宮秀杰，錢春榮，于 洋，郝玉波，李 梁，姜宇博，呂國一

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 耕作栽培研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

纖維素是世界上最豐富的可再生資源、可被持續(xù)利用的綠色有機質(zhì)資源，在高等植物、細菌、動物和海藻等生物中廣泛存在，每年總量有幾百億噸，具有巨大的經(jīng)濟開發(fā)價值，就我國玉米秸稈纖維素而言，每年資源高達1.32 億t（纖維素按32%計算）[1]。然而，（1）纖維素由D-吡喃葡萄糖環(huán)彼此以β-1,4-糖苷鍵以C1 椅式構(gòu)象聯(lián)結(jié)而成的線形高分子化合物；（2）纖維素由結(jié)晶相和非結(jié)晶相交錯組成，其中結(jié)晶相纖維素中大量的羥基基團，產(chǎn)生數(shù)目龐大的氫鍵，這些氫鍵構(gòu)成巨大的氫鍵網(wǎng)格，直接導(dǎo)致了致密的晶體結(jié)構(gòu)的形成[2]；（3）纖維素聚合度非常大，約2 000 到15 000 以上，當(dāng)大量游離羥基形成氫鍵時，氫鍵力非常大，它們使纖維素片之間的距離保持在很小的范圍。綜上所述，纖維素復(fù)雜的結(jié)構(gòu)、致密的晶體和穩(wěn)定的氫鍵以及與蛋白質(zhì)、半纖維素、木質(zhì)素和礦物質(zhì)元素等緊密結(jié)合在一起而難以降解[3]。

目前，纖維素降解包括物理方法（如機械粉碎[4]、超聲波處理[5]）、化學(xué)方法（如酸或堿處理[6]）、物理化學(xué)法（如蒸汽爆破法[7]）、生物法（如青霉菌[8]、木霉菌[9]、芽孢桿菌[10]和鏈霉菌[11]等）和聯(lián)合處理法[12]。（1）物理方法，主要是通過破壞結(jié)構(gòu)，減少結(jié)晶區(qū)，增加木質(zhì)纖維素比表面積，優(yōu)點是操作簡單，對環(huán)境污染較小；缺點是需要較高的能量和動力，增加成本[13]。（2）化學(xué)方法，主要是通過木質(zhì)素溶于堿性溶液或酸性物質(zhì)為催化劑使半纖維素水解[14]，促進木質(zhì)素中部分官能團、纖維素的氫鍵和糖苷鍵以及木質(zhì)素與纖維素、半纖維之間的連接鍵的斷裂，使包裹在木質(zhì)素中的纖維素更好地釋放出來被溶脹降解，并破壞其晶體結(jié)構(gòu)[15]。優(yōu)點是降解效果相對較好；缺點是預(yù)處理后期容易產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物，極易造成環(huán)境污染[16]。（3）生物法，主要是通過微生物在侵入到受體內(nèi)部時，導(dǎo)致木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)受到了不同程度的破壞，能夠有效地加速其分解[17]。優(yōu)點是分解纖維素具有反應(yīng)溫和、過程綠色和成本較低等[18]；缺點是目前纖維素降解菌分解纖維素物質(zhì)的效果不佳，纖維素降解菌產(chǎn)酶量相對較少，不能滿足人類對高效纖維素酶菌種的要求。目前已經(jīng)分離到可降解木質(zhì)纖維素的細菌、真菌和放線菌200 余種[19]。由于菌種退化及產(chǎn)纖維素酶量低等問題，不能滿足人類對高效降解纖維素菌種的需求，因此繼續(xù)從自然界篩選纖維素酶高產(chǎn)菌株依然是一項重要而有意義的工作。

1 真菌

大多纖維素降解真菌在生長過程中能產(chǎn)生菌絲，菌絲具有很強的穿透能力，能穿透植物角質(zhì)層的阻礙，緊緊依附和穿插在纖維物質(zhì)上，增大降解酶與纖維物質(zhì)的接觸面積，從而加快降解速率[20]。優(yōu)點是，真菌多為耐酸菌，在酸性條件下分泌的纖維素酶較多，且為胞外酶，容易從培養(yǎng)基中分離并純化酶液。缺點是，在堿性、缺氧或高溫條件下，酶活力下降或失活。據(jù)報道，篩選纖維素降解酶菌株多數(shù)為木霉屬、青霉屬和曲霉屬。

