趙文宇，徐璐，祁立波，姜鵬飛，秦磊，白帆，董秀萍*

（1.國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧省海產(chǎn)品精深加工產(chǎn)業(yè)共性技術(shù)創(chuàng)新平臺(tái)，大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.衢州鱘龍水產(chǎn)食品科技開(kāi)發(fā)有限公司，浙江 衢州 324000）

鱘魚(yú)（Acipenser sinensis）是體形較大、壽命較長(zhǎng)的一種淡水魚(yú)[1]。 隨市場(chǎng)需求增加，我國(guó)鱘魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展。 但目前鱘魚(yú)精深加工技術(shù)相對(duì)滯后，產(chǎn)品形式較為單一，主要為魚(yú)籽醬等。 魚(yú)籽醬生產(chǎn)過(guò)程存在大量加工副產(chǎn)物，魚(yú)肉占比大。 鱘魚(yú)肉厚、無(wú)肌間刺、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[2]，亟需開(kāi)發(fā)利用。 與其它養(yǎng)殖魚(yú)類相比，鱘魚(yú)魚(yú)肉脂肪含量較高，易發(fā)生氧化酸敗、產(chǎn)生不良?xì)馕叮?影響加工過(guò)程并縮短相關(guān)產(chǎn)品的貨架期，增加運(yùn)輸和貯藏的難度。 因此在加工鱘魚(yú)時(shí)，應(yīng)考慮對(duì)其進(jìn)行適度的脫脂處理。

脂肪對(duì)水產(chǎn)品原料加工適應(yīng)性及品質(zhì)有較大的影響[3]，脫脂技術(shù)在水產(chǎn)品加工中應(yīng)用廣泛。 漂洗法、壓榨法、有機(jī)溶劑萃取法、堿皂化法和酶法是目前常用的水產(chǎn)品脫脂方法。 對(duì)比其它方法，酶法脫脂作用條件溫和，能專一水解甘油三酯的酯鍵[4]，減少對(duì)其它成分的破壞且安全性高， 已成為重要的脫脂方式之一。 目前，相關(guān)研究主要以脫脂率為指標(biāo)對(duì)脫脂工藝進(jìn)行優(yōu)化。 另有歐陽(yáng)杰等[5]以脫脂前后魚(yú)糜彈性和白度衡量脫脂效果；王旋等[6]測(cè)定脫脂魚(yú)片干制過(guò)程的氧化酸敗程度以體現(xiàn)脫脂效果。 但目前對(duì)脫脂后樣品的脂肪酸組成、組織形態(tài)、揮發(fā)性組分的研究比較有限。

本研究以人工養(yǎng)殖的俄羅斯鱘魚(yú)為代表，探究適宜的酶法脫脂條件，旨在為鱘魚(yú)產(chǎn)品的精深加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍俄羅斯鱘魚(yú)：體長(zhǎng)600 mm～750 mm，質(zhì)量約4 kg/條～5 kg/條，衢州鱘龍水產(chǎn)食品科技開(kāi)發(fā)有限公司。 俄羅斯鱘魚(yú)捕獲后，宰殺、去頭、去尾、去內(nèi)臟后置于-40 ℃冷凍待用，使用時(shí)4 ℃解凍6 h，取背部魚(yú)肉。

堿性脂肪酶（酶活35 000 U/g）：深圳市綠維康生物有限公司；氫氧化鈉、濃硫酸（分析純）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；甘氨酸、五水硫酸銅（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑公司；正己烷（色譜純）：德國(guó)Meker 公司；甲醇（色譜純）：Sigma-Aldrich 公司；改良油紅O 染色液： 北京雷根生物技術(shù)有限公司； 烷烴（C8～C20）標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：瑞士Fluka Buchs 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UDK129 全自動(dòng)凱氏定氮儀：意大利VELP 公司；CM1950 冷凍切片機(jī)：德國(guó)Leica 公司；BX51 型倒置顯微鏡：日本Olympus 公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將鱘魚(yú)魚(yú)肉置于4 ℃解凍6 h 后，取背部肌肉，切成長(zhǎng)、寬、厚為5 cm×3 cm×0.5 cm 的肉片待用。

