程鐵轅，尹希杰，夏于林，蘇 靜

（1.成都海關(guān)技術(shù)中心宜賓分部 國(guó)家酒類檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000；2.自然資源部第三海洋研究所信息與測(cè)試保障中心，福建廈門 361000）

0 引言

當(dāng)前，國(guó)內(nèi)白酒市場(chǎng)上普遍以固態(tài)法白酒酒質(zhì)最佳，其以純糧釀造及非添加等為主要賣點(diǎn)，消費(fèi)者認(rèn)可度最高，同時(shí)，因其較高的商品利潤(rùn)以及摻假白酒鑒別難度極大，令固態(tài)法白酒成為摻假重災(zāi)區(qū)。白酒摻假方式多種多樣，主要通過添加食用酒精、香精、香料等物質(zhì)實(shí)現(xiàn)，摻假白酒成品除理化指標(biāo)等達(dá)到國(guó)標(biāo)要求外，產(chǎn)品在口感上，也會(huì)盡可能地貼近固態(tài)法白酒真實(shí)口感。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上流行范圍最廣的白酒類別是濃香型白酒，相對(duì)而言，固態(tài)法濃香型白酒摻假工藝較為簡(jiǎn)單，主要添加物質(zhì)有乙醇（主要為食用酒精）和己酸乙酯兩種，其中，己酸乙酯是濃香型白酒的主體香味成分，添加的己酸乙酯主要為化學(xué)合成物質(zhì)或者液態(tài)法發(fā)酵產(chǎn)物等。盡管摻假的己酸乙酯能夠達(dá)到食品級(jí)，但無(wú)論是從濃香型白酒國(guó)標(biāo)GB/T 10781.1—2006《濃香型白酒》規(guī)定來(lái)看，還是從白酒市場(chǎng)交易公平公正的角度而言，此類摻假行為均是嚴(yán)格禁止的?，F(xiàn)階段涉及白酒摻假的鑒別研究更多地集中于食用酒精摻假方面，很多研究人員應(yīng)用了多種分析檢測(cè)技術(shù)，主要有穩(wěn)定同位素技術(shù)［1-6］、液相色譜 - 質(zhì)譜技術(shù)［7］、電子鼻技術(shù)等分析檢測(cè)技術(shù)［8］，上述技術(shù)在食品分析檢測(cè)中也應(yīng)用廣泛［9-10］，其中穩(wěn)定同位素技術(shù)在食用酒精鑒別方面的應(yīng)用效果較好，取得了一定的研究進(jìn)展［11-14］，但關(guān)于碳穩(wěn)定同位素技術(shù)應(yīng)用于固態(tài)法濃香型白酒中己酸乙酯摻假的鑒別研究，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究擬采用GC-C-IRMS技術(shù)，對(duì)5種不同等級(jí)、不同年份的固態(tài)法濃香型原酒和3種己酸乙酯摻假白酒中己酸乙酯碳同位素組成進(jìn)行分析研究，以期為市場(chǎng)監(jiān)管機(jī)構(gòu)及檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供一種己酸乙酯摻假白酒的鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

購(gòu)自川南某白酒廠不同等級(jí)不同年份的五糧固態(tài)法濃香型原酒樣品共5個(gè)品種，編號(hào)為1#～5#，其中，1#樣品為2009年產(chǎn)一級(jí)原酒，2#樣品為2018年產(chǎn)一級(jí)原酒，3#樣品為2018年產(chǎn)優(yōu)級(jí)原酒，4#樣品為2019年產(chǎn)一級(jí)原酒，5#樣品為2019年產(chǎn)優(yōu)級(jí)原酒；6#樣品為自制添加高酯酒摻假樣品（高酯酒購(gòu)自國(guó)內(nèi)某企業(yè)）；7#樣品為自制添加合成己酸乙酯摻假樣品（己酸乙酯為某網(wǎng)站購(gòu)買）；8#樣品為自制添加生物發(fā)酵法己酸乙酯摻假樣品（己酸乙酯為某網(wǎng)站購(gòu)買）。6#、7#和8#這3種摻假白酒是對(duì)市面上廣泛存在的幾種己酸乙酯摻假白酒的高度模擬。

