唐敏，徐芳輝，楊吟宇，晏莉莎，鄧鳳君

（益陽醫(yī)學高等?？茖W校，湖南益陽 413000）

黃皮酰胺（Clausenmaide，CLA）是從蕓香科植物黃皮（Clausenalansium）葉水浸膏中分離得到的一種吡咯烷酮類化合物[1]，有望開發(fā)成治療老年癡呆癥（Alzheimer's disease，AD）的新藥[2-5]，其結構如圖1 所示。CLA 化學結構包含4 個不對稱碳原子，即8對對映體。其中(-)-CLA 和(+)-CLA 絕對構型分別為：3S，4R，5R，6S 和3R，4S，5S，6R。(-)-CLA結構具有兩個疏水苯環(huán)且疏水性較強，使其容易進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并通過血腦屏障發(fā)揮作用。研究表明，(-)-CLA 可以拮抗Aβ 誘導的PC12 細胞神經(jīng)毒性和增強的基底突觸傳遞[6]，可改善失憶癥動物模型的學習和記憶[2,7]。目前，(-)-CLA 已完成Ⅰ期臨床試驗，正在準備Ⅱ期臨床試驗。

圖1 黃皮酰胺結構

(-)-CLA 具有良好的促智作用，但(+)-CLA 沒有促智作用[8]，表明黃皮酰胺的藥理作用存在手性選擇性。(-)-CLA 黃皮酰胺能改善樟柳堿所致的記憶障礙，這與其逆轉樟柳堿引起的腦內乙酰膽堿含量降低作用相關[9]。同時研究發(fā)現(xiàn)CLA 的抑制AchE 作用也存在手性選擇性，(-)-CLA 作用強于(+)-CLA[10]。

黃皮酰胺和合成路線最早由拜爾公司設計[11]，之后中國醫(yī)學科學院藥物研究所黃量院士設計出了黃皮酰胺的仿生合成路線[12]，該法以苯甲醛和氯乙酸甲酯為原料經(jīng)Darzens 縮合、酯胺交換、氧化、環(huán)合等步驟生成外消旋黃皮酰胺酮，經(jīng)重結晶分離得到黃皮酰胺酮，再經(jīng)還原劑硼氫化鈉的作用得到黃皮酰胺。目前，化合物(-)-CLA 可以人工合成[7]，其合成技術已獲得美國專利批準[6]。

黃皮酰胺是一類γ-內酰胺環(huán)上發(fā)生多取代的2-吡咯烷酮類化合物，其結構中可供修飾的位置較多，其中7 位羥基就是一個值得改造的位置，因為黃皮酰胺所具有的促智和保肝作用與其7 位羥基的存在有著密切聯(lián)系。根據(jù)生物電子等排原理[13]，羥基和氨基是一對經(jīng)典的一價生物電子等排體，將黃皮酰胺7 位羥基用氨基替換后，可能得到與黃皮酰胺類似或更好藥理活性的化合物。劉卡特反應（Leuckart-Wallach Reaction）不需要催化氫化就能一步直接將羰基轉變?yōu)榘被鵞14]。該法原料易得，不需特殊設備，產品質量好，產率較高，反應所用的甲酸是一種可再生的還原劑，綠色環(huán)保[15]，其反應過程見圖2。

圖2 7-羰基的劉卡特反應

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AQUITY UPLC/Q-TOF micro 質譜，美國Waters；AVANCE-300 核磁共振氫譜，德國Bruker；Vario EL元素分析儀，德國Elementar；JA1203 電子天平，上海恒平科學儀器有限公司；X6 型顯微熔點測定儀，北京泰克儀器有限公司；RE-52A 型旋轉蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限公司。

甲酸，分析純，江蘇強盛化工有限公司；氧化苯乙烯，分析純，上海乙基化工有限供公司。的黃皮酰胺仿生合成路線合成[12]。

(±)-3-羥基-4-苯基-5-(甲酰氨基)芐基-N-甲基-2-吡咯烷酮的合成，在裝有溫度計、冷凝管、磁力攪拌裝置的50 mL 三頸瓶中加入黃皮酰胺酮

1.2 目標化合物的合成

原料化合物3-羥基-4-苯基-5-苯甲酰基-N-甲基-γ-內酰胺（黃皮酰胺酮）按照黃量院士設計0.296 g（0.001 mol）、0.1 g MgCl2·H2O，加入2 mL甲酰胺（0.05 mol)、1mL 甲酸攪拌溶解，緩慢升溫至130 ℃攪拌反應，TLC（硅膠GF254，乙酸乙酯∶石油醚=4 ∶1，紫外燈（UV）下觀察）跟蹤，1 h 后升溫至165 ℃，反應5 h 后原料點消失。反應液中加入20 mL 蒸餾水攪拌10 min，然后用3×10 mL 二氯甲烷萃取水相，收集有機相，依次用4×50 mL 水、3×30 mL 飽和碳酸氫鈉溶液、2×30 mL 飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥過夜，濾過，濾液減壓蒸干得白色固體，乙酸乙酯重結晶得白色片狀結晶0.203 g，產率63.7%，熔點（mp）212.3～213.2 ℃。

