陸雨芳，劉慶慶，朱成成，段蕭燕，趙高榮，平洪政，陳白潔，李剛鳳

（銅仁學院，貴州 銅仁 554300）

梵凈山茶以產(chǎn)于梵凈山主脈及周邊山峰支脈而得名，歷史悠久，梵凈山為唐朝時期八大茶區(qū)之一，擁有豐富茶葉資源，包含了綠茶、紅茶、白茶、黑茶、烏龍茶等系列[1]。 梵凈山茶的幼嫩芽葉、茶花、茶籽、茶根及茶梗中含有豐富的茶多酚、茶多糖、茶氨酸、兒茶素、黃酮、維生素C 等多種成分，具有降血糖、降血脂、抗氧化、延緩衰老、防治心血管疾病、防癌抗癌以及增強免疫力等功效， 能有效去除氧自由基和脂類自由基、預防脂質過氧化、增強抗氧化能力，是治療疾病和保護人體健康的天然抗氧化劑。 同時，隨著貴州加快發(fā)展特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)的戰(zhàn)略部署及梵凈山品牌的提升，越來越多的人認識并喜歡上梵凈山茶，在國家及政府大力支持下，貴州茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，茶園面積連續(xù)兩年居于全國茶園面積首位，在中國茶葉種植歷史上創(chuàng)造出了“貴州奇跡”[2]。

茶葉中富含生物活性成分，大量學者對此進行了研究。 An 等[3]研究了黃茶在黃化過程中對茶葉中生物活性物質的影響；Pedan 等[4]研究了普洱茶中的生物活性成分的含量，并且通過主成分分析和系統(tǒng)聚類分析表明，研究生物活性成分可以很好地區(qū)分普洱茶的種類；Chai 等[5]研究了藍莓葉茶在加工過程中抗氧化能力的變化，且進一步研究了酚類化合物、黃酮等物質對茶葉品質的影響；此外利用相關性分析來研究同等變量之間的相關性是一種經(jīng)典的方法。 Wang 等[6]研究了鐵觀音烏龍茶提取物中的化學成分及其抗氧化活性，并利用相關性分析來研究多酚、黃酮等化合物與總抗氧化能力、DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率之間的相關性。 Fatanah 等[7]研究表明尾葉茶的抗氧化性（總抗氧化能力和DPPH）與總黃酮含量（total flavonoid content，TFC）和總酚含量（total phenolic content，TPC）之間有很強的相關性。 李丹等[8]研究了茶葉提取物中的生物活性成分與抗氧化活性的相關性。 韓延超等[9]研究了茶湯在貯藏期間的抗氧化活性物質與抗氧化性之間相關性以及茶湯色度與抗氧化性之間的相關性。 但有研究指出經(jīng)典的相關性分析對于眾多變量的分析會使表達的結果不完整、不充分、可解釋性差，因此近年來普遍采用主成分分析和聚類分析的方法來彌補經(jīng)典方法存在的不足[10]。

在國家政府對貴州傳統(tǒng)文化及旅游產(chǎn)業(yè)的大力扶持下，梵凈山茶逐漸走出國門，但有關梵凈山茶的研究較少，因此，本文對5 種梵凈山茶的生物活性成分及抗氧化能力進行研究及相關性分析，并對生物活性成分含量進行了主成分和聚類分析，以期提升梵凈山系列茶品牌和質量鑒定水平，同時為梵凈山茶今后抗氧化活性的評價提供更加便捷快速的途徑，也為梵凈山的綜合開發(fā)和利用提供一定科學參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

藤茶：采購自梵凈山內(nèi)農(nóng)戶；苔茶、茗茶、小毛峰茶、金茯磚茶：貴州梵錦茶業(yè)有限公司。

沒食子酸（標準品）、蘆?。藴势罚荷虾＝鹚肷锟萍加邢薰荆黄咸烟?、無水乙醇（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；硫酸、苯酚（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；福林酚（生物試劑）：南京奧多福尼生物科技有限公司； 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）：北京索萊寶科技有限以司；2，6-二氯靛酚（≥97.0%）：南京森貝伽生物科技有限公司；抗壞血酸（≥99.7%）：國藥集團化學試劑有限公司；二苯基苦味?；诫拢―PPH）：美國Sigma 公司；鄰二氮菲（分析純）：廣東汕頭市西隴化工廠。

1.1.2 儀器與設備

721 型可見分光光度計： 上海舜守恒平科學儀器有限公司；DHG-907OA 電熱鼓風干燥箱：常州普天儀器制造有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋： 常州直播儀器有限公司；XH-C 旋渦混合器：金壇市城東新瑞儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

