程若溪 賴銘裕 蔣莉萍 吳謝慧 梁 凱

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年消化內(nèi)科，南寧市 530021，電子郵箱:294213913@qq.com)

胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的癌癥，其發(fā)病率位于全球第5位，死亡率居全球第4位[1]。2019年，中國胃癌發(fā)病率約為43.1/10萬，病死率為29.6/10萬[2]，嚴重威脅我國人民的生命健康。因此，探索胃癌的發(fā)病機制至關(guān)重要。微小RNA(microRNA,miR) 是真核生物進化中出現(xiàn)的小核糖核酸，主要作用是抑制非必需遺傳物質(zhì)或轉(zhuǎn)錄物質(zhì)，大多數(shù)miR由非編碼或編碼mRNA的內(nèi)含子編碼。miR長約22個核苷酸，通過與mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合，從而調(diào)控基因表達，發(fā)揮主要作用的是miR5′末端第2～7位的核苷酸[3]。大量研究顯示，miR-126在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[4-7]。高爾基體磷蛋白3(Golgi phosphoprotein 3， GOLPH3)是新近發(fā)現(xiàn)的一種癌基因，定位于反面高爾基體[8]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者外周血中miR-126呈低表達，而GOLPH3的表達與miR-126的表達呈負相關(guān)[9]。但miR-126是否通過GOLPH3調(diào)控胃癌細胞的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移尚不明確。因此，本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式構(gòu)建miR-126沉默及過表達的胃癌細胞株，探討miR-126對胃癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 胃癌細胞株SGC-7901購自中國科學院細胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司(批號：8120394)；特級胎牛血清購自BI公司(批號：04-001-1ACS)。miR-126-mimic/miR-126-mimic-NC(批號：9748-2/LVCON220)及miR-126-inhibitor/miR-126-inhibitor-NC(批號：4783-1/LVCON137)慢病毒由上海吉凱基因公司提供?？俁NA提取試劑TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑、實時熒光PCR試劑及引物均購自大連Takara公司(試劑批號：9108、RR047A、RR820A)。高效RIPA裂解液、蛋白磷酸酶抑制劑混合物、蛋白上樣緩沖液購自索萊寶公司(批號:R0010、P1260、P1015)；GOLPH3單克隆抗體購于Abcam公司(批號：ab98023)；磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)控亞基2(phosphoinositide 3-kinase regulatory subunit 2,PI3KR2)、蛋白激酶B 1(protein kinase B,Akt1)、磷酸化Akt1 (phosphorylated Akt1,p-Akt1)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化mTOR( phosphorylated mTOR,p-mTOR)單克隆抗體均購自于CST公司(批號：ab180967、4691、4060、2983、5536)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單克隆抗體購自Bioworld公司(批號：AP0063)；熒光二抗購自Invitrogen公司(批號：SA5-35571)。細胞計數(shù)試驗-8(cell count kit-8,CCK-8)試劑盒由美侖生物提供(批號：MA0218)。Matrigel matrix購自BD公司(批號：356234)。實驗所用Transwell小室、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶孔板等均購自康寧公司(批號：3395、430167、430639)。