1.2 試驗(yàn)條件

1.2.1 儀器設(shè)備與試劑

儀器設(shè)備：氣相色譜-高溫氧化-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀（GC-C-IRMS，美國(guó)Thermo Fisher公司），主要有氣相色譜儀（Trace GC Ultra）、燃燒爐（Combustion Ⅲ）、穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀（MAT253）。

試劑及耗材：高純He（99.999%）；選用己酸乙酯和乙酸戊酯兩種化合物作為碳同位素標(biāo)樣，用EA-IRMS分別標(biāo)定其碳同位素組成，己酸乙酯 δ13C 值為 -27.62‰±0.1‰，乙酸戊酯 δ13C 值為-29.06‰±0.1‰。

1.2.2 氣相色譜及質(zhì)譜條件

采用HP-INNOWax毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm，Agilent J&W）；載氣為高純氦氣，恒流模式，流速為3 mL/min，樣品采用不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為0.3～2 μL，柱溫箱起始溫度40 ℃，保持4 min，先以 5 ℃/min 升至 92 ℃，再以 30 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度230 ℃，氧化爐（NiO/CuO/Pt）溫度為960 ℃，還原爐溫度為640 ℃。離子源高壓10.0 kV，發(fā)射電流1.5 mA。每檢測(cè)兩個(gè)樣品后，進(jìn)一次標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.3 測(cè)試流程及結(jié)果表示

利用氣相色譜-高溫氧化-同位素比值質(zhì)譜儀進(jìn)行白酒中己酸乙酯單體碳同位素測(cè)試。GCC-IRMS由Thermo Trace GC Ultra型氣相色譜儀和GC Combustion Ⅲ裝置在線連接的MAT253同位素比值質(zhì)譜儀組成，單體化合物經(jīng)氣相色譜分離后依次進(jìn)入氧化爐裝置，并在960°下完全氧化為CO2，然后CO2被載氣帶入同位素比值質(zhì)譜儀進(jìn)行碳同位素組成測(cè)試。

穩(wěn)定同位素自然豐度一般用 δ 值表示，以千分差（‰，permill）為單位，即被分析樣品與試驗(yàn)室參比物質(zhì)相對(duì)測(cè)量得到的同位素比值的千分差，再將此值換算成相對(duì)于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的 δ 值。碳同位素值用相對(duì)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物VPDB作為參考標(biāo)準(zhǔn)，其值按以下公式計(jì)算：

式中 R（13C/12CVPDB）——國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物VPDB（Vienna Pee Dee Belemnite）的碳同位素豐度比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 己酸乙酯和乙酸戊酯標(biāo)樣測(cè)試結(jié)果

圖1為試驗(yàn)室60%乙醇水溶液配制己酸乙酯和乙酸戊酯的標(biāo)樣譜圖，譜圖中橫坐標(biāo)為時(shí)間（s），上圖縱坐標(biāo)為m/z 46/44和45/44信號(hào)比值；下圖縱坐標(biāo)為質(zhì)量數(shù)和所帶電荷數(shù)之比（m/z）44、45、46的離子流強(qiáng)度（mV）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品譜圖Fig.1 Standard sample spectrum

根據(jù)1.2.2色譜及質(zhì)譜條件，標(biāo)樣中乙酸戊酯化合物的出峰相對(duì)保留時(shí)間為620.3 s，m/z 44的信號(hào)強(qiáng)度為5 787 mV，己酸乙酯出峰相對(duì)保留時(shí)間為729.6 s，m/z 44的信號(hào)強(qiáng)度為7 759 mV試驗(yàn)使用的同位素質(zhì)譜儀器的m/z 44基線的信號(hào)強(qiáng)度約為70 mV，選擇樣品產(chǎn)生m/z 44信號(hào)強(qiáng)度為420 mV（6倍基線信號(hào)）時(shí)，目標(biāo)化合物碳元素物質(zhì)量為該方法的測(cè)試下限，當(dāng)m/z 44信號(hào)強(qiáng)度約為420 mV時(shí)，所需己酸乙酯絕對(duì)量為0.097 5 μg，即每μL樣品溶液中己酸乙酯的最低檢出限為0.097 5 μg/μL，若需樣品m/z 44信號(hào)強(qiáng)度在3 000～8 000 mV范圍內(nèi)，需要每μL樣品溶液中己酸乙酯的濃度為0.696～1.857 μg/μL。

