徐 若，張秀芬，李艷冰，字淑慧,，楊生超，劉 濤

（1云南農(nóng)業(yè)大學/西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心，昆明 650201；2云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院，昆明 650201）

0 引言

三七(Panax notoginseng)為五加科(Araliaceae)人參屬(Panax)植物。三七可整株入藥，除可活血化瘀、清腫止痛、滋補強壯、補血造血外，還具有抗疲勞、抗衰老、抗炎、抗腫瘤、降血壓、降血脂、降血糖等多方面的藥理作用，在藥品和天然保健品方面有著重要開發(fā)價值[1]。三七在廣西、貴州、四川、云南種植較多，是重要名貴藥用植物[2]，在臨床上具有較高的利用價值[3]。

干旱脅迫是限制作物生產(chǎn)和大幅度降低產(chǎn)量的最重要的非生物脅迫[4]。21世紀以來，中國每年都會發(fā)生干旱。云南地區(qū)是國內(nèi)干旱較頻繁發(fā)生的地區(qū)之一，有“十年九旱”之說，干旱脅迫所導致的作物減產(chǎn)超過其他環(huán)境脅迫所造成減產(chǎn)的總和。干旱嚴重影響植物的生長，威脅植物的生存[5]，降低植物光合速率以及葉綠體對光能的吸收能力和轉(zhuǎn)能效率。然而植物面對干旱的環(huán)境，不是完全被動的[6]，在長期的適應(yīng)和馴化過程中，當受到生物和非生物脅迫的嚴重影響時，植物已經(jīng)進化出一些有效的機制應(yīng)對環(huán)境挑戰(zhàn)，對干旱脅迫也產(chǎn)生了不同的生理生化策略[7]。在干旱脅迫條件下，各種小分子如脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等在滲透調(diào)節(jié)中起重要作用，迅速積累起來[8]。此外，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶以及MDA含量也被迅速誘導，以應(yīng)對干旱脅迫期間的氧化損傷，這些分子的含量和這些酶的活性被廣泛地用作評價植物在遭受干旱時的特性的參數(shù)[9]。與根莖相比，植物葉片對環(huán)境變化更為敏感，當空氣的蒸汽壓和相對濕度等發(fā)生變化時，植物會迅速關(guān)閉氣孔，減少水分損失，同時保持較高的水分利用效率。趙宏光[10]通過對三七葉片的研究，發(fā)現(xiàn)三七葉片能夠通過保護酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來適應(yīng)土壤水分含量的變化。但是，三七葉片酶活性和調(diào)節(jié)物質(zhì)對干旱的響應(yīng)程度如何目前尚未見報道。

植物在生長過程中不可避免地經(jīng)歷各種非生物脅迫。為適應(yīng)環(huán)境的變化，植物會調(diào)節(jié)一些基因的表達，產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)[11]，同時在生理和生化水平上發(fā)生顯著變化。干旱是最常見的非生物脅迫之一，植物在干旱的環(huán)境下，不僅在生理水平產(chǎn)生對環(huán)境的抵抗，在生化水平也會發(fā)生相應(yīng)的變化。三七受到干旱脅迫是多基因控制的數(shù)量性狀，與植株外部的形態(tài)建成、滲透調(diào)節(jié)能力、抗氧化能力等存在密切關(guān)系。然而，在三七干旱脅迫下，這些分子化合物、酶活性的動態(tài)變化以及生化水平的響應(yīng)很大程度上尚不清楚。

筆者從生理水平的響應(yīng)和生化水平對三七的抗旱性機制進行研究，系統(tǒng)分析三七的抗旱響應(yīng)機制，以期為進一步深入研究三七干旱脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗苗均選用來自同一地方、苗齡為1年生、長勢基本一致的健康三七苗。供試材料由三七道地產(chǎn)區(qū)云南省文山州硯山縣種植基地（東經(jīng)103°35'—104°45'、北緯23°18'—23°59'之間，海拔1539 m）提供。