1.1 木霉屬（Trichoderma）

利用纖維素酶高產(chǎn)的木霉降解木質(zhì)纖維素是實現(xiàn)秸稈等肥料資源化的重要手段，是目前報道較多的能夠高效降解木質(zhì)纖維素的絲狀真菌之一，包括里氏木霉（trichoderma reesei）、綠色木霉（Trichoderma viride）等。劉起麗等[21]篩選到的擬康寧木霉（Trichoderma atroviride）MC-1 在培養(yǎng)48 h 后CMC 酶活為96.31 U/g，濾紙酶活為8.68 U/g，在秸稈處理45 d 后失重率達到了46.84%。李蕾等[22]對綠色木霉（Trichoderma viride）X-57 進行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，結(jié)果表明稻草和麩皮添加量為2%，接種量為6%，搖床轉(zhuǎn)速175 r/min，培養(yǎng)4d后CMC 酶和FP 酶活分別為1 677.53 U/mL 和282.69 U/mL。郭建華等[23]篩選到的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）TC10-13 菌株產(chǎn)纖維素酶的最佳初始pH 值為5.0，最佳碳源為秸稈，溫度28℃，菌株的CMC酶和FP 酶活分別為15.97 U/mL 和6.38 U/mL，且研究證實哈茨木霉不僅可以產(chǎn)纖維素酶，還可以通過分泌的酶類物質(zhì)水解病原菌的細胞壁，從而對病菌有較好防治效果。另外，黃亞麗等[24]篩選的長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）SDF-31 菌株能夠在低溫下快速繁殖和代謝，具有較強的秸稈降解能力，在大田試驗條件下用該菌株，45 d 玉米秸稈降解率為56.73%。總結(jié)如表1。

表1 近年木霉屬降解纖維素菌種

1.2 青霉屬（Penicillium）

青霉屬是產(chǎn)纖維素酶的常見菌株，廣泛存在于環(huán)境、哺乳動物和昆蟲腸道內(nèi)，能夠降解纖維素等復(fù)雜大分子物質(zhì)，在酶系降解性能、菌株生長速度等方面與木霉屬相比具有一定優(yōu)勢[27]，可以分泌種類多樣、組分齊全的木質(zhì)纖維素降解酶系[8]。孟建宇等[28]在大興安嶺森林土壤中篩選到草酸青霉（Penicilliumoxalicum）W14，在以酵母膏為碳源、培養(yǎng)基初始pH 值6.0、培養(yǎng)溫度35℃和培養(yǎng)時間4 d 的最佳產(chǎn)酶條件下，CMC 酶活為103.89 U/mL。江宇航等[29]從松毛蟲腸道中篩選到桔青霉（Penicillium citrinum）7-100-8菌株，在pH 值為7 時，CMC 酶活力712.81 U/mL，并證實了中性為羧甲基纖維素酶活性發(fā)揮的最佳酸堿度。還有研究報道表明，篩選到的部分青霉菌株在低溫、重金屬修復(fù)和促生方面都有一定的研究潛力，鄭國香等[30]篩選到奧爾森青霉（Penicillium olsonii）L-11 以麩皮和豆粉為底物、初始pH 值5.23，CMC 酶活48.809 IU/mL，在低溫下菌株L-11 也具有較強的纖維素降解能力。張冬雪等[31]篩選的草酸青霉（Penicillium oxalicum）WAF6 菌株最高水稻降解率為45.72%，且能夠有效降低土壤中有效鎘含量，該菌株在秸稈降解與重金屬污染修復(fù)方面具有一定的開發(fā)潛力。董振寰等[32]篩選的產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）CZF55 具有纖維素降解能力和促生、拮抗功能的優(yōu)良真菌，具有良好的應(yīng)用價值?？偨Y(jié)如表2。