試驗(yàn)室配制60%乙醇水溶液的己酸乙酯和乙酸戊酯標(biāo)樣的 δ13C值見表1。

表1 標(biāo)樣中己酸乙酯和乙酸戊酯 δ13C值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.1 The δ13C values and standard deviations of ethyl caproate and amyl acetate in standard samples

從表可以看出，將己酸乙酯標(biāo)樣重復(fù)三測(cè)定，δ13C值范圍在-27.15‰～-27.36‰之間，平均值為-27.28‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差的STD值為0.11，與真值的差值為0.34‰；將乙酸戊酯標(biāo)樣重復(fù)三測(cè)定，δ13C值范圍在-28.99‰～-29.15‰之間，平均值為-29.05‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差的STD值為0.09，與真值的差值為0.01‰。兩種標(biāo)樣 δ13C值的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于國(guó)際穩(wěn)定同位素測(cè)試允許值0.2‰，表明該方法測(cè)試平行性良好，測(cè)試精度滿足要求。

2.1.2 樣品測(cè)試結(jié)果

選擇5種固態(tài)法濃香型原酒中1#樣品和3種摻假白酒中7#樣品的譜圖進(jìn)行描述，1#樣品譜圖如圖2所示，7#樣品譜圖如圖3所示。譜圖中橫坐標(biāo)為時(shí)間（s），上圖縱坐標(biāo)為m/z 46/44和45/44信號(hào)比值；下圖縱坐標(biāo)為質(zhì)量數(shù)和所帶電荷數(shù)之比（m/z）44、45、46的離子流強(qiáng)度（mV）。由于固態(tài)法濃香型原酒樣品中成分復(fù)雜，檢測(cè)器只采集500～850 s之間的譜圖數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)m/z 44信號(hào)強(qiáng)度超過420 mV的峰共6個(gè)，根據(jù)與標(biāo)樣中己酸乙酯的保留時(shí)間對(duì)比，確定樣品中4號(hào)峰為目標(biāo)化合物己酸乙酯峰，出峰時(shí)間為715.6 s，m/z 44的信號(hào)強(qiáng)度為5 512 mV。7#樣品譜圖數(shù)據(jù)的采集時(shí)間與1#樣品相同，m/z 44信號(hào)強(qiáng)度超過420 mV的峰共2個(gè)，根據(jù)與標(biāo)樣中己酸乙酯的保留時(shí)間對(duì)比，確定樣品中1號(hào)峰為目標(biāo)化合物己酸乙酯峰，出峰時(shí)間為718.3 s，m/z 44的信號(hào)強(qiáng)度為8 151 mV。

圖2 1#樣品譜圖Fig.2 1# sample spectrum

圖3 7#樣品譜圖Fig.3 7# sample spectrum

1#～8#樣品測(cè)試結(jié)果見表2，每個(gè)樣品平行測(cè)試兩次，結(jié)果顯示己酸乙酯 δ13C值兩次測(cè)試差值范圍在0.01‰～0.32‰之間，能夠滿足高溫氧化法測(cè)試單體化合物碳同位素的技術(shù)精度要求。取兩次測(cè)試的平均值為測(cè)試結(jié)果，八個(gè)樣品的己酸乙酯 δ13C值范圍為-15.19‰～-33.97‰。可以發(fā)現(xiàn)1#～5#固態(tài)法濃香型原酒樣品與6#～8#摻假白酒樣品中己酸乙酯 δ13C值之間存在明顯差異，從整體數(shù)據(jù)比較來(lái)看，前者明顯高于后者。

