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        N-甲基吡咯烷酮降解菌株的篩選鑒定及應用

        2023-11-02 14:01:46司更花楊傳倫孫建忠馮文娟韓立霞
        工業(yè)微生物 2023年5期

        司更花,楊傳倫,孫建忠,馮文娟,楊 麗,韓立霞

        黃河三角洲京博化工研究院有限公司,山東 濱州 256500

        N-甲基吡咯烷酮(N-methyl pyrrolidinone,簡稱NMP),由于其具有低揮發(fā)性、高極性、無腐蝕性及良好的水溶性等特點[1-3],經常作為一種典型的選擇性強和穩(wěn)定性好的有機物極性溶劑,是一種重要的化工原料[2-5]。N-甲基吡咯烷酮被廣泛應用于鋰電池、染料、醫(yī)藥、洗滌劑和黏合劑等多種制造行業(yè)中[6-7]。因其良好的水混溶性特點,極易隨著廢水排放到環(huán)境中。但N-甲基吡咯烷酮本身結構的穩(wěn)定性、較差的可生化性及較強的生物毒性等特點[8],使未達排放指標的N-甲基吡咯烷酮被釋放到環(huán)境中,會對生態(tài)系統(tǒng)和水域環(huán)境造成不可彌補的傷害。因此如何快速、高效地消除N-甲基吡咯烷酮造成的環(huán)境污染,成為亟待解決的環(huán)境問題。

        目前,含N-甲基吡咯烷酮廢水的處理方法主要為物理化學法,該方法不但成本較高,且極易造成環(huán)境二次污染;除此之外生物處理技術具有高效、經濟且無二次污染等特點,能實現無毒無害的環(huán)境治理,是目前應用較為廣泛的環(huán)境處理技術[9]。因此,在環(huán)境中篩選能夠消除N-甲基吡咯烷酮的有效菌株,是解決N-甲基吡咯烷酮環(huán)境污染問題最直接有效的方法。然而,目前對N-甲基吡咯烷酮的高效降解菌株鮮有研究,本文在某廢水處理的活性污泥中,通過馴化后,篩選出可降解N-甲基吡咯烷酮的有效菌株,經鑒定地衣芽孢桿菌可對N-甲基吡咯烷酮進行高效降解。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        1.1.1 菌源

        活性污泥來自于山東某新材料股份有限公司廠區(qū)廢水生化處理裝置中的好氧曝氣池。

        1.1.2 儀器和試劑

        儀器:HZQ-X100 型振蕩培養(yǎng)箱,哈爾濱市東聯電子技術開發(fā)有限公司;MQD-B3R 組合式全溫震蕩培養(yǎng)箱,上海旻泉儀器有限公司;PHS-3C 型精密pH 計,上海雷磁儀器廠;YXQ-50SI Ⅰ型高野滅菌鍋,上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;SW-CJ-1D 型超凈工作臺,蘇州蘇凈凈化科技有限公司;PCR 儀,立康生物科技有限公司;Waters Arc 型高效液相色譜儀,上海沃特世科技有限公司。

        LB 培養(yǎng)基:胰蛋白胨10.0 g/L,酵母粉5.0 g/L,氯化鈉10.0 g/L,pH 7.2;LB 固體培養(yǎng)基在上述LB培養(yǎng)基的基礎上添加1.5%的瓊脂,經高壓蒸汽滅菌(121℃,20min)后制得。

        無機鹽培養(yǎng)基:K2HPO40.6 g/L,KH2PO40.5 g/L,NaCl 0.1 g/L,MgSO40.06 g/L,CaCl20.08 g/L,FeSO40.008 g/L,MnSO40.008 g/L,pH 7.2,經高壓蒸汽滅菌(121 ℃,20 min)后制得。

        上述二者,若需要加入N-甲基吡咯烷酮,可根據具體需求進行添加,本文中其含量在200 mg/L~1 000 mg/L?;瘜W藥品均為分析純。

        1.1.3 N-甲基吡咯烷酮的測定方法

        采用Waters Arc 型高效液相色譜儀對N-甲基吡咯烷酮進行定性、定量測定[10-11]。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 降解菌株的馴化與分離

        從山東某新材料公司的好氧曝氣池中采集活性污泥,建立實驗室好氧體系,添加N-甲基吡咯烷酮進行污泥馴化,每24 h 添加1 次N-甲基吡咯烷酮,馴化30 d。

        稱取馴化污泥1 g,加入經過121 ℃高溫滅菌20 min 的100 mL0.9%氯化鈉溶液中,進行搖床180 r/min 混勻30 min 后靜止2 h,吸取上清液用無菌水梯度稀釋103~1 010 倍,在加入N-甲基吡咯烷酮的LB 固體培養(yǎng)基中進行涂布,置于生化培養(yǎng)箱中進行35 ℃培養(yǎng)24 h。

        挑選培養(yǎng)皿上具有明顯差異的單菌落,采用平板劃線分離的方法進行純化培養(yǎng),連續(xù)純化3~5次,經過反復劃線分離純化得到的純菌株,經試管斜面富集培養(yǎng)后,保存于4 ℃冰箱中備用。

        1.2.2 降解菌株的篩選

        將分離的菌株接種至新鮮的LB 培養(yǎng)基中,富集培養(yǎng)24 h,取1 mL 菌液用0.9%氯化鈉溶液重懸菌體3~5 次,接入100 mL 含200 mg/L N-甲基吡咯烷酮的無機鹽培養(yǎng)基中,以不接菌株的無機鹽培養(yǎng)基作對照,所有處理及對照組均設3 次重復,降解24 h 后進行測定N-甲基吡咯烷酮的含量,將具有良好降解能力的菌株進行保存,選取降解能力穩(wěn)定、降解效率最高的菌株進行后續(xù)研究及應用。

