張世佳,馮建軍,郭松林,王藝磊,林 鵬

(1.集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021；2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術教育部工程研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是一種人魚畜共患的病原菌，其存活范圍廣，能適應多種復雜環(huán)境。該菌可致人、魚、畜感染，同時伴隨出血性敗血癥，嚴重可致死[1]。在魚類養(yǎng)殖環(huán)境中也會引起細菌性敗血癥，造成嚴重的經(jīng)濟損失。傳統(tǒng)的檢測方法主要有分離培養(yǎng)法和生理生化法[2]，但這些方法檢測周期較長，不能滿足快速檢測的要求。免疫檢測法快速簡單、特異性強，然而靈敏度不高[3]。分子檢測手段(如PCR法[4])特異性強、靈敏度高，但需要較為昂貴的變溫儀器，只適合在實驗室檢測。

基于鎖式探針(padlock probe)[5]的超分支滾環(huán)擴增(hyper-branched rolling circle amplification,HRCA)是一種恒溫核酸擴增檢測法。該方法的原理是，設計特異性的鎖式探針與一對通用引物，鎖式探針的兩端與目標DNA通過互補連接成環(huán)，通用引物識別環(huán)狀鎖式探針，實現(xiàn)對鎖式探針的超分支滾環(huán)擴增，從而達到信號放大的目的[6]。該技術依賴于探針，只有在兩端的捕捉序列與目標DNA完全互補配對的前提下才能成環(huán)，因此檢測特異性強，已成功應用于醫(yī)學[7]、食品[8]、農業(yè)[9]等領域。HRCA由于是恒溫擴增，不需要昂貴的儀器，恒溫水浴鍋便可進行恒溫擴增，并和紙基傳感器技術相結合[10]，可以直接讀取結果。本研究首次將HRCA法應用于水產(chǎn)病原菌嗜水氣單胞菌的檢測，并在實際樣品的提取中應用水煮法[11]，簡化了處理步驟。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗菌株

嗜水氣單胞菌B11分離于病變鰻鱺，并經(jīng)Biolog自動生化鑒定系統(tǒng)(GeneⅢ)鑒定為嗜水氣單胞菌[12]。特異性交叉實驗所用菌株均來自西班牙普通微生保藏中心(CETC)。

1.1.2 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒(GK4003-100)購自上海捷瑞生物工程有限公司;T4 DNA連接酶、Bst DNA 聚合酶、Exonuclease Ⅰ、Exonuclease Ⅲ、dNTPs源自美國Biolabs公司；鎖式探針和引物由上海生工生物工程公司合成。

1.1.3 主要儀器

HH·S21-4-S恒溫水浴鍋購自上海坤誠公司；GelDoc-It2 310凝膠成像儀購自美國UVP公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 探針及引物設計

選取一段嗜水氣單胞菌獨有的AER基因序列(NC_008570)[13]，采用Primer Premier 5.0及Oligo軟件設計探針，探針兩端的捕捉序列與待檢目標序列靶標互補[14](見表1，鎖式探針中的大寫字母序列)，探針中間的連接序列采用與嗜水氣單胞菌序列相差極大的野豬MSTN中的一段特異性序列作為連接序列和引物擴增的結合序列(見表1，鎖式探針中的小寫字母序列)。采用TheMFold(http://www.unafold.org/hybrid2.php)預測探針的結構，以確保二級結構能值最小，防止發(fā)夾結構的產(chǎn)生，同時探針的5′端進行磷酸化修飾，便于環(huán)化后探針3′和5′端的末端粘合。針對探針設計一對通用引物P1和P2用于探針的擴增。

表1 鎖式探針及引物

1.2.2 DNA提取

根據(jù)基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 連接反應

10 μL的連接反應體系:10×T4 DNA ligase buffer(50 mmol/L Tris-HCl、0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、50%甘油)1 μL，400 U/μL T4 DNA 連接酶1 μL，250 nmol/L探針1 μL、DNA模板2.5 μL、用無菌雙蒸水補至10 μL。體系在16 ℃下反應1 h，然后65 ℃溫育20 min后停止反應。

1.2.4 外切酶處理

連接反應體系中還有許多雙鏈和單鏈DNA，會在擴增的過程中產(chǎn)生背景信號，可能導致假陽性的結果[15]，采用Exonuclease Ⅰ和Exonuclease Ⅲ對產(chǎn)物進行處理，除去連接產(chǎn)物中未成環(huán)的探針和DNA模板[16]。20 μL酶切體系：連接產(chǎn)物10 μL，20 U/μL Exonuclease Ⅰ 1 μL，100 U/μL Exonuclease Ⅲ 1 μL，10×buffer(67 mmol/L Glycine-KOH、1 mmol/L DTT、6.7 mmol/L MgCl2)2 μL,用無菌雙蒸水補至20 μL。酶切體系37 ℃反應2 h，然后85 ℃溫育20 min后停止酶切。

