器有限公司;3 ku超濾離心管,Millipore,USA;Labconco FreeZone 6 plus冷凍干燥機(jī),ThermoFisher,USA;Waters Maldi Synspt Q-TOF質(zhì)譜儀,Waters Corp,USA。

        1.3 方法

        1.3.1 瓊膠酶粗酶樣品的制備 將產(chǎn)瓊膠酶細(xì)菌NTa單菌落接種于5 mL種子培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h。將1 mL上述培養(yǎng)物接種到50 mL種子培養(yǎng)基(在250 mL錐形瓶)中,28 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。將制備的接種物以質(zhì)量比為1∶50的比例轉(zhuǎn)移到50 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中(在250 mL錐形瓶),28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)36 h。

        1.3.2 瓊膠酶粗酶樣品的制備 發(fā)酵液于4 ℃、12 000 r/min離心10 min,上清液即為發(fā)酵粗酶液。

        1.3.3 瓊膠酶活力的測定 瓊膠酶的活力測定參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。在40 ℃、pH= 7.0條件下,以每分鐘釋放1 μmol還原糖(以葡萄糖計)所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

        1.3.4 生物量的測定 取1 mL發(fā)酵液,在12 000 r/min條件下離心10 min,棄去上清液,保留菌體沉淀,加入去離子水至 3 mL,充分混勻后,測定其在600 nm 處的吸光度值,以去離子水為空白對照,檢測微生物的生物量。

        1.3.5 總糖的測定 取稀釋10倍的發(fā)酵液1 mL于試管中,加入2 mL蒽酮試劑,混勻,沸水浴反應(yīng)10 min,冷卻至室溫后,放置10 min,在620 nm處測定吸光度值。

        1.3.6 PBD 采用PBD試驗選擇影響瓊膠酶活力的因素,對瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、酵母浸膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、MgSO4·7H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)(D)、 培養(yǎng)基初始pH值(E)、裝液量(F)及接種量(G)7個因素進(jìn)行考察,分別選擇高水平和低水平,因素水平設(shè)計如表1所示。 測定樣品的瓊膠酶活力和生物量,選擇置信度高(大于95%)的因素進(jìn)行進(jìn)一步考察。

        表1 瓊膠酶發(fā)酵PBD設(shè)計因素及水平

        1.3.7 SAM 為了接近瓊脂酶產(chǎn)量的最高區(qū)域,在PBD試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上確定最陡上升的方向和合理的步長。

        1.3.8 RSM 基于PBD和SAM的結(jié)果,使用中心組合試驗設(shè)計,進(jìn)一步評估對菌株產(chǎn)瓊膠酶有顯著影響的變量。變量分別在5個不同的層次進(jìn)行研究。測定了試驗設(shè)計中瓊膠酶活力的實際值和預(yù)測值的響應(yīng)。對獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)用多元回歸分析。系統(tǒng)的行為由式(1)來解釋:

        (1)

        其中:Y是預(yù)測的響應(yīng)值(瓊膠酶活力,U/mL);b0,bi和bij是常系數(shù);xi和xj是編碼的自變量。使用Design Expert 8.0.5.0對模型進(jìn)行統(tǒng)計分析以評估方差分析。

        1.3.9 酶解產(chǎn)物的制備 將發(fā)酵粗酶液通過冷凍干燥機(jī)濃縮成粉末,將酶粉末溶于50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.0)中,然后用150倍體積的相同緩沖液透析過夜4次。透析樣品用作部分純化的瓊膠酶。將5 mL酶溶液(1.2 U/mL)加入15 mL含有1.0%(m/V)瓊脂的50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.0)中,40 ℃下120 r/min進(jìn)行振蕩反應(yīng)。每隔一段時間取樣,利用DNS法[18]測定釋放的還原糖的量。溫育72 h后,釋放的還原糖量沒有變化。在沸水中加熱10 min停止反應(yīng)。反應(yīng)物在4 ℃下18 000g離心20 min,上清液利用3 ku超濾離心管處理,濾液即為酶解產(chǎn)物。

        1.3.10 酶解產(chǎn)物的鑒定 將酶解產(chǎn)物加到硅膠60薄層色譜板上,用V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水溶液)=2∶2∶1作為溶劑體系展開。利用含體積分?jǐn)?shù)10% H2SO4的乙醇溶液顯影產(chǎn)物,并在110 ℃加熱10 min。利用質(zhì)譜儀測定酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布。