表2 樣品中己酸乙酯 δ13C值Tab.2 The δ13C value of ethyl caproate in the sample

2.2 分析與討論

在8個(gè)樣品中，按照樣品類型可分為兩組，其中，1#～5#各固態(tài)法濃香型原酒為一組，1#～5#樣品包含了兩種不同等級(jí)（優(yōu)級(jí)、一級(jí)）、3個(gè)不同年份（2009年、2018年和2019年）的固態(tài)法濃香型原酒；6#～8#各自制摻假白酒為一組，6#～8#樣品包含了市面上廣泛存在的最主要的幾種己酸乙酯摻假的白酒。從測(cè)試結(jié)果來(lái)看，不同等級(jí)和年份的固態(tài)法濃香型原酒中己酸乙酯碳同位素值存在差異，其己酸乙酯 δ13C值范圍為-15.19‰～-22.14‰。就本次樣品測(cè)試結(jié)果而言，與2018年、2019年原酒相比，2009年原酒中己酸乙酯碳同位素值相對(duì)偏輕，此外，就各年份的優(yōu)級(jí)原酒和一級(jí)原酒而言，2019年的優(yōu)級(jí)原酒與一級(jí)原酒中己酸乙酯碳同位素值基本無(wú)差異，而2018年優(yōu)級(jí)原酒與一級(jí)原酒中己酸乙酯碳同位素值差異較大，其一級(jí)原酒中己酸乙酯碳同位素值相對(duì)偏重。優(yōu)級(jí)原酒（2018年）、一級(jí)原酒（2018年）和一級(jí)原酒（2009年）中己酸乙酯碳同位素組成的差異，可能是由釀酒原料（五種糧食及其配比）的碳同位素組成的差異、發(fā)酵工藝或保存過程中碳同位素分餾所導(dǎo)致，具體由哪種因素所導(dǎo)致，可能需要進(jìn)一步研究。

3種摻假白酒中（添加高酯酒摻假，添加化學(xué)合成己酸乙酯摻假，添加生物發(fā)酵法己酸乙酯摻假）己酸乙酯 δ13C值范圍為-28.34‰～-33.97‰，可以看出，摻假白酒中3種不同生成途徑的己酸乙酯 δ13C值也存在明顯差異，其中，生物發(fā)酵法生成的己酸乙酯 δ13C值-33.97‰，明顯低于化學(xué)合成的己酸乙酯 δ13C值-28.34‰，也進(jìn)一步驗(yàn)證了生物發(fā)酵法生成的己酸乙酯會(huì)產(chǎn)生較大的碳同位素分餾，導(dǎo)致生物發(fā)酵產(chǎn)生的己酸乙酯具有相對(duì)較低的 δ13C 值［15-17］。

對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)（見表3）：t檢驗(yàn)結(jié)果顯示 sig.（雙側(cè)）=0.001＜0.05，表明兩組數(shù)據(jù)均值之間存在顯著性差異，即固態(tài)法濃香型原酒與摻假白酒在己酸乙酯 δ13C值上存在顯著性差異，同時(shí)，也表明了添加一定數(shù)量的己酸乙酯（非固態(tài)發(fā)酵法來(lái)源）就會(huì)使原白酒中己酸乙酯碳同位素值發(fā)生變化，試驗(yàn)結(jié)果表明：利用GC-C-IRMS技術(shù)，對(duì)白酒中己酸乙酯 δ13C值進(jìn)行測(cè)試，就可能將固態(tài)法濃香型原酒與摻假白酒（己酸乙酯摻假）進(jìn)行有效區(qū)分。

表3 獨(dú)立樣本檢驗(yàn)Tab.3 Independent sample T-test

3 結(jié)語(yǔ)

本文采用GC-C-IRMS技術(shù)，分別對(duì)固態(tài)法濃香型原酒與摻假白酒中己酸乙酯碳同位素組成進(jìn)行分析測(cè)試，發(fā)現(xiàn)固態(tài)法濃香型原酒與摻假白酒在己酸乙酯 δ13C值上存在顯著性差異，原酒中己酸乙酯碳同位素組成相對(duì)摻假白酒明顯偏重，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示 sig.（雙側(cè)）=0.001＜0.05，表明該方法應(yīng)用于白酒中己酸乙酯的摻假鑒別具有一定的可行性，可以為市場(chǎng)監(jiān)管機(jī)構(gòu)及檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供一種具有一定應(yīng)用價(jià)值的分析方法。