趙陽，游元丁，李躍紅，陳露，林雪丹，冉茂乾，焦彥朝

（1.六盤水市口岸服務(wù)中心，貴州六盤水 553000;2.國家果蔬檢測重點實驗室，貴州六盤水553000;3.貴陽海關(guān)綜合技術(shù)中心，貴州貴陽 550081）

CNAS-RL02:2018《能力驗證規(guī)則》中說明能力驗證是實驗室重要的外部質(zhì)量控制活動，參與能力驗證活動是除現(xiàn)場評審以外，可以證明實驗室在相關(guān)檢測領(lǐng)域具有檢測能力的一種方式[1-2]。參與能力驗證活動可通過對人員能力、檢測方法、設(shè)施場所和儀器設(shè)備等方面判斷實驗室是否具有滿足相關(guān)檢測活動的需求[3]。中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）將能力驗證結(jié)果的滿意度評價作為實驗室能力判斷的一項重要依據(jù)[4-5]。因此，參與能力驗證活動對檢測實驗室具有重要意義。

新型冠狀病毒主要經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播[6]，國家衛(wèi)生健康委員會印發(fā)的《預(yù)防新型冠狀病毒感染的肺炎口罩使用指南》[7]指出，口罩可以降低被新型冠狀病毒感染的風(fēng)險?？谡植粌H可以防止已被感染新型冠狀病毒的病人噴射飛沫，同時降低飛沫量和噴射速度，還可以阻擋外部含病毒的飛沫核，防止他人吸入。目前，口罩成為大眾預(yù)防新型冠狀病毒的首要防疫用品，因此，相關(guān)檢測實驗室對口罩質(zhì)量的把關(guān)極為重要。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa，又稱銅綠假單胞菌）是兩種常見的“化膿性致病菌”。金黃色葡萄球菌在臨床上主要引起皮膚及軟組織化膿性感染、上呼吸道感染等[8]；在燒傷、外科創(chuàng)傷手術(shù)后使用受綠膿桿菌污染的衛(wèi)生用品可引起局部化膿感染[9]?？谡种苯咏佑|人體的皮膚或粘膜，關(guān)系到使用者的身體健康安全，醫(yī)用防護口罩技術(shù)要求規(guī)定微生物指標綠膿桿菌與金黃色葡萄球菌不得檢出[10]。為此，本實驗室參照一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準[11]及一次性使用衛(wèi)生用品中致病菌的檢測參試指導(dǎo)書參與了由國家市場監(jiān)督管理總局組織的2020年國家級能力驗證活動，確保檢測人員具有檢測一次性使用衛(wèi)生用品中致病菌的技術(shù)能力，同時提高防疫防護用品的檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 樣品信息

樣品為真空西林瓶包裝的含菌口罩，購自北京海關(guān)；綠膿桿菌檢測樣品編號為20DP-2803、20DP-0126；金黃色葡萄球菌檢測樣品編號為20DP-1248、20DP-1709。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

SCDLP 培養(yǎng)液、十六烷三甲基溴化銨瓊脂、血瓊脂平板、營養(yǎng)瓊脂（NA）、Baird-Parker 平板、綠膿菌素測定培養(yǎng)基、硝酸鹽胨水培養(yǎng)基、甘露醇培養(yǎng)液、凍干血漿、明膠等培養(yǎng)基及生化試劑管均購自北京陸橋，已進行相關(guān)驗收且在有效期內(nèi)；VITEK2 革蘭氏陽性（GP）細菌鑒定卡，購自生物梅里埃公司且在有效期內(nèi)。

1.3 試驗方法

1.3.1 制備待測樣液

根據(jù)參試指導(dǎo)書要求，在生物安全柜內(nèi)無菌操作打開西林瓶，瓶內(nèi)樣品為口罩實物樣品，可直接用于檢測，無需再次稱量。使用滅菌剪刀將口罩剪碎后加入100 mL 滅菌生理鹽水中，充分混勻，得到生理鹽水樣，即為待測樣液。

1.3.2 綠膿桿菌檢測方法

取樣液5 mL，加入50 mL SCDLP 培養(yǎng)液中，充分混勻，于（35±2）℃培養(yǎng)18～24 h，從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種CN 平板、十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板，置（35±2）℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落特征。挑取可疑菌落劃線接種營養(yǎng)瓊脂進行純培養(yǎng)，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，采用全自動微生物鑒定儀（VITEK 2 COMPACT）進行鑒定。同時挑取可疑菌落進行革蘭氏染色，鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性菌者，進行生化試驗。

1.3.3 金黃色葡萄球菌檢測方法。

取樣液5 mL，加入50 mL SCDLP 培養(yǎng)液中，充分混勻，于（35±2）℃培養(yǎng)18～24 h，取增菌液劃線接種血瓊脂平板及Baird-Parker 平板。挑取可疑菌落劃線接種營養(yǎng)瓊脂進行純培養(yǎng)，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，采用全自動微生物鑒定儀（VITEK 2 COMPACT）進行鑒定。同時挑取典型菌落進行革蘭氏染色，鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽性球菌者，進行生化試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠膿桿菌檢測結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)液特征及平板上菌落形態(tài)