表2 近年青霉屬降解纖維素菌種

1.3 曲霉屬（Aspergillus）

曲霉屬（Aspergillus）因其能分泌多種木質(zhì)纖維素降解酶而備受關(guān)注，Bansal N 等[36]以麥麩為底物，黑曲霉（Aspergillus niger）NS-2 的CMC 酶和FP 酶產(chǎn)量分別為310 U/g 和17 U/g，溫度范圍在20～50℃、pH 值范圍在3.0～8.0 下亦可產(chǎn)生可觀水平的纖維素酶。Liu D 等[37]分離鑒定的煙曲霉（Aspergillus fumigatus）Z5 在溫度50℃、pH 值4.0，初始接種量為7%時，F(xiàn)P 酶活性為144.6 U/g。寧振興等[38]篩選到的塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）GYC501 菌株，培養(yǎng)36 h 后，CMC 酶活418.2 U/mL，發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生特殊香氣。劉可等[39]在包頭玉米地篩選到的15 號煙曲霉（Aspergillus fumigatus）可以在溫度50℃、相對濕度70%的條件下加快秸稈降解。金偉等[40]篩選耐熱性及耐酸性較好的煙曲霉Aspergillus fumigatusXT3 最適起始pH 值為4.0，最佳產(chǎn)CMC 酶和FP 酶的溫度分別為80、70℃，產(chǎn)生的嗜熱纖維素酶具有深入研究價值?？偨Y(jié)如表3。

表3 近年曲霉屬降解纖維素菌種

2 細菌

降解纖維素細菌可分為厭氧型、好氧型和好氧滑動菌。厭氧細菌將3 種纖維素酶聯(lián)合組裝成一個大復(fù)合體-纖維小體[46]，纖維小體附著在細菌細胞表面，被細菌吸附的纖維素因受到細菌直接的物理或化學(xué)作用而易于膨脹、被破壞，進而分解整個纖維素結(jié)構(gòu)[47]。優(yōu)點是部分細菌在低氧、堿性及中性條件下，能分泌高活性纖維素酶，且細菌具有繁殖周期短、結(jié)構(gòu)簡單、抗逆性強和耐酸堿等[48]；缺點是分泌纖維素酶一般為胞內(nèi)酶，較少胞外酶，提純費用高。

2.1 芽孢桿菌屬

目前，纖維素降解所涉及的芽孢桿菌種類主要有枯草芽孢桿菌[49-50]、短小芽孢桿菌[51-52]、暹羅芽孢桿菌[53]和嗜熱芽孢桿菌[51]等。景如賢等[54]從常年落葉土壤中篩選到菌株芽孢桿菌屬（Bacillus）D2，該菌株以3%的接種比例、pH 值為7.0、溫度37℃和轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)3 d 后得到最高酶活，CMC 酶活為1.456 U/mL。高雙喜等[53]分離的暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）H-7，CMC 酶活最高為0.18 U/mL，F(xiàn)P酶活最高為0.44 U/mL，降解的濾紙條在第3 d 接近糊狀。陳龍等[49]篩選得到的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilies）Lu14 的CMC 酶活力和FP 酶活力分別為1.106 U/mL 和0.76 U/mL。張立靜等[52]篩選出一株具有良好纖維素降解性能的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）T-7，當(dāng)降解體系中添加2%蔗糖＋2%尿素時，第8 d 的纖維素降解率達到40.34%。產(chǎn)芽孢細菌因芽孢的形成在耐酸、耐堿、耐高溫等方面有明顯的優(yōu)勢[55]，Hegazy 等[50]從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilies）BTN7A 菌株中克隆了內(nèi)切β-1,3-1,4-葡聚糖酶（bgls）基因，構(gòu)建新菌株，該菌株在37℃和55℃下分別產(chǎn)生約29%和57%的CMC 酶比活力。江高飛等[51]以水稻秸稈為唯一碳源，篩選到的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）B-7 和嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus Thermophilus）B-11，分別在55～65℃和75～80℃高溫下活性較高，且纖維素降解率下降不明顯，產(chǎn)酶穩(wěn)定性相對較高。還有研究表明，芽孢桿菌屬具有防病及促生特性，目前研究者[56]已分離篩選獲得纖維降解芽孢桿菌菌株BS11 和BS12 具備了催芽、促生及拮抗病原菌活性，如應(yīng)用于飼料加工或秸稈還田，既可以降低植物病害發(fā)生，又可以提高飼料的衛(wèi)生品質(zhì)，降解纖維素獲得生物菌肥具有一定的應(yīng)用潛力。陶樹興等[57]篩選兼顧固氮能力與纖維素降解能力的芽孢桿菌（Bacillus）CX21，在大田環(huán)境中，作物秸稈含有大量纖維素，在加速降解纖維素同時有效提高固氮能力，利用纖維素的固氮芽孢桿菌具有更強的競爭適應(yīng)優(yōu)勢?？偨Y(jié)如表4。