5 種梵凈山茶經(jīng)40 ℃干燥箱熱風干燥2 h， 取出冷卻至室溫（25 ℃），組織破碎，過80 目篩，樣品密封儲藏待用。

1.2.2 生物活性成分含量及抗氧化能力的測定

1.2.2.1 梵凈山茶中茶多酚含量的測定

精確稱取5 種梵凈山茶粉末各2.5g， 按1∶20（g/mL）加入蒸餾水，85 ℃浸提10 min，殘渣重復浸泡，兩次濾液混合于100 mL 容量瓶，加蒸餾水定容，制得5 種梵凈山茶原提取液，移取各茶原提取液1 mL 于10 mL 容量瓶，加水定容，用于各項指標的測定。

梵凈山茶中茶多酚物質采用福林酚法[11-12]測定，在OD760nm測吸光值， 標準曲線方程：Y= 0.117 7X-0.001 6，R2=0.999 7。 分別移取5 種梵凈山茶原提取液1 mL，測定梵凈山茶中茶多酚含量。

1.2.2.2 梵凈山茶總黃酮含量的測定

梵凈山茶中的總黃酮物質采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法[13-14]測定，在OD510nm測吸光值，標準曲線方程：Y=0.223 9X+0.002 7，R2=0.999 4。 分別移取1.2.2.1中5 種梵凈山茶原提取液1 mL，測定梵凈山茶中總黃酮含量。

1.2.2.3 梵凈山茶總游離氨基酸含量的測定

梵凈山茶中的總游離氨基酸含量采用茚三酮法測定[15-16]，分別精確移取濃度10 mg/mL 茶氨酸標準溶液0、1.0、1.5、 2.0、2.5、3.0 mL 置于50 mL 容量瓶，得0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 濃度茶氨酸標準溶液，分別移取1 mL 于25 mL 具塞試管，依次加入pH8.0 磷酸鹽緩沖液0.5 mL，再各加入2%茚三酮溶液0.5 mL，恒溫沸水浴15 min，取出冰水冷卻至室溫（25 ℃），加水定容， 在OD570nm測吸光值， 繪得標準曲線方程：Y=1.516 3X-0.007 9，R2=0.999 3。分別移取1.2.1.1 中5 種梵凈山茶原提取液1 mL， 以制作標準曲線的方法，每組三水平，測定梵凈山茶中總游離氨基酸含量。

1.2.2.4 梵凈山茶中茶多糖含量的測定

梵凈山茶中茶多糖物質采用苯酚-硫酸法進行測定[17]，以濃度1 mg/mL 葡萄糖標準溶液制得濃度為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 葡萄糖標準溶液，再分別移取上述1 mL 于25 mL 具塞試管， 加入濃度為5%的苯酚溶液1 mL，緩慢加入濃硫酸5 mL，冷卻，旋渦均勻混合5 s，靜置5 min，恒溫沸水浴15 min，置于冰水中冷卻至室溫（25 ℃），在OD490nm測吸光值，繪得標準曲線方程：Y=10.087X+0.0131，R2=0.999 5。 分別稱取5 種梵凈山茶粉末5 g，90%乙醇40 mL，60 ℃水浴1 h， 殘渣90%乙醇洗滌2～3 次， 濾液混合定容至100 mL，分別移取1 mL，以制作標曲方法，每組三水平，測定梵凈山茶中茶多糖含量。

1.2.2.5 梵凈山茶維生素C 含量的測定

梵凈山茶維生素C 物質采用GB 5009.86—2016《食品安全國家標準食品中抗壞血酸的測定》中第三法進行測定[18]，分別稱取5 種梵凈山茶粉末1 g，2%草酸溶解，定容至100 mL；移取2%草酸10 mL，加1 mg/mL 抗壞血酸標準液1 mL，2，6-二氯靛酚溶液滴定；分別移取5 種梵凈山茶原提取液1 mL 替換抗壞血酸進行滴定，直至溶液產(chǎn)生微紅色，15 s 不褪色，空白以蒸餾水為參照，記錄數(shù)據(jù)。

式中：T 為每毫升2，6-二氯靛酚溶液滴定度，mg/mL；C 為抗壞血酸濃度，mg/mL；V 為移取抗壞血酸標準液體積，mL；V1為滴定抗壞血酸溶液所用2，6-二氯靛酚溶液的體積，mL；V2為滴定空白所用2，6-二氯靛酚溶液的體積，mL。