        1.3.11 數(shù)據(jù)分析 所有實驗是3次平行試驗的平均值,數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。 使用Microsoft Excel程序和Design-Expert 8.0.5.0統(tǒng)計軟件分析結(jié)果。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 7種因素對菌株產(chǎn)瓊膠酶的影響

        采用PBD考察7種因素對菌株產(chǎn)瓊膠酶的影響,結(jié)果如表2所示。將這些結(jié)果擬合到式(2):

        表2 瓊膠酶發(fā)酵PBD試驗結(jié)果

        Y=0.35-0.067A+0.26B-0.12C+0.12D+0.28E+0.074F+0.037G。

        (2)

        其中:Y是瓊脂酶活力;A、B、C、D、E、F、G分別代表瓊脂含量、酵母浸膏含量、MgSO4·7H2O含量、CaCl2含量、培養(yǎng)基初始pH、裝液量和接種量。 各因素的方差分析如表3所示,可見,因素B(酵母浸膏含量)和因素E(培養(yǎng)基初始pH值)的P值分別為0.019 9和0.014 6,均小于0.05,說明這兩個因素對Stenotrophomonassp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的活力影響顯著。其他5個因素的P值均大于0.05,說明對該菌株產(chǎn)瓊膠酶的活力影響不顯著。因此,酵母浸膏含量和培養(yǎng)基初始pH值的置信度均大于95%。對這兩個因素進(jìn)行進(jìn)一步考察,其他5個因素則維持在初始水平。

        表3 PBD試驗方差分析結(jié)果

        2.2 適當(dāng)區(qū)域的SAM確定

        通過氮源酵母浸膏和培養(yǎng)基初始pH值兩個因素同時變化的SAM進(jìn)行最優(yōu)條件搜索,試驗設(shè)計組合及結(jié)果如表4所示??梢?,第2組瓊膠酶酶活力達(dá)到高峰,而第4組生物量達(dá)到峰值。Stenotrophomonassp.NTa的生長需要豐富的營養(yǎng)物質(zhì),而酵母浸膏中含有大量氨基酸及多肽,可保證菌株的生長需求,但過高濃度的氨基酸和多肽則會抑制微生物對酶的合成。由于本研究的目的主要是想提高菌株NTa所產(chǎn)瓊膠酶的活力,所以選擇第2組的條件作進(jìn)一步的研究。

        表4 SAM設(shè)計及結(jié)果

        2.3 重要因素的RSM優(yōu)化

        基于PBD和SAM結(jié)果,采用RSM對氮源酵母浸膏和培養(yǎng)基初始pH值重要因素的水平及其互作效應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化和分析,結(jié)果如表5所示??梢姡谒?3次實驗中,瓊膠酶活力在0.241~2.038 U/mL之間變化。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析結(jié)果見表6。式3被用來解釋變量與瓊膠酶活力之間的關(guān)系:

        表5 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果

        (3)

        其中:Y表示瓊膠酶活力;X1和X2分別是氮源酵母浸膏和培養(yǎng)基初始pH值。

        方差分析結(jié)果如表6所示,可見,模型P=0.000 2<0.001,說明模型極顯著。失擬項P=0.1634>0.05,失擬項不顯著,該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)決定系數(shù)R2的值可知,95.35%的酶活力變化可由此方程來解釋,模型擬合程度良好,可以通過回歸方程準(zhǔn)確描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。根據(jù)校正決定系數(shù)Radj的值可知,僅有總變異的8%不能由該模型來解釋。

        表6 中心組合試驗方差分析結(jié)果

        由圖1可以看出,軟件擬合響應(yīng)面各試驗點的預(yù)測值和真實值的線性關(guān)系基本在同一條直線上,表明該模型對試驗結(jié)果進(jìn)行擬合的程度良好。因此,該模型可用于Stenotrophomonassp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶,通過此模型可以代替真實的試驗點對瓊膠酶發(fā)酵條件優(yōu)化進(jìn)行分析和預(yù)測。