1.2 實驗設(shè)計

2017年7月中旬，從云南省文山州硯山縣三七種植基地采挖一年生三七苗。當天及時將采挖好的三七苗采用盆栽的方式移栽于云南農(nóng)業(yè)大學后山大棚（東經(jīng)105°45、北緯25°7，海拔1960 m）。盆栽種植時，每個花盆(26 cm×21 cm)裝有機土與黃壤土比例2:1的混勻土2 kg，每盆10株三七。8月5日挑選出生長情況一致的盆栽三七苗進行正式實驗處理。實驗分為2組處理；自然干旱處理6盆，3個重復，每個重復2盆；對照處理6盆，3個重復，每個重復2盆。實驗觀測前統(tǒng)一灌溉2組處理的實驗苗，并計算最大含水量作為100%的土壤相對含水量(RWC)。干旱處理組不再澆水，直至自然干旱；對照組每天檢測土壤RWC，根據(jù)RWC值適當補水，保證土壤相對含水量(RWC)維持在同一水平，約2天澆一次水，每次每盆澆100～200 mL。培養(yǎng)45天后，自然干旱處理組已經(jīng)出現(xiàn)80%萎焉程度。每個處理取一片葉，蒸餾水沖洗表面雜質(zhì)，去除葉脈，弱光條件研磨，檢測葉綠素含量。取0.1 g葉片，冰浴研磨，檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量。取0.1 g三七葉片，根據(jù)TRN20l-A+總RNA提取說明書方法提取RNA。

1.3 實驗方法

1.3.1 生理指標測定 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用WST-1法，過氧化物酶(POD)活性測定采用比色法，過氧化氫酶(CAT)活性測定采用可見光法，丙二醛(MDA)含量測定采用TBA法，葉綠素含量的測定方法借鑒Arnon法[12]，試劑盒均購買自南京建成生物科技有限公司，TRN20l-A+總RNA提取試劑盒購買自天根生化科技有限公司。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序、組裝以及基因注釋 分別將干旱處理樣品和對照樣品各自分別混合，并保證混合后樣品質(zhì)量相等，由北京百邁克生物科技有限公司構(gòu)建文庫，文庫質(zhì)量檢測合格后，安排上機測序，使用IIIumina Hiseq高通量測序平臺對cDNA進行測序。在進行后續(xù)分析之前，首先需要確保所用Reads有足夠高的質(zhì)量，以保證序列組裝和后續(xù)分析的準確。由測序儀造成的錯誤率小于0.1%的堿基所占比例(Q30)來衡量測序的質(zhì)量對Raw Data進行數(shù)據(jù)過濾[13]，去除其中的接頭序列及低質(zhì)量Reads獲得高質(zhì)量的Clean Data。使用BLAST軟件將 Unigene序列與Nr、Swiss-Prot、GO(gene ontology)、COG(cluster of orthologous groups)、KOG、eggNOG、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)和Pfam數(shù)據(jù)庫比對，臨界值為E＜10-5進行功能注釋分析。

1.3.3 差異基因篩選及富集分析 使用EBSeq進行差異表達分析，獲得干旱處理組和對照組之間的差異表達基因集。使用RPKM法(reads perkb per million reads)計算Unigene表達量，統(tǒng)計干旱和對照的基因表達豐度，在篩選過程中，將FDR＜0.01且差異倍數(shù)FC≥2作為篩選標準（FDR值越低表明基因表達差異越顯著）篩選出|log2 Ratio|≥1和 q＜0.05的基因作為 DEGs。對DEGs做GO功能分析和KEGG途徑分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對三七葉片葉綠素、可溶性蛋白含量的影響

植物葉綠素含量的高低影響著植物光合作用的速率和光合產(chǎn)物的形成，是反映植物光合能力的重要指標之一。通常認為水分脅迫會降低葉綠素含量。如圖1所示，干旱脅迫下，三七葉綠素含量發(fā)生變化。SPSS方差分析表明，處理組和對照組的葉綠素含量差異均達顯著水平(P＜0.05)。與對照相比，處理組葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a/b、總?cè)~綠素以及類胡蘿卜素顯著高于對照，葉綠素a/b比對照高出2.97%，總?cè)~綠素含量約高出對照39.8%。

圖1 不同處理的三七葉片葉綠素含量

2.2 干旱脅迫對三七葉片可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，它們的增加和積累能提高細胞的保水能力，對細胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護作用，因此經(jīng)常用作抗性篩選指標。在此次研究中，處理組可溶性蛋白略高于對照組，處理組可溶性蛋白含量高于對照組約3.7%（圖2）。

