廖博文，黃軼敏，譚玉靜，蔣德明，常忠義，鄒春靜，高紅亮*

（1.華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241；2.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233）

細(xì)菌纖維素是由微生物利用D-葡萄糖以β-1,4 糖苷鍵連接而成的納米級(jí)高分子化合物[1]。不同于植物纖維素，細(xì)菌纖維素不含有木質(zhì)素、半木質(zhì)素、半纖維素等雜質(zhì)[2]，具有純度高、吸水和保水性高、較高的生物適應(yīng)性和良好的生物可降解性等優(yōu)良性質(zhì)，目前已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、造紙等領(lǐng)域[3-5]。

細(xì)菌纖維素可由醋酸桿菌屬（Acetobacter）、駒形氏桿菌屬（Komagataeibacter）、八疊球菌屬（Sporosarcina）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）、固氮菌屬（Azotobacter）等菌屬產(chǎn)生[6-7]。Brown 最早報(bào)道細(xì)菌纖維素由木醋桿菌（Acetobacter xylinum）產(chǎn)生[1]，現(xiàn)在也被稱為木糖駒形氏桿菌（Komagataeibacter xylinus），是研究最為透徹、應(yīng)用范圍最廣的產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌株。該菌種名稱經(jīng)過了幾次變化，1983 年Yamada 等將醋化醋酸桿菌木醋桿菌亞種（A.acetisubsp.xylinus）提升為木醋桿菌（A.xylinus）[8]，1985 年Yamada 等又將醋酸桿菌屬中輔酶Q-10 型歸入醋酸桿菌屬葡糖酸醋酸桿菌亞屬（Acetobactersubgen.Gluconoacetobacter）[9]，之后1997 年又提升為葡糖酸醋酸桿菌屬（Gluconoacetobacter）[10]，Yamada 等在2012 年將葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter）的12 個(gè)種組成新的駒形桿菌屬（Komagataeibacter）[11]，因此Gluconoacetobacter xylinus也相應(yīng)更名為Komagataeibacter xylinus。

細(xì)菌纖維素的發(fā)酵方式主要是靜態(tài)發(fā)酵和動(dòng)態(tài)發(fā)酵[12]。靜態(tài)發(fā)酵是目前應(yīng)用最為廣泛的發(fā)酵方式，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量高，質(zhì)地均勻，但是發(fā)酵周期較長，一般為7～14 天[13]。趙航等通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基成分使用葡糖醋桿菌J2-1 發(fā)酵后產(chǎn)量達(dá)到9.34 g/L，賀曉凌通過響應(yīng)面方法優(yōu)化培養(yǎng)基成分后產(chǎn)量可達(dá)6.74 g/L[14]。動(dòng)態(tài)發(fā)酵周期較短，一般為3～5 天，動(dòng)態(tài)發(fā)酵可以獲得持水度更高，表面積更大的細(xì)菌纖維素，在生物分離、藥物釋放載體及固定化方面有更獨(dú)特的應(yīng)用場景[15]，但是細(xì)菌纖維素產(chǎn)量低和菌株不穩(wěn)定是動(dòng)態(tài)發(fā)酵無法產(chǎn)業(yè)化的根本原因。目前國內(nèi)對細(xì)菌纖維素動(dòng)態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的研究較少，還沒有將細(xì)菌纖維素動(dòng)態(tài)發(fā)酵投入工業(yè)化生產(chǎn)的案例，從自然界中篩選適合動(dòng)態(tài)發(fā)酵的高產(chǎn)菌株和優(yōu)化培養(yǎng)基是提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的主要策略之一。趙浩杰等使用響應(yīng)面法優(yōu)化動(dòng)態(tài)發(fā)酵細(xì)菌纖維素菌株HS01 培養(yǎng)基，優(yōu)化后細(xì)菌纖維素產(chǎn)量達(dá)到了5.02 g/L，是優(yōu)化前的2.3 倍[16]。Lu 等從腐爛水果中篩選得到一株產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌株，動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量較高，可利用廢甘油生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，有良好的應(yīng)用前景[17]。

本研究以腐爛的水果為材料，從中篩選出一株適合動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素的高產(chǎn)菌株木糖駒形氏桿菌P1-1，對該菌株動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)的細(xì)菌纖維素進(jìn)行性質(zhì)測定，然后對該菌株搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行探究，以提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，為細(xì)菌纖維素投入工業(yè)化生產(chǎn)及后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌種