1.3.2 鱘魚(yú)肌肉酶法脫脂工藝的優(yōu)化

將堿性脂肪酶溶解在甘氨酸（C2H5NO2)-氫氧化鈉（NaOH）緩沖溶液中即為脫脂液，采用魚(yú)肉浸泡于脫脂液的方式，在溫度30 ℃、料液比1∶3（g/mL）的條件下進(jìn)行酶法脫脂單因素試驗(yàn)，因素基本條件設(shè)置為：pH9.0、脫脂時(shí)間50 min。 各因素梯度設(shè)置為：酶濃度10、20、30、40、50 U/mL；浸泡時(shí)間30、40、50、60、70 min；pH 值7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。 每次改變一個(gè)因素，以鱘魚(yú)肌肉的脫脂率和蛋白質(zhì)損失率為指標(biāo)。 試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.2.1 脫脂率測(cè)定

參照國(guó)標(biāo)GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》中的索氏抽提法對(duì)脫脂前后肌肉脂肪含量進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算脫脂率。每一指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。 參照應(yīng)巧玲等[7]的方法按下式計(jì)算脫脂率。

脫脂率/%=（A0-A）/A0×100

式中：A0為脫脂前鱘魚(yú)肌肉脂肪含量，g；A 為脫脂后鱘魚(yú)肌肉脂肪含量，g。

1.3.2.2 蛋白質(zhì)損失率測(cè)定

參照國(guó)標(biāo)GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法對(duì)脫脂前后肌肉粗蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算蛋白質(zhì)損失率。 每一指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果取平均值。 參照Cansu 等[8]的方法，按下式計(jì)算蛋白質(zhì)損失率。

蛋白質(zhì)損失率/%=（F0-F）/F0×100

式中：F0為脫脂前鱘魚(yú)肌肉蛋白質(zhì)含量，g；F 為脫脂后鱘魚(yú)肌肉蛋白質(zhì)含量，g。

1.3.3 脂肪酸含量測(cè)定

參考Yin 等[9]的方法，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法測(cè)定脫脂前后魚(yú)肉的脂肪酸組成，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.4 冷凍組織切片

參照楊宏旭等[10]的方法制作魚(yú)肉的冷凍組織切片。參照王肖燕等[11]的方法，采用改良油性O(shè) 染色法對(duì)冷凍組織切片進(jìn)行染色，觀察脂肪分布。

1.3.5 揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定

參考Huang 等[12]的方法采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（solid-phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）技術(shù)對(duì)脫脂前后的魚(yú)肉進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2016 進(jìn)行處理； 使用SPSS 19.0 分析數(shù)據(jù)，顯著性水平設(shè)定為p＜0.05；采用Origin 2018 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶濃度對(duì)脫脂率和蛋白質(zhì)損失率的影響

酶濃度對(duì)鱘魚(yú)肌肉脫脂率和蛋白質(zhì)損失率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 酶濃度對(duì)鱘魚(yú)肌肉脫脂率和蛋白質(zhì)損失率的影響Fig.1 Effects of lipase concentration on degreasing rate and protein loss rate of sturgeon muscle

從圖1 可以明顯觀察到脫脂率隨酶濃度的提高先增大后減小，于20 U/mL 時(shí)達(dá)到最大值29.85%，之后脫脂率逐漸降低，這一變化可能是由于脫脂過(guò)程酶催化油脂水解反應(yīng)是可逆反應(yīng)[13]，隨著酶濃度持續(xù)提高，水解反應(yīng)向右進(jìn)行，生成的甘油和脂肪酸堆積，反應(yīng)便又逆向進(jìn)行，發(fā)生酯化反應(yīng)生成更多甘油酯，從而脫脂速率減緩。 在酶濃度提高的同時(shí)蛋白質(zhì)損失率也隨之提高， 這是因?yàn)槊撝^(guò)程部分水溶性蛋白溶出，且在堿溶液中蛋白質(zhì)易發(fā)生水解反應(yīng)[14]，造成蛋白質(zhì)損失。 綜上，20 U/mL 為較適酶濃度，此時(shí)脫脂率達(dá)到最大值，蛋白質(zhì)損失率相對(duì)較小。