        1.2.3 降解菌的鑒定

        降解菌株經LB 培養(yǎng)基平板劃線培養(yǎng)24 h 后,觀察其菌落形態(tài)。

        降解菌基因組DNA 采用試劑盒提取菌株的總DNA,用16S rDNA 通用引物(27F:AGAGTTTGATC CTGGCTCAG;1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT)進行PCR 擴增[12-15]。PCR 反應體系:5.0 uL 10X Taq緩沖液、1.0 uL 引物、1.0 uL 模板DNA、1.0 uL dNTP、1.0 uL DNA 聚合酶,用40 uL 的無菌水補足至50 uL 體系。擴增程序:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃引物延伸90 s、循環(huán)32次,72 ℃延伸10 min。最后將PCR 純化產物委托上海生工生物工程股份有限公司進行測序,將測序產物經由NCBI 數據庫進行序列比對。

        1.2.4 降解菌的驗證及應用

        采用無機鹽培養(yǎng)基,添加N-甲基吡咯烷酮作為唯一C 源和能源,N-甲基吡咯烷酮的質量濃度為200~1 000 mg/L,菌劑添加量為1%,每2 h 取樣進行N-甲基吡咯烷酮含量測定。

        將篩選的高效降解菌添加至某芳綸紙生產廢水生化裝置,其受到N-甲基吡咯烷酮的沖擊,菌株發(fā)酵后的菌液添加量為0.1%。溫度為35 ℃,溶解氧為4 mg/L,pH 為7.2~7.8,水力停留時間為12 h。

        2 結果與分析

        2.1 降解菌株的篩選

        降解菌株經過初篩純化后,得到6 株菌。采用無機鹽培養(yǎng)基,以N-甲基吡咯烷酮為唯一C 源和能源,在200 mg/L 的質量濃度下,8 h 后不同菌株對N-甲基吡咯烷酮去除率見表1。其中N-3 對N-甲基吡咯烷酮的降解效果最好,對200 mg/L N-甲基吡咯烷酮的降解率為100%。

        表1 不同菌株對N-甲基吡咯烷酮的降解效果

        2.2 降解菌株的鑒定

        降解菌株N-3 在LB 培養(yǎng)基上表現為菌落較小、呈松散狀態(tài)、表面光滑、有光澤(圖1)。

        圖1 降解菌N-3 在LB 固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

        對N-3 降解菌進行16S rDNA 基因測序,將所獲得序列與GenBank 中已知序列進行對比,其16S rDNA 的核苷酸序列與芽孢桿菌屬(Bacillus)不同菌株的核苷酸序列有大于99%的同源性,與其中明確標記為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的菌株有100%的同源性。結合該菌株的主要形態(tài)特征,確定其為地衣芽孢桿菌。

        2.3 降解菌對N-甲基吡咯烷酮的降解性能

        將降解菌N-3 經過LB 液體培養(yǎng)及培養(yǎng)24 h后,接種至含200 mg/L N-甲基吡咯烷酮的無機鹽培養(yǎng)基中,每2 h 進行取樣測定,12 h 內可得200 mg/L 的N-甲基吡咯烷酮完全降解,空白樣品中的N-甲基吡咯烷酮含量基本未發(fā)生變化(圖2)。

        圖2 N-3 在12 h 內對200 mg/LN-甲基吡咯烷酮的降解效果

        將降解菌N-3 經過LB 液體培養(yǎng)24 h 后,接種至含1 000 mg/L N-甲基吡咯烷酮的無機鹽培養(yǎng)基中,每2 h 進行取樣測定,20 h 內可對1 000 mg/L的N-甲基吡咯烷酮降解率達99.99%,而空白樣品中的N-甲基吡咯烷酮含量基本未發(fā)生變化(圖3)。

        圖3 N-3 對1 000 mg/LN-甲基吡咯烷酮的降解效果

        2.4 降解菌N-3 在工業(yè)廢水處理中的應用

        某芳綸紙生產廢水處理裝置受到N-甲基吡咯烷酮的沖擊,出水氨氮達到205.63 mg/L,COD 為1 053.69 mg/L,出水指標不合格,經測定,處理廢水中含有N-甲基吡咯烷酮256.92 mg/L。將N-3 菌株發(fā)酵后添加至此廢水裝置的好氧池中,菌劑添加量為0.1%,好氧池池溫為35 ℃,溶解氧為4 mg/L,pH 為7.0~7.8,水力停留時間為12 h,菌劑添加3 h,出水氨氮降至50.27 mg/L,COD 為598.23 mg/L,經測定,菌劑添加5 h 后,出水氨氮為0 mg/L,COD 為105.23 mg/L,出水指標合格,出水中N-甲基吡咯烷酮的含量為0 mg/L。

        3 結論

        本文從活性污泥中獲得一株可高效降解N-甲基吡咯烷酮的菌株,該菌株為好氧菌,可以N-甲基吡咯烷酮為唯一C 源和能源穩(wěn)定生長,經16S rDNA 測序比對鑒定出此菌株為地衣芽孢桿菌。

        在12 h 內,該菌株可對200 mg/L 的N-甲基吡咯烷酮完全降解;在20 h 內,該菌株對1 000 ppm的N-甲基吡咯烷酮的降解率達99.99%。本試驗所獲得的N-甲基吡咯烷酮高效降解菌株,彌補了N-甲基吡咯烷酮生物處理有效菌劑的空白,為工業(yè)廢水中N-甲基吡咯烷酮生物處理提供了可能,為進一步研究N-甲基吡咯烷酮生物處理途徑奠定了基礎。

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