圖2 不同處理的三七葉片可溶性蛋白含量

2.3 干旱脅迫下三七葉片POD和SOD的變化情況

當植物遭受干旱脅迫時，POD和SOD會發(fā)生變化，以維持體內(nèi)活性氧代謝的動態(tài)平衡。圖3方差分析結(jié)果顯示，2組處理間POD活性和SOD活性差異均達顯著水平(P＜0.05)。處理組三七葉片的POD活性和SOD活性分別高于對照79.19%，9.05%。受干旱影響敏感度POD活性大于SOD活性。

圖3 不同處理的三七葉片POD活性和SOD活性

2.4 干旱脅迫下三七葉片CAT活性的變化情況

CAT是催化過氧化氫分解成氧和水的酶，存在于細胞的過氧化物體內(nèi)，能將逆境脅迫下細胞內(nèi)產(chǎn)生的H2O2分解，維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。圖4表明，CAT活性與植物的抗逆性有關(guān)。在本次研究中，CAT活性在干旱脅迫和對照中的活性都較低，但是相較于對照，處理組的CAT活性有所升高。

圖4 不同處理的三七葉片CAT活性

2.5 干旱脅迫下三七葉片MDA含量的變化情況

由圖5可知，與對照相比，MDA含量升高了88.41%。SPSS方差分析結(jié)果表明，干旱處理和對照MDA含量差異達顯著水平(P＜0.05)。

圖5 不同處理的三七葉片MDA活性

2.6 轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量檢測和注釋數(shù)據(jù)

完成2個樣品的轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得15.50 GB Clean Data、51883034個Clean reads，各樣品Q30堿基百分比均不小于93.97%。使用Trinity軟件組裝共得到68134條Unigene，其中長度在1 kb以上的Unigene有13544條。Unigene的N50為1180，組裝完整性較高。對Unigene進行功能注釋，包括與Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫的比對，共獲得33151條Unigene(51.34%)的注釋結(jié)果（表1）。由表可知，在所有注釋的序列中，分別有32666(98.54%)、30306(91.42%)、19951(60.18%)、19380(58.46%)、19183(57.87%)、18414(55.55%)、11905(35.91%)、10005(30.18%)個序列在 Nr、eggNOG、Pfam、GO、Swiss-Prot、KOG、KEGG、COG數(shù)據(jù)庫中比對成功。

表1 三七葉片轉(zhuǎn)錄組Unigene注釋

2.7 COG功能分類

COG分類結(jié)果（圖6）表明，有10005條轉(zhuǎn)錄本被注釋到該數(shù)據(jù)庫中，包含了21個功能類別。涵蓋基因最多的是一般功能預測(24.93%)，其次是復制、重組和修復(12.55%)，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合生(11.93%)，轉(zhuǎn)錄(10.98%)，信號轉(zhuǎn)導機制(9.00%)，氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝(8.02%)等。所有類別中，核酸結(jié)構(gòu)(0.08%)的數(shù)量最少。

圖6 葉片轉(zhuǎn)錄組Unigene序列COG功能注釋分類

2.8 差異基因的GO分類和富集分析

在GO數(shù)據(jù)庫中有19380個基因注釋到36個GO條目中，分為分子功能(molecular function)、細胞組分(cellular component)和生物學過程(biological process)3類（圖7）。在細胞組分類型中，細胞(cell)和細胞組分(cell part)最顯著富集，注釋的Unigene數(shù)均為8636，占總注釋基因數(shù)的44.56%；催化活性(catalytic activity)和組合(binding)在分子功能類型中最為富集，注釋的Unigene數(shù)分別為10510、9898，分別占總注釋基因數(shù)的54.23%、51.07%；在生物學過程類型中，顯著富集的是代謝過程(metabolic process)和細胞過程(cellular process)，注釋的unigene數(shù)分別為13689、11696，分別占總注釋基因數(shù)的70.63%、60.35%。催化活性、代謝過程與干旱脅迫密切相關(guān)。以FDR≤0.01和|log2 fold change|≥2來評估樣本間的差異基因，定義為DEGs，共篩選出582個DEGs。與CK相比，干旱處理樣本上調(diào)基因431個、下調(diào)基因151個。對DEGs做GO注釋和功能富集性分析，有213個DEGs（160個上調(diào)、53個下調(diào)）注釋到該數(shù)據(jù)庫中。