1.2 實驗方法

1.2.1 miR-126過表達及沉默細胞株的構(gòu)建與鑒定：將細胞分為4組進行實驗，包括miR-126過表達組(miR-126-mimic組)、miR-126過表達陰性對照組(miR-126-mimic-NC組)、miR-126沉默組(miR-126-inhibitor組)、miR-126沉默陰性對照組(miR-126-inhibitor-NC組)，每組設置3個復孔。將人胃癌細胞株SGC-7901于5 % CO2、37 ℃溫箱條件下培養(yǎng)至20%～30 %融合度，嚴格按說明書的操作步驟轉(zhuǎn)染相應的慢病毒。轉(zhuǎn)染72 h后觀察熒光達90 %以上視為轉(zhuǎn)染成功，嘌呤霉素藥篩1周，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 實時熒光定量PCR法檢測各組細胞中miR-126、GOLPH3、PI3KR2、Akt1、mTOR的mRNA相對表達水平：用TRIzol試劑提取各組細胞中的總RNA，提取的RNA經(jīng)純度檢測合格后進行反轉(zhuǎn)錄，均按照說明書的步驟進行操作。應用美國ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀，采用SYBR方法進行實時熒光PCR定量擴增，反應體系為20 μL，包括TB Green Premix Ex TaqⅡ 10 μL、 PCR Forward Primer 0.8 μL、PCR Reverse Primer 0.8 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、cDNA 2 μL、RNase Free dH2O 6 μL；反應條件為95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s共40個循環(huán)。均按照試劑盒說明書進行操作。用2-ΔΔCT法計算其相對表達量。實驗重復3次。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 蛋白免疫印跡法檢測各組細胞GOLPH3、PI3KR2、Akt1、p-Akt1、mTOR、p-mTOR的蛋白相對表達水平：采用含有蛋白磷酸酶抑制劑混合物的高效RIPA裂解液裂解細胞，采用NanoDrop One型超微量核酸蛋白濃度分析儀(美國Thermo公司)測定蛋白濃度。將蛋白上樣緩沖液加入裂解得到的蛋白樣品中煮沸備用。采用10 %十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，按每孔總量800μg蛋白進行上樣，80 V恒壓電泳2.5 h。利用聚偏二氟乙烯膜濕法轉(zhuǎn)膜，240 mA恒流轉(zhuǎn)3 h。5 %脫脂牛奶室溫封閉1 h。條帶分別用兔抗人GAPDH(1 ∶10 000)、GOLPH3(1 ∶1 000)、PI3KR2(1 ∶1 000)、 Akt1(1 ∶1 000)、 p-Akt1(1 ∶800)、mTOR(1 ∶1000)、p-mTOR(1 ∶2 000)4℃孵育過夜。次日用熒光二抗(1 ∶20 000)室溫搖床孵育1 h后，應用Odyssey型紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)掃膜顯影。實驗重復3次。

1.2.4 CCK-8法檢測各組細胞增殖能力：取轉(zhuǎn)染成功后處于對數(shù)生長期的各組細胞，胰酶消化后重懸計數(shù)，以每孔3 000個細胞種入96孔板中，于5 % CO2、37 ℃溫箱條件下培養(yǎng)，分別于0 h、24 h、48 h、72 h時間點加入 CCK-8試劑(10 μL/孔)，孵育4 h后，使用Synergy H1型全功能酶標儀檢測450 nm處吸光度(美國伯騰公司)。每組6個復孔，實驗重復3次。

1.2.5 平板克隆實驗：每組設置3個復孔。取轉(zhuǎn)染成功后處于對數(shù)生長期的各組細胞，應用胰酶消化后重懸計數(shù)，以每孔200個細胞種入含5 mL 10 %胎牛血清培養(yǎng)基的6孔板中。5 % CO2、37 ℃溫箱培養(yǎng)約14 d，出現(xiàn)肉眼可見細胞團時終止培養(yǎng)。棄上清后，磷酸緩沖鹽溶液浸洗2遍，4 %多聚甲醛固定15 min，吉姆薩染液染色20 min，清洗晾干后拍照。計數(shù)每個培養(yǎng)孔內(nèi)形成的克隆數(shù)。

1.2.6 劃痕實驗檢測各組細胞愈合能力：用Marker筆在6孔板底部標記，使得每孔有6條線穿過，每孔加入5×105個對數(shù)生長期細胞，于5 % CO2、37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜。第2天采用10 μL槍頭垂直于標記線劃痕；磷酸緩沖鹽溶液輕柔洗滌后加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)基。置于5 % CO2、37 ℃溫箱中培養(yǎng)，分別于0 h、12 h、24 h、48 h、72 h時間點進行拍照分析。愈合率=[(初始劃痕面積—X時后劃痕面積)/初始面積]×100%。每組設置3個復孔。