1.2.5 HRCA擴增反應

HRCA反應的25 μL擴增體系：經(jīng)外切酶處理后的連接產(chǎn)物4 μL，10 μmol/L P1 1.25 μL，10 μmol/L P2 1.25 μL，10 μmol/L dNTPs 0.75 μL，4 U/μLBstDNA 聚合酶1 μL，10×BstDNA polymerase buffer(20 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L KCl、10 mmol/L (NH4)2SO4、2 mmol/L MgSO4、0.1%Triton X-100) 2.5 μL，用無菌雙蒸水補至25 μL。在63 ℃下擴增反應1 h。

1.2.6 擴增產(chǎn)物凝膠電泳

取5 μL HRCA產(chǎn)物用2%(質量分數(shù))瓊脂糖電泳檢測，溴化乙錠染色，紫外凝膠成像系統(tǒng)照相分析。

1.2.7 HRCA檢測的特異性

分別選取了副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、維氏氣單胞菌(Aeromonasvickers)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、哈維氏弧菌(Vibrioharvey)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)7種菌株，劃線挑菌后過夜培養(yǎng)，經(jīng)平板計數(shù)法確定濃度后，稀釋為1×108cfu/mL的菌液。然后，提取DNA，按照上述步驟進行連接、酶切、擴增，進行HRCA檢測，同時以嗜水氣單胞菌菌株B11作為陽性對照、無菌雙蒸水作為空白對照，產(chǎn)物用2%(質量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.8 HRCA檢測的靈敏度

選用嗜水氣單胞菌B11作為陽性菌，活化菌株，制作成1×106cfu/mL的菌懸液。用0.9%(體積分數(shù))的無菌生理鹽水對嗜水氣單胞菌的菌液進行10倍梯度稀釋，稀釋到1×102cfu/mL,對不同稀釋度的菌液提取DNA作為模板，在1×102～1×106cfu/mL范圍內進行HRCA檢測，以確定HRCA檢測體系的靈敏度。

1.2.9 HRCA實際樣品檢測

將購買的美洲鰻鱺(Anguillarostrata)經(jīng)饑餓處理3 d后，將嗜水氣單胞菌用0.9%(體積分數(shù))無菌生理鹽水稀釋為2×107cfu/mL，注射到鰻鱺腹腔內，同時設立1組只注射0.9%無菌生理鹽水[17]的作為對照組。7 d后選擇無明顯發(fā)病的鰻鱺，取其0.5 g肌肉組織，勻漿后沸水加熱10 min，取上清液2.5 μL用于檢測[11]。

2 結果

2.1 嗜水氣單胞菌HRCA檢測體系的建立和優(yōu)化

2.1.1 鎖式探針濃度的確定

按照1.2.3所述的鎖式探針連接反應條件，設置6個鎖式探針濃度分別為25 pmol/L、250 pmol/L、2.5 nmol/L、25 nmol/L、250 nmol/L和2.5 mmol/L，連接反應后依據(jù)1.2.4和1.2.5步驟進行酶切與HRCA擴增反應，產(chǎn)物的電泳結果見圖1。當探針濃度大于或等于25 nmol/L時，條帶亮度相近并且清晰；而低于此濃度，電泳條帶基本看不到。因此選擇25 nmol/L作為反應體系的探針濃度。此外，凝膠電泳結果呈階梯狀分布，條帶的大小依次為102 bp的整數(shù)倍，這證明電泳的結果與理論值是一致的。

2.1.2 HRCA擴增溫度的確定

HRCA反應中不同擴增溫度的結果見圖2。溫度為51 ℃和54 ℃時，沒有條帶； 57 ℃時，開始有條帶產(chǎn)生，但不夠清晰；60 ℃和63 ℃時，條帶最為清晰；66 ℃時，條帶模糊不清，沒有階梯狀條帶產(chǎn)生。故選擇63 ℃作為擴增的溫度。

2.2 HRCA檢測的特異性結果

HRCA特異性檢測結果見圖3。8株實驗菌株中，只有嗜水氣單胞菌B11可以檢測出，其余7株對照菌株均不能檢出。這表明，HRCA檢測體系可以特異性地檢測出嗜水氣單胞菌，特異性良好，適用于嗜水氣單胞菌的檢測。