式中：V1為滴定樣液所用2，6-二氯靛酚溶液的體積，mL；V0為滴定空白所用2，6-二氯靛酚溶液的體積，mL；T 為每毫升2，6-二氯靛酚溶液滴定度，mg/mL；A 為稀釋倍數(shù)；W 為樣品質量，g。

1.2.3 DPPH 自由基清除率的測定

DPPH 自由基清除率的測定參考陳亮等[19]方法并稍作修改，分別移取5 種梵凈山茶10 倍稀釋液2 mL，于25 mL 棕色容量瓶，加0.2 mmol/L DPPH 溶液2 mL，室溫（25 ℃）避光反應30 min，在OD517nm測吸光值。

DPPH 自由基清除率/%=1-（Ai-Aj）/A0×100

式中：Ai為DPPH 溶液混合后在517 nm 波長處測定的吸光值；Aj為2 mL 無水乙醇+2 mL 稀釋液在517 nm 波長處測定的吸光值；A0為2 mL 無水乙醇加2 mL DPPH 溶液在517 nm 波長處測定的吸光值。

1.2.4 清除羥自由基清除率的測定

羥自由基清除率的測定參照黃采姣等ABTS 法[20]并稍作修改， 移取6.3 mmol/L 濃度的鄰二氮菲溶液1 mL 于比色管， 移取2 mL 濃度為0.01 mmol/L pH7.4 PBS，精確加入1 mL 無水乙醇，漩渦混合10 s，1 mL 濃度0.75 mmol/L FeSO4溶液， 搖勻， 加1 mL 濃度0.03%H2O2溶液，37 ℃恒溫水浴1 h，在OD510nm測吸光值。

式中：A損為混合后溶液在510 nm 波長處測定的吸光值；A樣為5 種梵凈山茶原提取液代替無水乙醇在510 nm 波長處測定的吸光值；A未損為蒸餾水代替0.03%過氧化氫溶液在510 nm 波長處測定的吸光值。

1.2.5 總抗氧化能力的測定

梵凈山茶的總抗氧化能力采用鐵離子還原法（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定[21]，分別移取5 種梵凈山茶100 倍稀釋液1 mL，于25 mL 具塞試管，加2 mL FRAP 工作液，37 ℃水浴30 min，取出冷卻，OD593nm測吸光值；以1 mmol/L FeSO4溶液為標準溶液， 繪得標準曲線方程：Y=0.000 5X-0.000 1，R2=0.999 3，鐵離子還原值越大，其抗氧化能力越強。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 和Excel 2016 進行數(shù)據(jù)處理并完成顯著水平分析、相關性分析、聚類分析和主成分分析。

2 結果分析

2.1 5 種梵凈山茶生物活性成分含量比較分析

梵凈山茶的生物活性成分含量測定結果見表1。

由表1 可知，5 種梵凈山茶的茶多酚含量為0.64 g/100 g～1.53 g/100 g，茶多酚具有良好的抗氧化和清除自由基的能力[22]；茶多糖含量為27.56 g/100 g～65.31 g/100 g，人體攝取茶多糖有利于血糖、血脂的降低，并且具有抗氧化的作用[23]；游離氨基酸是茶葉中重要的品質成分之一，所含總量的高低直接影響茶葉的鮮爽度[24]，5 種梵凈山茶總游離氨基酸含量在0.13 g/100 g～1.95 g/100 g；總黃酮含量在4.41 g/100 g～25.83 g/100 g，維生素C 含量在0.70 mg/100 g～17.03 mg/100 g。5 種生物活性成分在p＜0.05 水平都具有顯著性差異， 其中小毛峰茶水溶性的提取物多數(shù)高于其余4 種梵凈山茶，茶多酚、茶多糖、總黃酮以及維生素C 的含量均值高達（1.53±0.01）、（65.31±0.05）、（25.83±0.12）g/100 g 和（17.03±0.40） mg/100 g。 藤茶的總游離氨基酸含量最低（0.13±0.00）g/100 g，金茯磚茶的總游離氨基酸含量最高（1.95±0.00）g/100 g，是藤茶的15 倍。

表1 梵凈山茶的生物活性成分含量測定結果Table 1 Determination of bioactive components in Fanjing Mountain tea

2.2 5 種梵凈山茶抗氧化能力分析比較

羥自由基是對人體威脅最大的一類自由基。 抗氧化能力測定結果見表2。

表2 抗氧化能力測定結果Table 2 Determination of antioxidant activity

由表2 可知，5 種梵凈山茶對DPPH 自由基清除率有效區(qū)域范圍72.42%～87.16%， 羥自由基清除率有效區(qū)域范圍170.91%～214.29%，總抗氧化能力為450.87 μmol/L～1 530.87 μmol/L，5 種梵凈山茶均具有較強清除自由基的功效。