1.2.7 Transwell實驗檢測各組細胞遷移及侵襲能力：將Matrigel膠與RPMI-1640培養(yǎng)基以1 ∶8的比例混合，吸取90 μL置于上室中，放入37 ℃溫箱孵育1 h使其凝固。取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后以2×105個/mL的濃度重懸于RPMI-1640中，吸取200 μL加入上層小室中。在下室加入600 μL 含10 %胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，放入37 ℃溫箱孵育48 h。取出小室棄上清，磷酸緩沖鹽溶液洗滌2遍，4%多聚甲醛固定30 min，移除甲醛后磷酸緩沖鹽溶液洗滌2遍，結(jié)晶紫染色15 min，用棉簽擦去上室中未穿過的細胞，干燥后顯微鏡下觀察。遷移實驗中，上室不加Matrigel膠，每孔加2×104個細胞，其余步驟同侵襲實驗。以上實驗每組均設置3個復孔。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示,由于為同質(zhì)研究對象接受兩種不同處理，故兩組間比較采用配對t檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-126過表達及沉默細胞株的鑒定 miR-126-mimic及miR-126-inhibitor各組轉(zhuǎn)染效率均達90 %，見圖1。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，miR-126-mimic組miR-126的相對表達水平為(33.170±1.582)，高于miR-126-mimic-NC組的(1.000±0.000)(t=35.217,P=0.001)；miR-126-inhibitor組miR-126的相對表達水平為(0.579±0.119)，低于miR-126-inhibitor-NC組的(1.000±0.000)(t=-6.108,P=0.026)。

圖1 miR-126-mimic組(A)及miR-126-inhibitor組(B)細胞轉(zhuǎn)染情況

2.2 各組SGC-7901細胞的增殖能力的比較 CCK-8實驗顯示，24 h、48 h、72 h時，miR-126-mimic組的吸光度值均低于miR-126-mimic-NC組，而miR-126-inhibitor組的吸光度值高于miR-126-inhibitor-NC組(均P<0.05)，見表2。平板克隆實驗顯示，miR-126-mimic組克隆數(shù)為(47.334±6.110)個，少于miR-126-mimic-NC組的(72.334±3.786)個(t=-7.119,P=0.019);而miR-126-inhibitor組的克隆數(shù)(102.667±5.132)個則多于miR-126-inhibitor-NC組的(62.000±4.583)個(t=7.252,P=0.018)，見圖2。

圖2 4組SGC-7901細胞平板克隆實驗結(jié)果

表2 不同時間點各組細胞的吸光度值的比較(x±s)

2.3 各組SGC-7901細胞的遷移能力的比較 miR-126-mimic組的遷移細胞數(shù)為(709.667±26.633)個，少于miR-126-mimic-NC組的(1 094.667±73.432)個(t=-14.246,P=0.005)；miR-126-inhibitor組的遷移細胞數(shù)為(1251.667±105.557)個，多于miR-126-inhibitor-NC組的(781.000±7.211)個(t=7.229,P=0.019)，見圖3。在12 h時，各組細胞愈合率差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；在24 h、48 h、72 h時，miR-126-mimic組細胞的愈合率均低于miR-126-mimic-NC組，而miR-126-inhibitor組細胞的愈合率則高于miR-126-inhibitor-NC組(均P<0.05)，見表3和圖4。

圖3 4組細胞的遷移能力(×200)

圖4 4組細胞的劃痕實驗結(jié)果

表3 不同時間點各組細胞的愈合率的比較(x±s，%)

2.4 各組SGC-7901細胞的侵襲能力的比較 miR-126-mimic組的穿膜細胞數(shù)為(103.337±8.021)個，少于miR-126-mimic-NC組的(205.667±12.334)個(t=-7.989,P=0.015),而miR-126-inhibitor組的穿膜細胞數(shù)為(175.334±8.505)個，多于miR-126-inhibitor-NC組的(79.334±9.292)個(t=12.359,P=0.006)，見圖5。

圖5 4組細胞的侵襲能力(×200)

2.5 各組SGC-7901細胞中的GOLPH3、PI3KR2、Akt、mTOR的蛋白及mRNA相對表達水平，p-Akt1、p-mTOR的蛋白相對表達水平的比較 miR-126-mimic組GOLPH3、PI3KR2、Akt1、mTOR的蛋白及mRNA相對表達水平，以及p-Akt1、p-mTOR的蛋白相對表達水平均低于miR-126-mimic-NC組，而miR-126-inhibitor 組以上指標均高于miR-126-inhibitor-NC組(均P<0.05)，見表4、表5、圖6。

