陳艷紅，王海琪，馬芮萍，姜澤東，倪輝，朱艷冰

(1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；4.廈門市南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用與深加工重點實驗室，福建 廈門 361021)

0 引言

瓊脂是紅藻細(xì)胞壁的主要成分，主要由瓊脂糖和硫瓊膠組成[1]。瓊脂糖是不含有硫酸酯鹽的非離子型多糖，由D-半乳糖(G)和3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖(LA)以α-1,3-糖苷鍵和β-1,4-糖苷鍵反復(fù)交替連接形成的線性大分子，是形成凝膠的組分[1-2]。硫瓊膠和瓊脂糖的二糖單位類似，其中一些羥基被硫酸基、甲氧基和丙酮酸殘基等替代[1-2]，是非凝膠組分。

瓊膠酶屬于糖苷水解酶家族，它將瓊脂降解為具有重復(fù)二糖單位的寡糖。根據(jù)酶解類型，瓊膠酶分為α-瓊膠酶(EC 3.2.1.158)和β-瓊膠酶(EC 3.2.1.81)。α-瓊膠酶作用于瓊脂糖的α-1,3-糖苷鍵，產(chǎn)物是以3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖為還原性末端的瓊寡糖(agaro-oligosaccharide，AOs)；β-瓊膠酶作用于瓊脂糖的β-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)物是以D-半乳糖為還原性末端的新瓊寡糖(neoagaro-oligosaccharides，NAOs)[3]。瓊膠水解產(chǎn)生的寡糖表現(xiàn)出多種生物學(xué)活性[4]，如益生元效應(yīng)、增白效應(yīng)、保濕效應(yīng)和抗氧化作用等，在食品、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)有廣泛的潛在應(yīng)用。瓊膠酶除了用于制備寡糖外，也可以用于瓊脂糖凝膠DNA的回收、海藻原生質(zhì)體的制備、海藻中生物物質(zhì)的提取等[3]。

瓊膠酶主要從海洋微生物和海洋軟體動物的消化道中獲得，其中許多瓊膠酶已經(jīng)從細(xì)菌物種中被鑒定出來[5-10]。由于瓊膠酶的生產(chǎn)率低，瓊膠酶的商業(yè)用途受到限制，已經(jīng)有一些研究進(jìn)行產(chǎn)瓊膠酶微生物的培養(yǎng)條件或培養(yǎng)基組成的優(yōu)化[11-15]。

在先前的研究中，本課題組從廈門的海洋泥土樣品中分離出瓊膠酶的高產(chǎn)菌株Stenotrophomonassp.NTa[16]，并進(jìn)行了該菌株發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶條件的初步優(yōu)化，利用單因素優(yōu)化的方法確定了菌株 NTa 產(chǎn)瓊膠酶的最佳碳源是瓊脂、氮源是酵母浸膏，培養(yǎng)基中NaCl的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，產(chǎn)酶的最佳溫度為28 ℃[17]。在此基礎(chǔ)上，本研究擬應(yīng)用一些統(tǒng)計設(shè)計包括Plackett-Burman試驗(Plackett-Burman design，PBD)、最陡爬坡試驗(steepest ascent method，SAM)和響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)，進(jìn)一步建立Stenotrophomonassp.NTA發(fā)酵產(chǎn)酶的優(yōu)化方法，并鑒定菌株NTa瓊脂酶的酶解產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

種子培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 50.0，KNO35.0，MgSO4·7H2O 5.0，CaCl20.2，K2HPO40.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，蛋白胨5.0，酵母浸膏1.0，瓊脂2.0。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 50.0，KNO35.0，MgSO4·7H2O 5.0，CaCl20.2，K2HPO40.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，瓊脂2.0。通過1 mol/L NaOH將培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)至7.5。

新瓊二糖(NA2)、新瓊四糖(NA4)、新瓊六糖(NA6)和新瓊八糖(NA8)等新瓊寡糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海ZZBIO有限公司，其他試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

WFJ型可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；3 ku超濾離心管，Millipore，USA；Labconco FreeZone 6 plus冷凍干燥機(jī)，ThermoFisher，USA；Waters Maldi Synspt Q-TOF質(zhì)譜儀，Waters Corp，USA。