根據(jù)表2 可知，DPPH 自由基清除能力由強至弱依次為金茯磚茶＞小毛峰＞茗茶＞苔茶＞藤茶，其中金茯磚茶對DPPH 自由基的清除能力最強，清除率均值達到（87.16±0.02）%， 藤茶對DPPH 自由基的清除能力最弱， 但對羥自由基清除能力最強， 清除率均值高達（214.29±0.31）%。 羅冬蘭等[25]研究了貴州5 種綠茶的抗氧化活性， 其中苔茶對DPPH 自由基清除能力比其余4 種綠茶弱。本試驗對梵凈山5 種茶進行研究，結果表明苔茶對DPPH 自由基清除能力比藤茶強， 比金茯磚茶、小毛峰、茗茶弱。 5 種梵凈山茶對羥自由基清除能力由強至弱依次為藤茶＞苔茶＞金茯磚茶＞小毛峰＞茗茶。 歐賢紅等[26]研究藤茶的抗氧化活性，其結果表明，梵凈山藤茶中主要的抗氧化活性物質為黃酮類物質楊梅素和二氫楊梅素。 總抗氧化能力由強至弱的順序為小毛峰＞藤茶＞茗茶＞金茯磚茶＞苔茶，其中效果最為明顯的小毛峰茶Fe3+還原力為（1 530.87±2.31）μmol/L。 馬慧等[27]利用鐵離子還原力測定4 種梵凈山茶的抗氧化活性，最終得出結論綠茶的抗氧化活性是最好的。 小毛峰也屬于綠茶的一種，因此本試驗研究結果與其結果一致。通過顯著性分析表明，5 種梵凈山茶的抗氧化能力在0.05 水平存在顯著差異。

2.3 5 種梵凈山茶的生物活性成分與抗氧化能力相關性

對梵凈山茶中的生物活性成分與DPPH 自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力進行相關性分析，見表3。

表3 梵凈山茶的生物活性成分與抗氧化能力的相關性分析Table 3 Correlation analysis of the bio-active components and antioxidant capacity of Fanjing Mountain tea

結果表明，DPPH 自由基清除率與維生素C 含量（r=0.573）呈顯著正相關；羥自由基清除率與總黃酮含量（r=-0.542）、茶多糖含量（r=-0.515）呈顯著負相關，與維生素C 含量（r=-0.643）呈極顯著負相關；FRAP 法測定的總抗氧化能力與總黃酮含量（r=0.915）、茶多酚含量（r=0.936）、茶多糖含量（r=0.758）、維生素C 含量（r=0.754）呈極顯著正相關。 而總黃酮含量、茶多酚含量、茶多糖含量、總游離氨基酸含量與DPPH 自由基清除率無相關性；茶多酚含量、總游離氨基酸含量與羥自由基清除率無相關性；總游離氨基酸含量與總抗氧化能力無相關性。

此外，相關性分析結果表明，茶多酚與FRAP 法測定總抗氧化能力有極顯著相關性，這與金亮等[28]的研究結果相符， 該研究表明FRAP 法適于茶葉抗氧化能力的評價； 維生素C 作為以上3 種方法的清除劑，對5 種梵凈山茶進行抗氧化測定時， 與DPPH 自由基清除率有顯著正相關，與羥自由基清除率有極顯著負相關，與總抗氧化能力有極顯著正相關。另外，DPPH 法、羥自由基清除法、FRAP 法均適合茶葉的抗氧化活性測定，并起到互補作用，與韓延超等[29]研究報道相符；DPPH 自由基清除率與總黃酮含量沒有顯著相關性，與李紅梅等[30]研究的苦蕎茶結果不同，這可能是由于不同種茶類所含有的黃酮成分不一樣， 造成對DPPH自由基清除率不同。

2.4 5 種梵凈山茶的生物活性成分的主成分分析

將5 種梵凈山茶的生物活性成分的含量測定值經(jīng)標準化后進行主成分分析， 可以得到5 個變量的相關系數(shù)和主成分分析的結果。 對數(shù)據(jù)進行適應性檢驗，相關系數(shù)矩陣的直觀檢驗[31]。 生物活性成分的相關矩陣見表4。

表4 生物活性成分的相關矩陣Table 4 Correlation matrix of bio-active components

由表4 可知，總黃酮、維生素C、茶多酚、茶多糖兩兩之間呈極顯著正相關，總游離氨基酸與其余4 種指標呈極顯著負相關（p<0.01），整體表明各生物活性成分相關性較強，可采用主成分分析對生物活性成分進一步的分析。