(±)-3-羥基-4-苯基-5-(氨基)芐基-N-甲基-2-吡咯烷酮的合成，在裝有溫度計、冷凝管、磁力攪拌裝置的50 mL 三頸瓶中加入(±)-3-羥基-4-苯基-5-(甲酰氨基)芐基-N-甲基-2-吡咯烷酮0.324 g（0.001 mol）加入5 mL 無水乙醇溶解后，滴加濃鹽酸0.15 mL，80 ℃條件下回流4 h 后出現(xiàn)白色沉淀，抽濾，濾渣用無水乙醇洗滌至中性后溶解于10 mL 蒸餾水中，過濾，往澄清溶液中加入20% NaOH溶液，調pH 至中性，析出沉淀，濾過，濾餅用乙酸乙酯重結晶得片狀結晶0.207 g，產率68.5%，mp 195.8～196.5 ℃。

1.3 分子對接

從Protein Data Bank（PDB 庫，http://www.rcsb.org）下載與多奈哌齊復合的乙酰膽堿酯酶（PDB ID：1EVE）的晶體結構[16]。本研究采用SYBYL-X 2.0 分子模擬軟件，將復合物中的小分子配體抽離，刪去水分子，生成結合口袋。隨后進行分子結構優(yōu)化、分子-配體對接以及相關評價。分子三維結構顯示采用Chemdraw3D 軟件，二維結構展示采用Chemdraw2D 軟件。

2 結果與分析

2.1 化合物的結構鑒定

質譜、核磁共振氫譜、元素分析等數(shù)據(jù)與目標化合物結構一致，證實所得化合物結構正確。

(±)-3-羥基-4-苯基-5-（甲酰氨基）芐基-N-甲基-2-吡咯烷酮，m/z 325.15；元素分析（C）70.20、（H）6.21、（N）8.47；1H-NMR：2.841（s，3H，N-CH3），3.020（t，J=7.5 Hz，1H，C4-H），3.945（dd，J=7 Hz，1H，C3-H），4.072（dd，J=7 Hz，1H，C5-H），5.560（dd，J=10 Hz，1H，C7-H），5.936（d，J=4.5 Hz，1H，C3-OH，D2O 交換后消失），6.860～7.210（m，10H，Ar-H），8.248（s，1H，C8-H），8.831（d，J=10 Hz，1H，NH，D2O 交換后消失）。

（±）-3-羥基-4-苯基-5-（氨基）芐基-N-甲基-2-吡咯烷酮，m/z297.16；元素分析（C）72.98、（H）6.72、（N）9.30；1H-NMR：2.089（br，2H，NH2，D2O 交換后消失），2.907（s，3H，N-CH3），3.007（t，J=5.0 Hz，1H，C4-H），3.764（dd，J=5 Hz，1H，C3-H），3.798（d，J=5 Hz，1H，C5-H），4.379（d，J=3.0 Hz，1H，C7-H），6.00（br，1H，C3-OH，D2O 交換后消失），6.753-7.314（m，10H，Ar-H）。

2.2 分子模擬對接結果

分子對接打分結果見表1?？煽啃则炞C結果顯示，乙酰膽堿酯酶（PDB ID：1EVE）原配體多奈哌齊重新對接后發(fā)現(xiàn)其結合位置與原受體結晶中的配體位置幾乎重疊，總得分（Total score）值為4.573 3。表明該對接實驗所選用的蛋白晶體結構及所采用的對接方法均可靠，可用于黃皮酰胺類似物乙酰膽堿酯酶抑制活性的虛擬篩選。(-)-CLA 與乙酰膽堿酯酶結合對接效果強于(+)-CLA，這與文獻[11]報道的結果一致。(-)-3-羥基-4-苯基-5-(α-氨基)芐基-N-甲基-2-吡咯烷酮Total score 高達6.092 1，超過了多奈哌齊的打分，(+)-3-羥基-4-苯基-5-(β-氨基)芐基-N-甲基-2-吡咯烷酮的打分為4.572 3，與多奈哌齊的打分非常接近。分子對接相互作用模式圖見圖3。

表1 分子對接結果

3 結論

圖3 分子對接相互作用模式圖

從已有黃皮酰胺抑制乙酰膽堿酯酶的生物活性出發(fā)，通過生物電子等排原理及Leuckart-Wallach 反應將3-羥基-4-苯基-5-苯甲?；?N-甲基-γ-內酰胺6 位上的羰基改造成氨基，以期開發(fā)出活性更好的乙酰膽堿酯酶抑制劑。同時基于結構的配體設計原理，通過分子對接試驗發(fā)現(xiàn)目標化合物3-羥基-4- 苯基-5-(β- 氨基) 芐基-N- 甲基-2- 吡咯烷酮與乙酰膽堿酯酶1EVE 對接效果較好。但Leuckart-Wallach 反應生成的胺類化合物為消旋體，其分離工作有待進一步的研究，此外通過分離得到的單體化合物還需要進行乙酰膽堿酯酶活性抑制試驗確證。