1.3 方法

1.3.1 瓊膠酶粗酶樣品的制備 將產(chǎn)瓊膠酶細(xì)菌NTa單菌落接種于5 mL種子培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h。將1 mL上述培養(yǎng)物接種到50 mL種子培養(yǎng)基(在250 mL錐形瓶)中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。將制備的接種物以質(zhì)量比為1∶50的比例轉(zhuǎn)移到50 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中(在250 mL錐形瓶)，28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)36 h。

1.3.2 瓊膠酶粗酶樣品的制備 發(fā)酵液于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清液即為發(fā)酵粗酶液。

1.3.3 瓊膠酶活力的測定 瓊膠酶的活力測定參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。在40 ℃、pH= 7.0條件下，以每分鐘釋放1 μmol還原糖(以葡萄糖計)所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

1.3.4 生物量的測定 取1 mL發(fā)酵液，在12 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液，保留菌體沉淀，加入去離子水至 3 mL，充分混勻后，測定其在600 nm 處的吸光度值，以去離子水為空白對照，檢測微生物的生物量。

1.3.5 總糖的測定 取稀釋10倍的發(fā)酵液1 mL于試管中，加入2 mL蒽酮試劑，混勻，沸水浴反應(yīng)10 min，冷卻至室溫后，放置10 min，在620 nm處測定吸光度值。

1.3.6 PBD 采用PBD試驗選擇影響瓊膠酶活力的因素，對瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、酵母浸膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、MgSO4·7H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)(D)、 培養(yǎng)基初始pH值(E)、裝液量(F)及接種量(G)7個因素進(jìn)行考察，分別選擇高水平和低水平，因素水平設(shè)計如表1所示。 測定樣品的瓊膠酶活力和生物量，選擇置信度高(大于95%)的因素進(jìn)行進(jìn)一步考察。

表1 瓊膠酶發(fā)酵PBD設(shè)計因素及水平

1.3.7 SAM 為了接近瓊脂酶產(chǎn)量的最高區(qū)域，在PBD試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上確定最陡上升的方向和合理的步長。

1.3.8 RSM 基于PBD和SAM的結(jié)果，使用中心組合試驗設(shè)計，進(jìn)一步評估對菌株產(chǎn)瓊膠酶有顯著影響的變量。變量分別在5個不同的層次進(jìn)行研究。測定了試驗設(shè)計中瓊膠酶活力的實際值和預(yù)測值的響應(yīng)。對獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)用多元回歸分析。系統(tǒng)的行為由式(1)來解釋：

(1)

其中：Y是預(yù)測的響應(yīng)值(瓊膠酶活力，U/mL)；b0，bi和bij是常系數(shù)；xi和xj是編碼的自變量。使用Design Expert 8.0.5.0對模型進(jìn)行統(tǒng)計分析以評估方差分析。

1.3.9 酶解產(chǎn)物的制備 將發(fā)酵粗酶液通過冷凍干燥機(jī)濃縮成粉末，將酶粉末溶于50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.0)中，然后用150倍體積的相同緩沖液透析過夜4次。透析樣品用作部分純化的瓊膠酶。將5 mL酶溶液(1.2 U/mL)加入15 mL含有1.0%(m/V)瓊脂的50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.0)中，40 ℃下120 r/min進(jìn)行振蕩反應(yīng)。每隔一段時間取樣，利用DNS法[18]測定釋放的還原糖的量。溫育72 h后，釋放的還原糖量沒有變化。在沸水中加熱10 min停止反應(yīng)。反應(yīng)物在4 ℃下18 000g離心20 min，上清液利用3 ku超濾離心管處理，濾液即為酶解產(chǎn)物。

1.3.10 酶解產(chǎn)物的鑒定 將酶解產(chǎn)物加到硅膠60薄層色譜板上，用V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水溶液)=2∶2∶1作為溶劑體系展開。利用含體積分?jǐn)?shù)10% H2SO4的乙醇溶液顯影產(chǎn)物，并在110 ℃加熱10 min。利用質(zhì)譜儀測定酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析 所有實驗是3次平行試驗的平均值，數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。 使用Microsoft Excel程序和Design-Expert 8.0.5.0統(tǒng)計軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 7種因素對菌株產(chǎn)瓊膠酶的影響