主成分分析法是使冗余復雜的信息簡單化的分析方法[32]。 采用該法得各主成分的特征值、方差貢獻率、 累計方差貢獻率。 特征值一般選取大于1 的主成分作為代表[33]。 生物活性成分主成分分析結果見表5。

表5 生物活性成分主成分分析結果Table 5 Results of principal component analysis of bio-active components

由表5 可知，總黃酮特征值是4.854，相當于4.854倍的原始變量的信息量，貢獻率高達97.07%，即保留了原始指標97.07%的信息，具有代表性。因此，最終提取總黃酮為主成分進行評價即可，它代表了不同梵凈山茶的生物活性的97.07%的信息量。

2.5 5 種梵凈山茶及其各生物活性成分的聚類分析

本研究以5 種梵凈山茶和生物活性成分為變量，采用SPSS 作聚類分析， 選用Nearest neighbor 法，對5 種梵凈山茶樣品的聚類采用Q 型聚類， 對其各項指標的聚類采用R 型聚類。得聚類分析的結果見圖1。對5 種梵凈山茶各生物活性成分聚類分析見圖2。

圖1 5 種梵凈山茶的聚類分析樹狀圖Fig.1 Tree diagram of cluster analysis of five kinds of Fanjing Mountain Tea

圖2 生物活性成分的聚類分析樹狀圖Fig.2 Cluster analysis tree of bio-active components

當5 種梵凈山茶分為2 類時，藤茶、金茯磚茶、苔茶聚為一類，茗茶、小毛峰茶為一類；當分為3 類時，藤茶、金茯磚茶聚為一類，茗茶、小毛峰茶為一類，苔茶聚為一類；當分為4 類時，藤茶、金茯磚茶聚為一類，茗茶、小毛峰、苔茶各自為一類。從3 種分類標準中可知，藤茶和金茯磚茶都可聚為一類，可見兩者的相似度極高，當分為2 類和3 類時，茗茶、小毛峰茶可聚為一類，說明兩者也具有較大的相似度，苔茶明顯區(qū)分于其余4 種梵凈山茶。

由圖2 可知，當分為2 類時，茶多酚、茶多糖、總黃酮、維生素C 一類，總游離氨基酸為一類；當分為3 類時，多酚、茶多糖、維生素C 一類，總黃酮為一類，總游離氨基酸為一類。 這種聚類結果可能與梵凈山茶的生產(chǎn)、加工方式和茶葉的生長環(huán)境、土壤的相互作用有關。

3 結論

本試驗對藤茶、茗茶、苔茶、小毛峰、金茯磚茶5 種梵凈山茶進行研究，試驗結果表明，5 種梵凈山茶在總黃酮、茶多酚、茶多糖、總游離氨基酸、維生素C 等指標含量方面存在顯著性差異（p<0.05），在DPPH 自由基清除率、羥自由基清除率和總抗氧化能力存在顯著性差異（p<0.05）。 同時運用相關性分析對各生物活性成分之間的相關性以及生物活性成分與抗氧化能力之間的相關性進行了探究， 得到DPPH 自由基清除率與維生素C 含量呈顯著正相關，羥自由基清除率與總黃酮含量、茶多糖含量呈顯著負相關，總游離氨基酸含量與總黃酮、茶多酚、茶多糖、維生素C 呈極顯著相關，而與總抗氧化能力無相關性，這可能與茶葉加工過程時微生物的污染、加工方式使總游離氨基酸發(fā)生復雜化學變化所致。 其中小毛峰茶的總黃酮含量、茶多糖含量、茶多酚含量和維生素C 含量是最高的，這4 種生物活性成分與總抗氧化能力是極顯著相關，表明小毛峰茶具有強抗氧化能力。 通過主成分分析可以得到總黃酮為主成分，它可以反映梵凈山茶中生物活性成分97.07%的信息，而后對5 種梵凈山茶進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)不管如何分類，藤茶和金茯磚茶都是聚為一類，說明兩者具有較大的相似度。

本試驗采用多元統(tǒng)計分析結果旨在為廣大消費者的購茶、飲茶選擇提供一定的科學依據(jù)，為梵凈山茶今后抗氧化活性的評價提供更加便捷快速的途徑。同時， 更有代表性說明梵凈山茶總抗氧化能力較高，為提高梵凈山茶的廣泛開發(fā)和綜合利用，提供了一定的參考理論依據(jù)。