司舒杰，魏穎軒

（1 內(nèi)蒙古第四醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特；2 內(nèi)蒙古包頭市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古 包頭）

0 引言

《中國(guó)藥典》2015 版一部載有黃芪藥材及飲片，其在臨床應(yīng)用廣泛，同時(shí)也作為保健食品深受市場(chǎng)歡迎。因此，黃芪的質(zhì)量控制顯得尤為重要。在本次對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，按照乙腈-0.2%甲酸（20：80）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，檢測(cè)時(shí)間可以縮短至30min甚至更短，并且避免了藥典方法中由于梯度洗脫造成的明顯雜峰和基線不穩(wěn)定的情況，根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)，對(duì)36 批樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定，并與藥典方法的含量結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20A 高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器）。Thermo Ultiamate3000 高效液相色譜儀。萬分之一天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司,AL204-IC]。十萬分之一天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司,BP-211D]。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品批號(hào)：111920-201606，純度：97.6%（來源：中國(guó)食品藥品檢定研究院）；樣品以黃芪飲片為主，共34 批次（占94.44%）；黃芪藥材2 批次（占5.56%）。標(biāo)示生產(chǎn)企業(yè)27 家，覆蓋9 個(gè)省市自治區(qū)，其中河北省10 家，內(nèi)蒙古自治區(qū)6 家，安徽省3 家，北京市和甘肅省各2 家，陜西省、四川省、廣東省和黑龍江省各1 家；乙腈、甲醇為色譜純，甲酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

藥典方法：色譜柱為Welch Ultimate XB-C18（5μm，4.6mm×250mm）；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.2%甲酸溶液為流動(dòng)相B，按表1 中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速 1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng) 260nm；柱溫 30℃；進(jìn)樣量10μl。見表1。

表1 洗脫條件

新方法：色譜柱為Welch Ultimate XB-C18（5μm，4.6mm×250mm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2% 甲酸溶液（20：80），流速1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μl。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液的制備：稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品13.34mg，精密稱定，置25ml 量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，再取1ml，置10ml 量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，制成每1ml含52.08μg 的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：兩種方法均按《中國(guó)藥典》2015年版一部黃芪項(xiàng)下毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定的方法制備供試品溶液[1]。

2.3 兩種方法測(cè)定結(jié)果比較

2.3.1 圖譜的比較

分析圖譜結(jié)果得出藥典方法進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，在35min 之后有明顯的雜峰和基線不平穩(wěn)的現(xiàn)象，在基線、空白、標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照品的譜圖中均出現(xiàn)，說明并非樣品的雜峰，而是梯度洗脫造成的影響，而在改進(jìn)條件下可見，基線平穩(wěn)，且可將采集時(shí)間減少至30min 甚至更短；并且在樣品色譜圖中可見主峰附近雜峰也較多，雜峰與主峰間分離度有時(shí)達(dá)不到要求，而在改進(jìn)條件下可見基線較平穩(wěn)，主峰周圍雜峰也較少。

2.3.2 含量測(cè)定結(jié)果的比較

兩種方法的含量測(cè)定結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，8 組數(shù)據(jù)藥典方法的含量高于新方法的含量，占總樣品量的22.2%，28組數(shù)據(jù)新方法的含量高于藥典方法含量，占總樣品量的77.8%。結(jié)果見表2。

表2 兩種方法測(cè)得的樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量

3 新方法的方法學(xué)考察

3.1 純度試驗(yàn)

將毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品及供試品溶液在DAD檢測(cè)器下做全波長(zhǎng)掃描，測(cè)得樣品峰與對(duì)照品峰的吸收光譜形狀一致，峰純度符合要求，說明其為同一物質(zhì)。

3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，室溫下分別于放置0h、2h、4h、8h、12h、24h 進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷在24h之內(nèi)峰面積積分值基本穩(wěn)定不變。RSD 為0.2%（n=6），表明室溫下供試品溶液放置24h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.3 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液10μl，按新方法色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積。結(jié)果RSD 為0.6%（n=6），表明儀器精密度良好。

3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取配制好的對(duì)照品溶液2μl、4μl、8μl、10μl、16μl、20μl 分別進(jìn)樣。以峰面積A 為縱坐標(biāo)、以毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)樣量在0.10416-1.0416μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；貧w方程為Y=2903675X+63116，R2=1。

3.5 加樣回收試驗(yàn)

精密稱定6 份已知含量的黃芪藥粉約1g，置圓底燒瓶中，精密加入500μg 的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品，精密加入甲醇50ml，按照供試品溶液制備方法操作，并測(cè)定含量，計(jì)算回收率。平均回收率為97.0%，RSD0.7%。

4 討論

在對(duì)黃芪藥材及飲片的含量測(cè)定時(shí)，其項(xiàng)下的毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測(cè)定過程中發(fā)現(xiàn)主峰與周圍雜峰分離效果差，達(dá)不到藥典要求的分離度，在查閱了大量有關(guān)毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定的文獻(xiàn)方法[2-8]后，通過總結(jié)發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)多采用梯度洗脫的方法進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)過驗(yàn)證梯度洗脫方法對(duì)于黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷分離效果欠佳，并且雜峰較多，基線不穩(wěn)。因此，本試驗(yàn)嘗試優(yōu)化HPLC色譜條件并建立HPLC 測(cè)定黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的方法。

本試驗(yàn)以藥典中“黃芪”項(xiàng)下毛蕊異黃酮葡萄糖苷的色譜條件為基礎(chǔ)，優(yōu)化HPLC 色譜條件。檢測(cè)時(shí)間可以縮短至30min，并且避免了藥典方法中由于梯度洗脫造成的明顯雜峰和基線不穩(wěn)定的情況，根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)，對(duì)36 批樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定，并與藥典方法的含量結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。新方法所測(cè)的結(jié)果普遍比藥典方法高，并且36 批樣品的平均值也高于藥典方法。

因此，筆者對(duì)建立的方法，以精密度、重復(fù)性、回收率等為考察指標(biāo)，進(jìn)行了方法學(xué)的考察，發(fā)現(xiàn)該含量測(cè)定方法可靠、重現(xiàn)性好，且具有一定的適用性。