2.1.2 浸泡時(shí)間對(duì)脫脂率和蛋白質(zhì)損失率的影響

浸泡時(shí)間對(duì)鱘魚(yú)肌肉脫脂率和蛋白質(zhì)損失率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 浸泡時(shí)間對(duì)鱘魚(yú)肌肉脫脂率和蛋白質(zhì)損失率的影響Fig.2 Effects of soaking time on degreasing rate and protein loss rate of sturgeon muscle

通過(guò)圖2 可知，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，脫脂率有所提高，當(dāng)浸泡時(shí)間超過(guò)50 min 后脫脂率反而有一定下降，可能原因是隨著酶促反應(yīng)進(jìn)行，底物處于限速濃度，酶促反應(yīng)速率降低，這與徐海菊等[15]對(duì)大黃魚(yú)脫脂的研究結(jié)果一致。 隨著脫脂時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)不斷損失，造成魚(yú)肉肌肉組織結(jié)構(gòu)松散，對(duì)后續(xù)加工不利，因此當(dāng)浸泡時(shí)間為50 min 時(shí)能達(dá)到最大脫脂率，同時(shí)蛋白質(zhì)損失率相對(duì)較小。

2.1.3 pH 值對(duì)脫脂率和蛋白質(zhì)損失率的影響

pH 值對(duì)鱘魚(yú)肌肉脫脂率和蛋白質(zhì)損失率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 pH 值對(duì)鱘魚(yú)肌肉脫脂率和蛋白質(zhì)損失率的影響Fig.3 Effects of pH value on degreasing rate and protein loss rate of sturgeon muscle

pH 值影響酶分子的帶電性，從而影響酶活性[16]。通過(guò)圖3 可知，脫脂率起初隨著pH 值提高而增加，這是因?yàn)檫m宜的堿性條件有利于脂肪酸水解，生成的脂肪酸鈉鹽是一種良好的乳化劑， 有助于脫脂率的提高。當(dāng)酶反應(yīng)環(huán)境pH 值＞9 時(shí)脫脂率下降， 原因可能是酶在堿性過(guò)強(qiáng)的脫脂液環(huán)境下失活。 蛋白質(zhì)損失率隨著pH 值的增加逐漸升高， 尤其當(dāng)pH 值從10 增加到11時(shí)，蛋白質(zhì)損失率迅速增高，這可能與肌肉中可溶性蛋白的損失有關(guān)。綜上，當(dāng)脫脂液pH 9 時(shí)，能實(shí)現(xiàn)最好的脫脂效果。

2.2 酶法脫脂對(duì)鱘魚(yú)肌肉脂肪酸組成的影響

脫脂前后鱘魚(yú)肌肉脂肪酸組成見(jiàn)表1。

表1 脫脂前后鱘魚(yú)肌肉脂肪酸組成Table 1 Fatty acid composition of sturgeon muscle before and after degreasing

續(xù)表1 脫脂前后鱘魚(yú)肌肉脂肪酸組成Continue table 1 Fatty acid composition of sturgeon muscle before and after degreasing

脂肪酸的種類和比例是決定魚(yú)肉品質(zhì)的重要因素之一[17]。 脂肪酸中不飽和脂肪酸等成分提升了魚(yú)肉本身的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[18]，也構(gòu)成了魚(yú)肉特有的風(fēng)味[19]。 脫脂后鱘魚(yú)肌肉脂肪酸種類由24 種減少至22 種， 這是由于脫脂過(guò)程脂肪最終被水解為脂肪酸鹽。 脫脂前肌肉不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）、飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA） 的相對(duì)含量分別為71.05%、27.53%； 酶法處理后， 二者相對(duì)含量分別為75.68%、31.28%。 脫脂前后鱘魚(yú)肌肉脂肪酸組成變化較小，不飽和脂肪酸實(shí)現(xiàn)了較好的保留，與王旋等[20]的研究結(jié)果一致。 鱘魚(yú)肌肉多不飽和脂肪酸中二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）含量相對(duì)較高為2.32%、5.35%。脫脂后二者變化不大為2.10%、4.78%。綜上，采用酶法脫脂有效保留的不飽和脂肪酸能賦予魚(yú)肉適當(dāng)?shù)娘L(fēng)味，更好地保留魚(yú)肉的營(yíng)養(yǎng)成分。