表4 近年芽孢桿菌屬降解纖維素菌種

2.2 其它菌屬

目前，已報道的能夠耐高溫或耐酸性的降解纖維素菌株還有節(jié)桿菌屬（Arthrobacter oryzae）、伯氏短桿菌（Brevibacillus borstelensis）和固氮螺菌（Azospirillum zeae）等。萬文結(jié)等[58]采用纖維素平板水解圈法篩選到一株具有較強的纖維素分解能力的節(jié)桿菌屬Arthrobacter oryzaeHW-17，最佳產(chǎn)CMC酶溫度為30～35℃，pH值為7，但在中高溫（≤50℃）和偏酸性pH值5～7條件下能夠保持較高的酶活。李建樹等[59]從牛糞中篩選到的高溫高效纖維素降解菌株X-1，鑒定為伯氏短桿菌Brevibacillus borstelensis，對濾紙的降解效果最好，7 d降解率為16.37%，在50℃條件下纖維素降解能力較強。吳婧等[60]從土壤中篩選到兼具秸稈降解和植物促生能力的菌株n3，鑒定為玉米固氮螺菌Azospirillum zeae，產(chǎn)酶最適pH值為5.0，CMC酶活力最高，為24.96 U/mL，pH值為6.0時IAA分泌量最大，可達20.15 mg/L，屬于酸性促生降解纖維素菌株。

3 放線菌

放線菌繁殖緩慢且不及真菌和細菌對纖維素降解能力強，使放線菌在纖維素降解方面的研究還比較少。但由于放線菌相對于細菌和真菌來說適應(yīng)性更強，生長pH 值、溫度范圍更廣，能分解多種底物，分泌的胞外酶多數(shù)具有一定的耐堿性、耐高溫或耐低溫等極端環(huán)境，用放線菌產(chǎn)生纖維素酶的優(yōu)勢正在引起更多研究者的關(guān)注。其降解機制主要是放線菌可以比較容易的穿透秸稈纖維等不溶基質(zhì)，在中、堿性環(huán)境中增加秸稈的水溶性，促進秸稈快速降解[61]。

3.1 鏈霉菌屬（Streptomyces）

鏈霉菌廣泛分布于自然環(huán)境，是土壤中的優(yōu)勢放線菌群，Mason 等[62]研究表明放線菌在其周圍環(huán)境中分泌一系列參與植物木質(zhì)纖維素的生物降解酶，能夠降解作物秸稈等可溶的木質(zhì)碳水化合物，Abdulla 等[63]從土壤中分離到42 株纖維素分解放線菌，其中26 株是鏈霉菌屬，部分菌株的水稻秸稈降解率達到50%～61%，且對水稻稻瘟病菌有極顯著的降解效果。近年來，鏈霉菌屬放線菌研究報道頗多，菌株26[64]、WZ16[65]和Z2[66]等其產(chǎn)酶最適反應(yīng)溫度為28℃左右，最適pH 值為7.0，產(chǎn)常溫中性纖維素酶；菌株B5[67]、HLF4[68]和NF38[69]等，最適產(chǎn)酶溫度為30～35℃，最適pH 值為7.0 左右，可以產(chǎn)中溫中性纖維素酶。也有報道研究表明，鏈霉菌在高溫和耐堿或耐酸條件下適應(yīng)性比較強，姚健等[70]篩選的鏈霉（Streptomyces sp.）菌株ZJ-1 最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH 值為6.0，木聚糖酶的活性40.0 U/mL。付曉微[71]篩選到一株產(chǎn)耐高溫纖維素酶放線菌菌株B-172-A-5，為深紅紫鏈霉菌Streptomyces violaceorubidus，在50℃條件下酶活力最高，CMC 酶活為289 U/mL，濾紙酶活為281 U/mL，β-葡萄糖苷酶活為 271 U/mL。曹慧等[72]篩選到一株釘斑鏈霉菌Streptomyces claviferLD-19，在30～70℃、pH 值4～10 產(chǎn)酶活力較穩(wěn)定，可以同時分泌低溫纖維素酶和半纖維素酶，在飼用酶制劑方面有較大潛力。冷艷等[73]分離篩選到的鏈霉菌屬Streptomyces sp.Tibet-YD4524-3 菌種，最適產(chǎn)酶pH 值為8.5，CMC 酶活177.4 U/mL。邵娜娜等[74]篩選到一株低溫纖維素鏈霉菌ND2-1，能夠在18℃高效崩解濾紙，在4～35℃條件下酶活有很好的穩(wěn)定性，在所產(chǎn)纖維素酶在pH值3～9 穩(wěn)定性和活性都較好。研究者篩選到的部分放線菌具有較廣泛的溫度和酸堿環(huán)境普適性，這也是研究和開發(fā)纖維素放線菌的重要意義。總結(jié)如表5。