采用PBD考察7種因素對菌株產(chǎn)瓊膠酶的影響，結(jié)果如表2所示。將這些結(jié)果擬合到式(2)：

表2 瓊膠酶發(fā)酵PBD試驗結(jié)果

Y=0.35-0.067A+0.26B-0.12C+0.12D+0.28E+0.074F+0.037G。

(2)

其中：Y是瓊脂酶活力；A、B、C、D、E、F、G分別代表瓊脂含量、酵母浸膏含量、MgSO4·7H2O含量、CaCl2含量、培養(yǎng)基初始pH、裝液量和接種量。 各因素的方差分析如表3所示，可見，因素B(酵母浸膏含量)和因素E(培養(yǎng)基初始pH值)的P值分別為0.019 9和0.014 6，均小于0.05，說明這兩個因素對Stenotrophomonassp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的活力影響顯著。其他5個因素的P值均大于0.05，說明對該菌株產(chǎn)瓊膠酶的活力影響不顯著。因此，酵母浸膏含量和培養(yǎng)基初始pH值的置信度均大于95%。對這兩個因素進(jìn)行進(jìn)一步考察，其他5個因素則維持在初始水平。

表3 PBD試驗方差分析結(jié)果

2.2 適當(dāng)區(qū)域的SAM確定

通過氮源酵母浸膏和培養(yǎng)基初始pH值兩個因素同時變化的SAM進(jìn)行最優(yōu)條件搜索，試驗設(shè)計組合及結(jié)果如表4所示?？梢?，第2組瓊膠酶酶活力達(dá)到高峰，而第4組生物量達(dá)到峰值。Stenotrophomonassp.NTa的生長需要豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，而酵母浸膏中含有大量氨基酸及多肽，可保證菌株的生長需求，但過高濃度的氨基酸和多肽則會抑制微生物對酶的合成。由于本研究的目的主要是想提高菌株NTa所產(chǎn)瓊膠酶的活力，所以選擇第2組的條件作進(jìn)一步的研究。

表4 SAM設(shè)計及結(jié)果

2.3 重要因素的RSM優(yōu)化

基于PBD和SAM結(jié)果，采用RSM對氮源酵母浸膏和培養(yǎng)基初始pH值重要因素的水平及其互作效應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化和分析，結(jié)果如表5所示?？梢姡谒?3次實驗中，瓊膠酶活力在0.241～2.038 U/mL之間變化。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析結(jié)果見表6。式3被用來解釋變量與瓊膠酶活力之間的關(guān)系：

表5 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果

(3)

其中：Y表示瓊膠酶活力；X1和X2分別是氮源酵母浸膏和培養(yǎng)基初始pH值。

方差分析結(jié)果如表6所示，可見，模型P=0.000 2<0.001，說明模型極顯著。失擬項P=0.1634>0.05，失擬項不顯著，該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)決定系數(shù)R2的值可知，95.35%的酶活力變化可由此方程來解釋，模型擬合程度良好，可以通過回歸方程準(zhǔn)確描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。根據(jù)校正決定系數(shù)Radj的值可知，僅有總變異的8%不能由該模型來解釋。

表6 中心組合試驗方差分析結(jié)果

由圖1可以看出，軟件擬合響應(yīng)面各試驗點的預(yù)測值和真實值的線性關(guān)系基本在同一條直線上，表明該模型對試驗結(jié)果進(jìn)行擬合的程度良好。因此，該模型可用于Stenotrophomonassp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶，通過此模型可以代替真實的試驗點對瓊膠酶發(fā)酵條件優(yōu)化進(jìn)行分析和預(yù)測。