        各個變量及對響應(yīng)值的影響可以通過回歸方程軟件繪制三維響應(yīng)面及其對應(yīng)的等高線圖來解釋。各因素之間的交互強弱可以通過等高線的形狀反映,兩因素交互作用顯著顯示橢圓形,反之則顯示圓形。由圖2可見,氮源酵母浸膏含量與培養(yǎng)基初始pH值二者的交互作用對瓊膠酶活力的影響并不明顯,在二者選取一個適中值時,瓊膠酶活力將會到最高值,而超出或低于適中值時,酶活力降低。利用軟件對回歸方程進(jìn)行規(guī)范形分析并結(jié)合圖2可知,回歸模型存在穩(wěn)定點,響應(yīng)面預(yù)測最大點為穩(wěn)定點。分析得出,對Stenotrophomonassp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶具有重要影響的因子的最佳水平為:酵母浸膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.03%,培養(yǎng)基初始pH=8.0。在模型分析得到的最適產(chǎn)酶條件下,模型預(yù)測到的發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的活力為2.113 U/mL。

        2.4 驗證試驗

        為了確定結(jié)果的準(zhǔn)確性,在上述條件的基礎(chǔ)上做了5次重復(fù)實驗進(jìn)行驗證,在實際發(fā)酵中,得到瓊膠酶活力為(2.628±0.047)U/mL,接近模型預(yù)測值,說明該回歸方程可以準(zhǔn)確地反映菌株NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶中受到各個因素的影響程度。

        2.5 Stenotrophomonas sp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的動態(tài)規(guī)律

        對液態(tài)發(fā)酵瓊膠酶的動態(tài)規(guī)律進(jìn)行分析,結(jié)果如圖3所示。0~8 h,菌株的生長和生物量的增長都比較緩慢,產(chǎn)酶能力微弱,這段時期為細(xì)胞生長延滯期;8 h后,瓊脂為菌體提供充足的養(yǎng)分,菌株快速生長,菌株細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期;8~16 h,菌體生長速度迅速,但產(chǎn)酶能力依然微弱;16~32 h,菌體的生長速度減慢,但菌株的生物量繼續(xù)增大,瓊膠酶活力迅速升高,酶活力32 h時達(dá)到2.479 U/mL;32~48 h,菌株的生長和產(chǎn)酶能力逐漸趨于穩(wěn)定,瓊膠酶活力在48 h時達(dá)到最高為2.688 U/mL;56 h后,菌株的生物量開始下降。培養(yǎng)基總糖含量在在不同時間段有所變化,在0~8 h內(nèi)基本無變化, 8~16 h內(nèi)緩慢減少,16~32 h內(nèi)迅速減少,32 h后趨于穩(wěn)定??梢酝ㄟ^發(fā)酵曲線得出,菌株NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的酶活力增加主要在菌體的對數(shù)生長中后期(16~32 h)。

        2.6 酶解產(chǎn)物的鑒定

        采用TLC對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析,結(jié)果如圖4a所示,在反應(yīng)10 min時可以檢測到少量的八糖、六糖和四糖,隨著反應(yīng)時間的增加,八糖逐漸減少,六糖和四糖逐漸增加。30 min時,八糖消失,六糖和四糖明顯增多。48 h后產(chǎn)物主要為四糖,72 h后產(chǎn)物不再發(fā)生變化。

        使用質(zhì)譜儀對72 h的酶解產(chǎn)物進(jìn)一步分析,結(jié)果見圖4b,每個質(zhì)譜峰被認(rèn)為是質(zhì)子化形式的(M-H)-或(M+Cl)-。m/z為161.1(M-H)-時對應(yīng)的產(chǎn)物是3,6-脫水-α-L-半乳糖,m/z為323.1(M-H)-對應(yīng)的是二糖,m/z為629.2(M-H)-和665.2(M+Cl)-對應(yīng)的是四糖。所以,質(zhì)譜結(jié)果顯示,菌株NTa瓊膠酶水解瓊脂的產(chǎn)物包括3,6-脫水-α-L-半乳糖、二糖和四糖。

        3 結(jié)論

        本研究使用統(tǒng)計設(shè)計的方法確定Stenotrophomonassp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的最佳條件。優(yōu)化后瓊膠酶的活力在發(fā)酵48 h后高達(dá)2.688 U/mL。在發(fā)酵過程中,菌株NTa的瓊膠酶在對數(shù)期迅速合成。通過TLC和MALDI-TOF MS分析顯示,菌株NTa瓊膠酶水解瓊脂主要產(chǎn)生四糖。

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