如表1 所示，將樣液加入到SCDLP 培養(yǎng)液中，36 ℃培養(yǎng)24 h 后可觀察到培養(yǎng)液呈黃綠色，有一層薄菌膜。從薄菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種于十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板、CN 平板。樣品編號20DP-0126 和20DP-2803 挑取的培養(yǎng)物在十六烷三甲基溴化銨平板上生長良好，菌落扁平，邊緣不整；在CN平板上為圓形、平滑、濕潤的黃綠色菌落，紫外光照射下觀察有熒光，菌落形態(tài)均為典型綠膿桿菌菌落特征。

2.1.2 生化鑒定

挑取可疑菌落進行革蘭氏染色，20DP-0126 和20DP-2803 樣品鏡檢結(jié)果均為革蘭氏陰性桿菌，并進行相應(yīng)的生化試驗。表2 結(jié)果顯示，氧化酶試驗陽性、綠膿桿菌毒素試驗陽性、硝酸鹽還原產(chǎn)氣陽性、明膠液化陽性、42 ℃生長試驗陽性，符合典型綠膿桿菌生化特征。20DP-0126 和20DP-2803 口罩樣品檢測結(jié)果均為綠膿桿菌檢出。

表1 綠膿桿菌口罩樣品菌落形態(tài)表

表2 綠膿桿菌口罩樣品生化鑒定結(jié)果表

2.2 金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)液特征及平板上菌落形態(tài)

SCDLP 培養(yǎng)液經(jīng)36 ℃培養(yǎng)24 h 后培養(yǎng)基變渾濁，挑取培養(yǎng)物劃線接種血平板、Baird-Parker 平板。如表3 所示，樣品編號20DP-1248、20DP-1709 在血瓊脂培養(yǎng)基上菌落特征為金黃色、大而突起、圓形、不透明、表面光滑、周圍有溶血圈；在Baird-Parker 平板上菌落特征為黑色、表面光滑、凸起、濕潤有光澤、淺色邊緣外有一清晰帶。菌落形態(tài)在血瓊脂平板與Baird-Parker 平板上均為典型金黃色葡萄球菌菌落特征。

表3 金黃色葡萄球菌口罩樣品菌落形態(tài)表

2.2.2 生化鑒定

挑取可疑菌落進行革蘭氏染色，20DP-1248 和20DP-1709 樣品鏡檢結(jié)果均為革蘭氏陽性葡萄球菌，并進行相應(yīng)的生化試驗。表4 結(jié)果顯示，甘露醇發(fā)酵試驗陽性、血漿凝固酶試驗陽性，20DP-1248 和20DP-1709 口罩樣品檢測結(jié)果均為金黃色葡萄球菌檢出。

表4 金黃色葡萄球菌口罩樣品生化鑒定結(jié)果表

2.3 全自動微生物生化系統(tǒng)鑒定

分別從每個樣品不同平板上挑取3 個可疑菌落劃線接種營養(yǎng)瓊脂，使用純培養(yǎng)物進行全自動微生物生化系統(tǒng)VITEK2 鑒定。20DP-0126、20DP-2803可疑菌落純培養(yǎng)后均鑒定為99%概率為綠膿桿菌；20DP-1248、20DP-1709 可疑菌落純培養(yǎng)后均鑒定為99%概率為金黃色葡萄球菌。VITEK2 鑒定結(jié)果均與傳統(tǒng)生化反應(yīng)鑒定結(jié)果相符合。

3 結(jié)論

參考文獻：

[1] 中國合格評定國家認可委員會.CNAS-RL02:2018 能力驗證規(guī)則按照一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準及能力驗證參試指導(dǎo)書進行檢測，結(jié)果表明，20DP-0126、20DP-2803 檢出綠膿桿菌，20DP-1248、20DP-1709檢出金黃色葡萄球菌。[S].2018.

[2] 趙陽,游元丁,冉茂乾,等.一例志賀氏菌測量審核分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2020,48(8):201-203.

[3] 任敏紅,依力哈木·爾西丁,王興華,等.能力驗證在檢測實驗室質(zhì)量管理中的應(yīng)用[J].中國檢驗檢測,2019,27(2):58-60,23.

[4] 劉穎,薛靚.測量審核的實施方法及滿意度評定[J].中國測試,2012,38(S1):107-110.

[5] 區(qū)偉珍. 淺談實驗室質(zhì)量控制的方法[J]. 廣東化工,2015,42(7):116,83.

[6] 國家衛(wèi)生健康委員會辦公廳,國家中醫(yī)藥管理局辦公室.關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第七版)的通知 國衛(wèi)辦醫(yī)函〔2020〕184 號[EB/OL].(2020-03-03)[2021-04-12]http://www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2020-03/04/content_5486705.htm.

[7] 國家衛(wèi)生健康委員會.關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒感染不同風(fēng)險人群防護指南和預(yù)防新型冠狀病毒感染的肺炎口罩使用指南的 通 知[EB/OL].(2020-01-30)[2020-04-12]http://www.gov.cn/xinwen/2020-01/31/content_5473401.htm.

[8] 范陳良,李小四,吳曉燕.皮膚及軟組織感染中金黃色葡萄球菌臨床分布和耐藥特性分析[J].中國抗生素雜志,2017,42(5):413-417.

[9] 韓青松,簡永利,涂宜強,等.綠膿桿菌研究進展[J].畜牧與飼料科學(xué),2012,33(1):122-124.

[10] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.GB 19083-2003 醫(yī)用防護口罩技術(shù)要求[S].北京:中國標準出版社,2003.

[11] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.中國國家標準化管理委員會.GB 15979-2002 一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準[S].2002.