2.3 酶法脫脂對(duì)鱘魚(yú)肌肉組織形態(tài)的影響

鱘魚(yú)肌肉脫脂前后的肌肉組織結(jié)構(gòu)圖如圖4 所示。

肌原纖維是肌肉的主要成分，溫度、pH 值、高壓、超聲等外源條件均會(huì)使肌原纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如膨脹、收縮、破裂[21]。 從圖4 可以觀察到脫脂后鱘魚(yú)肌肉纖維破裂現(xiàn)象增多，肌肉組織更加松散。 這是由于脂肪酶水解過(guò)程會(huì)導(dǎo)致部分肌原纖維蛋白變性，肌原纖維束收縮，最終引起肌肉組織破裂，這也可以用來(lái)解釋脫脂過(guò)程蛋白質(zhì)損失的現(xiàn)象。

圖4 鱘魚(yú)肌肉脫脂前后的肌肉組織結(jié)構(gòu)圖(20×)Fig.4 Photos(20×)of sturgeon muscle tissue before and after degreasing

2.4 酶法脫脂對(duì)鱘魚(yú)肌肉脂肪分布的影響

鱘魚(yú)肌肉組織脫脂前后的脂肪分布變化見(jiàn)圖5。

圖5 鱘魚(yú)肌肉組織脫脂前后的脂肪分布變化Fig.5 Sturgeon muscle tissue in fat distribution before and after degreasing

采用改良油性O(shè) 染色方法對(duì)組織切片進(jìn)行染色，可使脂肪染成深紅色。 從圖5 可以明顯觀察到脫脂前后鱘魚(yú)肌肉組織中深紅色區(qū)域顯著減少，說(shuō)明大量脂肪被脂肪酶水解，脂肪含量降低。 鱘魚(yú)肌肉組織在酶法脫脂處理后更為松散， 結(jié)果與圖4 肌肉組織形態(tài)切片結(jié)果一致。

2.5 酶法脫脂對(duì)鱘魚(yú)肌肉腥味物質(zhì)的影響

鱘魚(yú)肌肉脫脂前后揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鱘魚(yú)肌肉脫脂前后揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS 結(jié)果Table 2 Results for GC-MS identification of sturgeon muscle volatile flavor compounds before and after degreasing

水產(chǎn)品腥味形成的重要原因是風(fēng)味前體物質(zhì)氧化產(chǎn)生大量的揮發(fā)性化合物。鱘魚(yú)脫脂前共鑒定出13種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，酶法脫脂后主要檢測(cè)到11 種風(fēng)味物質(zhì)且峰面積顯著減小，說(shuō)明脫脂后鱘魚(yú)肉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量明顯降低。 醛類對(duì)魚(yú)肉風(fēng)味有很大影響，含量較高時(shí)往往會(huì)產(chǎn)生令人不愉快的氣味。表2中可見(jiàn)己醛在鱘魚(yú)樣品中含量很高，而魚(yú)體中魚(yú)腥味化合物的主要成分包括己醛。 張紅燕等[22]發(fā)現(xiàn)了金槍魚(yú)油中的腥味物質(zhì)包括1-辛烯-3-醇和4-壬醇等，脫脂前后鱘魚(yú)肉中均存在以上物質(zhì)且含量較多。 酮類物質(zhì)中2，3-辛二酮含量明顯減少。 酮類具有脂肪味，對(duì)腥味有增強(qiáng)作用。 總的來(lái)說(shuō)，酶法脫脂處理的鱘魚(yú)肌肉可在一定程度上將醛類、酮類等對(duì)腥味影響較大的化合物除去，脫脂的同時(shí)達(dá)到一定去腥的效果。

3 結(jié)論

經(jīng)篩選確定鱘魚(yú)肌肉酶法脫脂工藝條件為：酶濃度20 U/mL、pH 9、浸泡時(shí)間50 min，此時(shí)可控制得到適宜蛋白質(zhì)損失率并實(shí)現(xiàn)較好的脫脂效果。 酶法脫脂后的魚(yú)肉在脂肪酸組成、組織形態(tài)、脂肪分布、腥味物質(zhì)可達(dá)到較好效果。