2.3 HRCA檢測的靈敏度結果

HRCA檢測的靈敏度實驗結果見圖4。其最低檢測濃度為1×103cfu/mL，在該濃度時可以檢測得到，但條帶較微弱；小于該濃度時條帶已經(jīng)不可見；濃度在1×104～1×106cfu/mL時，條帶清晰可見。而常規(guī)的PCR檢測手段只能檢測到3×104cfu/mL[18]。

2.4 HRCA實際樣品檢測結果

嗜水氣單胞菌感染美洲鰻鱺的檢測實驗結果(見圖5)表明，感染的美洲鰻鱺樣品條帶清晰可見，注射無菌生理鹽水的健康鰻鱺樣品無條帶出現(xiàn)。這證明HRCA法能夠從感染的鰻鱺樣品中檢測出嗜水氣單胞菌，該法可用于水產(chǎn)生物病原菌感染的檢測。

3 討論

滾環(huán)擴增檢測技術依賴于鎖式探針對目標DNA的特異性結合[19]，只有探針兩端的捕捉序列與待檢的目標序列完全互補結合[20]，T4 DNA 連接酶才能將鎖式探針連接環(huán)化，若有一個堿基錯配，探針的連接就無法進行[21]，從而保證了檢測的特異性。此外，HRCA檢測的實質是對連接成環(huán)的探針進行擴增[22]，并非對目標DNA序列進行擴增[23]，既減少了交叉污染，也最大限度地減少了實際樣品中抑制因子對檢測的影響[24]，從而放大了信號值，有助于檢測靈敏度的提高。

由于HRCA法擴增的是環(huán)狀探針，因此沒有成環(huán)的線性探針和目標DNA會對擴增產(chǎn)生背景信號，影響靈敏度，為此本研究加入了Exonuclease Ⅰ和Exonuclease Ⅲ,特異性地降解掉了未成環(huán)的單鏈探針[25]和未反應的DNA模板[26]，效果良好。鎖式探針的濃度對HRCA檢測至關重要。濃度過低，成環(huán)的探針少，導致HRCA的檢測信號低，不能如實反映嗜水氣單胞菌的真實含量；濃度過高，有可能降解不完全，使得背景信號增大。本檢測的最佳濃度為25 nmol/L。HRCA的反應溫度包含鎖式探針連接溫度和擴增反應溫度。連接溫度是由T4 DNA連接酶決定。T4 DNA連接酶有最適反應溫度，根據(jù)試劑盒說明書，其最適反應溫度為16 ℃。而擴增反應溫度是由Bst DNA 聚合酶的最適反應溫度決定的。實驗證明，在60 ℃和63 ℃時，條帶最為清晰，而超出了此溫度范圍，則沒有條帶或者條帶不清晰，即60～63 ℃為Bst DNA 聚合酶的最適溫度。因此，本研究選用63 ℃為HRCA反應的擴增溫度。

用分子生物學手段檢測嗜水氣單胞菌，相較于傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)和免疫法，具有突出的優(yōu)點——靈敏度高、特異性強，但其缺點也顯而易見——需要較為昂貴的變溫儀器。對于PCR方法[27],如果要做不同菌的高通量檢測，需要設計不同的引物進行多重PCR，這不可避免地產(chǎn)生多重PCR假陽性和不同引物相互影響擴增效率的問題。而采用HRCA法檢測嗜水氣單胞菌，其靈敏度為1×103cfu/mL，高于免疫法的4.0×104cfu/mL[3]和PCR法的3×104cfu/mL[18]；并且不需要PCR儀，采用恒溫水浴鍋即可進行擴增，大大簡化了處理步驟；此外，相較于PCR方法，鎖式探針的設計在保證中間連接序列不變的前提下，針對不同目標序列設計不同的捕捉序列，即可用一對引物擴增多種探針[28]，可高通量[29]、多靶標檢測[30]，克服了多重PCR進行多種病菌檢測時的不利影響。

4 結論

本文首次應用HRCA法進行了嗜水氣單胞菌的檢測。該法靈敏度高、特異性強，樣品處理簡單，不需要昂貴的儀器，有可能在水產(chǎn)養(yǎng)殖現(xiàn)場檢測中得到推廣應用?；阪i式探針的特點，后續(xù)研究可以根據(jù)中間連接序列設計一對通用引物，針對不同菌的目標序列設計不同的捕捉序列，實現(xiàn)多種水產(chǎn)病原菌的高通量檢測，為水產(chǎn)病害的鑒定及制定治療方案提供更簡潔、快速、高效的檢測方法。