圖6 4組細胞GOLPH3、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白情況

表4 miR-126-mimic組和miR-126-mimic-NC組相關(guān)指標蛋白和mRNA的相對表達水平的比較(x±s)

續(xù)表4

表5 miR-126-inhibitor組和miR-126-inhibitor-NC組相關(guān)指標蛋白和mRNA的相對表達水平的比較(x±s)

組別nAkt1蛋白mRNAp-Akt1蛋白mTOR蛋白mRNAp-mTOR蛋白miR-126-inhibitor組31.252±0.0861.224±0.1230.478±0.0500.364±0.0461.301±0.0570.356±0.057miR-126-inhibitor-NC組31.044±0.0711.000±0.0000.362±0.0640.240±0.0451.000±0.0000.239±0.037 t值5.9295.4458.74222.0235.2367.270P值0.0270.0010.0130.0020.0010.018

3 討 論

近年來，晚期胃癌治療多采用聯(lián)合化療，但其總中位生存期僅約1年[10]，因此迫切需要尋找新的治療靶點以提高胃癌患者總體生存率。靶向miR的治療手段已逐漸被運用于臨床，其中運用miR-34的模擬物治療癌癥的研究已進入第一階段的臨床試驗[11]。研究表明，miR-126在肝癌、肺癌、宮頸癌等多種腫瘤中發(fā)揮抑制作用[12-14],我們前期研究也顯示胃癌晚期患者血液中miR-126表達明顯降低，提示miR-126可能抑制胃癌的進展[9]。為了進一步驗證miR-126對胃癌的影響，本研究通過構(gòu)建miR-126過表達及沉默胃癌細胞株，發(fā)現(xiàn)過表達miR-126可抑制胃癌細胞的活力和增殖，而抑制miR-126則會明顯增強胃癌細胞的活力與增殖；同時，過表達miR-126可抑制胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制miR-126則會起到相反的作用。

GOLPH3編碼于人類5p13染色體，定位于高爾基體的磷酸化蛋白，可通過蛋白質(zhì)運輸、糖基化等過程影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9，15]。Li等[16]發(fā)現(xiàn)，在食管鱗狀細胞癌中GOLPH3可能為miR-126的潛在靶點。我們前期研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中miR-126的表達與GOLPH3的表達呈負相關(guān)，雙熒光素酶實驗提示miR-126可靶向結(jié)合GOLPH3的3′-UTR；此外，胃癌患者血液中GOLPH3的表達量與其浸潤深度與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，miR-126-mimic組GOLPH3 mRNA及蛋白相對表達水平均低于miR-126-mimic-NC組，提示miR-126可在體外抑制胃癌細胞GOLPH3 mRNA及蛋白水平的表達。由此推測，miR-126可靶向結(jié)合GOLPH3從而影響胃癌的發(fā)展。

PI3K/Akt/mTOR信號通路參與多種生物學過程，是癌癥中最常見的失調(diào)通路之一[17]。Fu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-126可通過調(diào)控PI3KR2/Akt/mTOR通路來降低乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的耐藥性。沉默GOLPH3可抑制mTOR/p-mTOR的表達，并且抑制胃癌細胞的生長，促進其凋亡[19]。本研究結(jié)果提示，增強SGC-7901細胞中miR-126的表達，不僅可降低GOLPH3、mTOR、p-mTOR的表達，PI3K、Akt、p-Akt的表達同樣受到抑制；而抑制SGC-7901細胞中miR-126的表達，則會明顯增強GOLPH3以及PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表達。該結(jié)果表明，miR-126可能通過靶向調(diào)控GOLPH3的表達從而達到調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路的效果。

綜上所述，過表達miR-126可抑制胃癌細胞的活力和增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其可靶向作用于GOLPH3調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路來影響胃癌的發(fā)生與發(fā)展。本研究進一步證實miR-126在胃癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用，并豐富了其下游調(diào)控基因，為靶向miRNA治療胃癌提供了新的理論依據(jù)。