表5 近年鏈霉屬降解纖維素菌種

4 結(jié)論與展望

目前微生物所產(chǎn)生的纖維素酶大部分都不同程度地存在酶系不完全、活性不高、酶作用條件苛刻等問題。因此，選育優(yōu)良的高產(chǎn)纖維素酶活性的菌株，提高降解纖維素的效率仍然是當(dāng)前和今后纖維素酶研究的主要方向。本文對近年篩選到的47 個菌株進行了統(tǒng)計，高溫菌株（≥50℃）10 份，分別為真菌菌株Z5、XT3、15 號和LY1，細菌菌株Lu14、BTN7A、B-7 和B-11，放線菌菌株B-172-A-5 和ZJ-1，最高溫度可達80℃條件下，酶活有很好的穩(wěn)定性；耐酸菌株（pH 值≤7）10 份，分別為真菌菌株TC10-13、L-11、W14、XT3 和QL06，細菌菌株Lu14、HW-17 和n3，放線菌菌株ZJ-1 和LD19，pH 值最小可達4.0，所產(chǎn)纖維素酶有較好的穩(wěn)定性和活性；耐堿菌株2 份，Tibet-YD4524-3 和ND2-1 均是防線菌株，pH 值最高可達到9 時，所產(chǎn)纖維素酶具有較好活性；低溫菌株2 份，分別來自放線菌的ND2-1 和真菌SDF-31，能夠在16～18℃條件下高效產(chǎn)纖維素降解酶。據(jù)報道，酶活最高的來自真菌菌株X-57 和放線菌菌株B5，菌株X-57 的CMC 酶活最高1 677.53 U/mL、菌株B5 的CMC 酶活力最高可達1 466 U/mL。

綜上可以可見，近年來研究者不斷的篩選纖維素降解菌株，優(yōu)點是菌株選育在向多功能方向發(fā)展，菌株產(chǎn)生堿性和酸性、低溫和高溫纖維素酶得到廣泛重視，這些菌種在耐酸、耐堿、耐低溫和耐高溫方面有可能有明顯的優(yōu)勢。缺點是這些菌株更多的研究是停留在實驗階段，少有中試或生產(chǎn)驗證，投入大規(guī)模生產(chǎn)的更是少之又少。主要原因是所選育出來的一些菌種雖具有一定的產(chǎn)酶能力，但是應(yīng)用于生產(chǎn)還不是很理想，探索更理想的方法去不斷選育或誘變纖維素酶高產(chǎn)菌株是以后應(yīng)該解決的關(guān)鍵問題。因此，在研究者們不斷的篩選、尋找新的高效降解菌株、擴充纖維素降解菌基因庫的同時，要根據(jù)研究目的不斷的馴化、理化誘變和遺傳改造纖維素降解菌株，探索更理想的方法去不斷選育或誘變纖維素酶高產(chǎn)菌株，并設(shè)法提高菌株的穩(wěn)定性、減少菌株退化等，使其得到生產(chǎn)驗證并轉(zhuǎn)化為成果，從而促進纖維素產(chǎn)業(yè)發(fā)展。