圖7 干旱脅迫差異基因GO功能注釋結(jié)果

2.9 DEGs的KEGG功能注釋分析

KEGG分析結(jié)果表明，共有11905個unigene注釋到該數(shù)據(jù)庫中，對DEGs中顯著性富集的Pathway分析得出，有122個DEGs在37個代謝通路上（表2），表中信息以富集顯著由大到小依次排列。與類胡蘿卜素生物合成相關(guān)的基因包括9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶、脫落酸8’-羥化酶、紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶，硫甙生物合成相關(guān)的基因包括酪氨酸-單氧酶、纈氨酸-單加氧酶，植物激素信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的基因包括生長素誘導蛋白、生長素轉(zhuǎn)運蛋白、蛋白磷酸酶、木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶蛋白、脫落酸受體等。這些途徑為研究三七干旱脅迫的具體過程、功能和途徑提供了具體依據(jù)。同時在KEGG富集中，只有對照中存在且表現(xiàn)為下調(diào)的代謝路徑為硫甙生物合成，參與該途徑調(diào)控的酪氨酸-單氧酶和酪氨酸-單加氧酶，該蛋白家族是高度保守的可溶性酸性蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)著許多重要細胞生命活動，如新陳代謝、細胞周期、細胞生長發(fā)育、細胞的存活以及凋亡。只在干旱脅迫下參與的且表現(xiàn)為上調(diào)的苯丙素生物合成和苯丙氨酸代謝，參與該途徑調(diào)控的苯丙氨酸氨裂解酶和苯丙氨酸解氨酶。干旱應(yīng)答基因的表達物質(zhì)主要包括信號級聯(lián)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白（如蛋白激酶、蛋白磷酸酶和轉(zhuǎn)錄因子），保護細胞膜的功能蛋白以及其他蛋白質(zhì)（胚胎發(fā)育晚期的豐富蛋白、抗氧化劑、滲調(diào)蛋白），與水通道和離子吸收相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白、糖轉(zhuǎn)運蛋白等。

表2 DEGs富集的37條KEGG通路

3 結(jié)論

植物已經(jīng)進化出有效的機制來應(yīng)對生物或非生物的挑戰(zhàn)。本研究生理水平的結(jié)果表明，干旱對于三七影響較大。對植物抗旱性的多種相關(guān)酶進行分析，發(fā)現(xiàn)POD的活性變化大于SOD，與對照相比CAT變化量最少，而MDA顯著升高且比其他指標升高得多，說明在三七干旱脅迫過程中MDA更為敏感。在觀測三七受干旱脅迫時可以重點關(guān)注。對干旱處理組和對照組的轉(zhuǎn)錄組分析表明，干旱處理組和對照組的差異基因顯著富集，在差異基因中控制ABA合成代謝的關(guān)鍵酶，9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶被顯著富集，說明干旱條件下三七可能通過ABA相關(guān)合成酶的增加調(diào)控干旱應(yīng)答。此外，ABA能誘導脯氨酸的積累，推測三七可能通過增加脯氨酸應(yīng)對干旱脅迫。

4 討論

植物抗旱性是一種復雜的表型，干旱導致植物多個性狀發(fā)生變化，且每個性狀都由眾多特異性分子網(wǎng)絡(luò)的多效基因調(diào)節(jié)。由于這種復雜性，植物會產(chǎn)生多種策略來應(yīng)對干旱脅迫，這主要包括POD、SOD、CAT等的酶保護系統(tǒng)和ABA等物質(zhì)的非酶類保護系統(tǒng)[14]。當植物在干旱脅迫下生長時，會產(chǎn)生對植物生長發(fā)育有不利影響的活性氧(ROS)。為應(yīng)對氧化損傷，植物細胞中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等酶被激活。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著干旱時間的延長，可溶性蛋白的含量會持續(xù)上升[15]。