各個變量及對響應(yīng)值的影響可以通過回歸方程軟件繪制三維響應(yīng)面及其對應(yīng)的等高線圖來解釋。各因素之間的交互強弱可以通過等高線的形狀反映，兩因素交互作用顯著顯示橢圓形，反之則顯示圓形。由圖2可見，氮源酵母浸膏含量與培養(yǎng)基初始pH值二者的交互作用對瓊膠酶活力的影響并不明顯，在二者選取一個適中值時，瓊膠酶活力將會到最高值，而超出或低于適中值時，酶活力降低。利用軟件對回歸方程進(jìn)行規(guī)范形分析并結(jié)合圖2可知，回歸模型存在穩(wěn)定點，響應(yīng)面預(yù)測最大點為穩(wěn)定點。分析得出，對Stenotrophomonassp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶具有重要影響的因子的最佳水平為：酵母浸膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.03%，培養(yǎng)基初始pH=8.0。在模型分析得到的最適產(chǎn)酶條件下，模型預(yù)測到的發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的活力為2.113 U/mL。

2.4 驗證試驗

為了確定結(jié)果的準(zhǔn)確性，在上述條件的基礎(chǔ)上做了5次重復(fù)實驗進(jìn)行驗證，在實際發(fā)酵中，得到瓊膠酶活力為(2.628±0.047)U/mL，接近模型預(yù)測值，說明該回歸方程可以準(zhǔn)確地反映菌株NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶中受到各個因素的影響程度。

2.5 Stenotrophomonas sp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的動態(tài)規(guī)律

對液態(tài)發(fā)酵瓊膠酶的動態(tài)規(guī)律進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。0～8 h,菌株的生長和生物量的增長都比較緩慢，產(chǎn)酶能力微弱，這段時期為細(xì)胞生長延滯期;8 h后，瓊脂為菌體提供充足的養(yǎng)分，菌株快速生長，菌株細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期；8～16 h，菌體生長速度迅速，但產(chǎn)酶能力依然微弱；16～32 h，菌體的生長速度減慢，但菌株的生物量繼續(xù)增大，瓊膠酶活力迅速升高，酶活力32 h時達(dá)到2.479 U/mL；32～48 h，菌株的生長和產(chǎn)酶能力逐漸趨于穩(wěn)定，瓊膠酶活力在48 h時達(dá)到最高為2.688 U/mL；56 h后，菌株的生物量開始下降。培養(yǎng)基總糖含量在在不同時間段有所變化，在0～8 h內(nèi)基本無變化， 8～16 h內(nèi)緩慢減少，16～32 h內(nèi)迅速減少，32 h后趨于穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^發(fā)酵曲線得出，菌株NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的酶活力增加主要在菌體的對數(shù)生長中后期(16～32 h)。

2.6 酶解產(chǎn)物的鑒定

采用TLC對酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4a所示，在反應(yīng)10 min時可以檢測到少量的八糖、六糖和四糖，隨著反應(yīng)時間的增加，八糖逐漸減少，六糖和四糖逐漸增加。30 min時，八糖消失，六糖和四糖明顯增多。48 h后產(chǎn)物主要為四糖，72 h后產(chǎn)物不再發(fā)生變化。

使用質(zhì)譜儀對72 h的酶解產(chǎn)物進(jìn)一步分析，結(jié)果見圖4b，每個質(zhì)譜峰被認(rèn)為是質(zhì)子化形式的(M-H)-或(M+Cl)-。m/z為161.1(M-H)-時對應(yīng)的產(chǎn)物是3,6-脫水-α-L-半乳糖，m/z為323.1(M-H)-對應(yīng)的是二糖，m/z為629.2(M-H)-和665.2(M+Cl)-對應(yīng)的是四糖。所以，質(zhì)譜結(jié)果顯示，菌株NTa瓊膠酶水解瓊脂的產(chǎn)物包括3,6-脫水-α-L-半乳糖、二糖和四糖。

3 結(jié)論

本研究使用統(tǒng)計設(shè)計的方法確定Stenotrophomonassp.NTa發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的最佳條件。優(yōu)化后瓊膠酶的活力在發(fā)酵48 h后高達(dá)2.688 U/mL。在發(fā)酵過程中，菌株NTa的瓊膠酶在對數(shù)期迅速合成。通過TLC和MALDI-TOF MS分析顯示，菌株NTa瓊膠酶水解瓊脂主要產(chǎn)生四糖。