通常認為，當受到干旱脅迫的影響時葉綠素含量會下降。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)，適當?shù)母珊的軌蚣ぐl(fā)植物在逆境中生存的潛力，在中度干旱脅迫下的植物葉綠素含量會上升[16-17]。在本實驗中，干旱脅迫下葉綠素含量高于對照處理，說明此干旱程度并未對三七葉綠素合成產(chǎn)生損傷，此結(jié)果與左應(yīng)梅等[18]的研究結(jié)果一致。

在本實驗的干旱處理下葉綠素含量以及可溶性蛋白含量與對照相比有升高的趨勢，但是升高的量不多。前人研究表明，當植物遭受干旱時可溶性蛋白含量將升高，隨著干旱程度的加重，可溶性蛋白含量升高的幅度變大[19]，因此綜合其他各類指標，可能是此次干旱程度并未對三七的光合以及水分滲透壓產(chǎn)生損傷。在本研究中，三七受到干旱脅迫后，可溶性蛋白、POD、SOD、CAT、MDA均有不同程度的升高。其中，與對照相比變化最大的是MDA，增加了88.41%，MDA與植物細胞膜受傷害損傷的程度呈正相關(guān)[20]，說明在干旱處理下細胞膜系統(tǒng)受較大損傷。三七遭受干旱土壤中含水量降低時，三七葉片對其敏感程度排名從高到低依次為POD＞CAT＞SOD，此結(jié)果與左應(yīng)梅等[18]在4種人參屬植物的抗旱性比較研究中，POD活性比SOD活性在土壤含水量低時敏感度高相一致；且與趙宏光等[21]在調(diào)整土壤含水量探討三七葉片對土壤水分含量的響應(yīng)特點研究中，對土壤含水量敏感度排名從高到低依次為POD活性、SOD活性一致。

對干旱三七轉(zhuǎn)錄組功能注釋分析表明，9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)、蛋白磷酸酶、生長素轉(zhuǎn)運蛋白等都在代謝通路上且富集顯著，NCED是控制ABA合成代謝的關(guān)鍵酶[22]。而ABA是植物缺水的主要信號，有研究表明，干旱條件下植物ABA水平明顯升高。另外ABA是觸發(fā)干旱信號級聯(lián)的激素信使，干旱脅迫下的ABA能誘導脯氨酸的積累[23-24]，本實驗中NCED在代謝通路上顯著富集，說明三七在受到干旱脅迫時積累ABA應(yīng)對干旱環(huán)境，水分脅迫下ABA增加能誘導脯氨酸的積累，提高細胞的保水能力，維持了細胞正常的代謝[25]。在本研究中MDA顯著升高，而葉綠素含量也升高，推測三七在本研究中的干旱脅迫下三七積累了脯氨酸，增強了自生的抗旱性。

本實驗將影響植物抗旱性的多種相關(guān)酶進行分析，清晰地展現(xiàn)出三七抗旱性規(guī)律，為今后三七遭受干旱脅迫時生理機能的變化情況提供科學的參考依據(jù)。干旱脅迫對文心蘭SOD活性和POD活性影響程度為SOD活性＞POD活性，與本實驗結(jié)果相反，可能是植物種類不同，其對應(yīng)的抗旱性機理存在差異[26]。干旱處理與對照相比，CAT變化量是所有指標中最小的。丁菲等[27]研究表明，CAT酶在構(gòu)樹抗干旱脅迫上的作用不明顯，MDA升高幅度最大。有研究中用MDA含量來衡量三七葉片膜脂過氧化及細胞膜受傷害程度，本研究中干旱處理的MDA活性是所有測定指標中升高幅度最大的，說明MDA在整個抗旱性機理中很重要。

5 不足與展望

干旱脅迫對于植物研究是一個研究重點和難點，在以往和今后的研究中都是研究熱點。本研究從生理方面的酶活變化、葉綠素變化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析等多方面探討干旱對于三七的影響。但是對于影響的分析不夠深入，對于干旱應(yīng)答通路上的基因還可以深入挖掘。在今后的研究中，將著重研究干旱應(yīng)答的機理，從分子角度深入挖掘ABA合成相關(guān)基因與干旱的關(guān)系。此外，三七是一類重要的中藥材，今后的研究中可以關(guān)注干旱與三七皂苷積累的關(guān)系。