木糖駒形氏桿菌（Komagataeibacter xylinus）P1-1 菌株，由華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、甘油、果糖、麥芽糖、蔗糖、檸檬酸、乙酸、NH4Cl、(NH4)2HPO4、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶購自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；納他霉素、胰蛋白胨、大豆蛋白胨和牛肉膏購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；熒光增白劑28 購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；酵母粉FP802 和蛋白胨FP326，購自安琪酵母股份有限公司；生理生化試劑盒購自青島海博生物技術(shù)有限公司；DNA 提取試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基為：葡萄糖20 g/L，酵母粉FP802 5 g/L，蛋白胨FP326 5 g/L，Na2HPO42.7 g/L，檸檬酸1.15 g/L，培養(yǎng)基初始pH 為6.0；平板培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入18 g/L 的瓊脂；富集培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入30 mL/L 無水乙醇和30 mg/L 的納他霉素；篩選平板培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入0.2 g/L 熒光增白劑28，30 mg/L 的納他霉素和18 g/L 瓊脂；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖50 g/L，蛋白胨FP326 5 g/L，酵母粉FP802 9 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 20 g/L，培養(yǎng)基初始pH 為6.0。

1.1.4 主要儀器

冷凍離心機(jī)（sigma2-16KL）和電子天平（QUintix 型，精密度0.1 mg）均為賽多利斯公司產(chǎn)品；日立離心機(jī)SZ-CR21N 型為日立公司產(chǎn)品；全溫恒溫培養(yǎng)搖床HZQ-QX 型為哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；電泳凝膠成像分體系統(tǒng)Tanon3500 型為上海天能科技有限公司產(chǎn)品；電泳儀DYY-6C 型為北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌種篩選方法

1.2.1.1 菌種富集

切取櫻桃、油桃、蘋果、芒果、橘子和柿子等水果腐爛組織至裝有10 mL 富集培養(yǎng)基的小試管中，30℃靜止培養(yǎng)5 d。挑選出產(chǎn)細(xì)菌纖維素膜的試管，把膜用無菌生理鹽水水洗三次后，剪碎浸泡在10 mL 富集培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)液渦旋均勻后，用生理鹽水稀釋涂布到篩選培養(yǎng)基平板中，30℃培養(yǎng)5～7 d。

1.2.1.2 挑取單菌落發(fā)酵

平板在365 nm 紫外燈照射下挑取有熒光的單菌落。根據(jù)水果種類和菌落形態(tài)對單菌落進(jìn)行分類，每種類型至少挑取5 個(gè)單菌落，接入到含有2 mL 富集培養(yǎng)基的小試管中，30℃培養(yǎng)5 d。

1.2.1.3 菌種保藏

將小試管中菌液接種至30 mL 種子培養(yǎng)基30℃ 160 r/min 培養(yǎng)24 h 后，取500 μL 活化后菌液與500 μL含有40%甘油的無菌水混勻后－80℃冷凍保藏。

1.2.1.4 菌株初篩

挑取2 環(huán)平板菌苔接入裝有50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，30℃，200 r/min 搖床發(fā)酵96 h。發(fā)酵完成后加蒸餾水?dāng)噭蚝? 000 r/min 離心5 min，去除上清液，重復(fù)上述步驟再水洗一次。將得到的細(xì)菌纖維素在60℃烘箱中烘干至恒重，最后測定其干重即為初篩產(chǎn)量。根據(jù)初篩產(chǎn)量篩選高產(chǎn)菌株。

1.2.1.5 菌種生理生化鑒定

對木糖駒形氏桿菌P1-1 菌株按照青島海博生物技術(shù)有限公司生理生化試劑盒操作說明進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，并根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》鑒定。

1.2.1.6 菌種16S rDNA 鑒定

將冷凍保藏的菌種甘油管接入30 mL 種子培養(yǎng)基，30℃ 160 r/min 培養(yǎng)20 h 后劃線至平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3 d 至其長出菌落。將單菌落進(jìn)行活化后，接種至添加纖維素酶（6.7%,≥45 units/mg）的種子培養(yǎng)基中，30℃ 160 r/min 培養(yǎng)24 h 后使用DNA 提取試劑盒提取DNA，并進(jìn)行其純度濃度檢測，采用細(xì)菌16S rDNA 通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’)和1492R (5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性10 min，94℃變性40 s，54℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min，產(chǎn)物于4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序，并使用軟件C Express將所得16S rDNA 序列校正、正反向拼接。拼接后序列經(jīng)National center for Biotechnology Information（NCBI）數(shù)據(jù)庫BLAST 對比分析，下載同源性最高的前10 株模式菌株序列作為參照菌株，使用軟件MEGA7.0 分析序列特征并構(gòu)建Neighbor-Joining 進(jìn)化樹。

1.2.2 動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.2.1 搖瓶發(fā)酵

挑取2 環(huán)平板菌苔接入裝有30 mL 種子培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，30℃靜止培養(yǎng)30 h 后，去除培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素薄膜，對菌液用脫脂棉過濾后，以8%接種量將種子液接入裝有50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，30℃，200 r/min 發(fā)酵96 h。

1.2.2.2 細(xì)菌纖維素產(chǎn)量測定方法

含有纖維素的50 mL 發(fā)酵液加入100 mL 蒸餾水?dāng)噭蚝? 000 r/min 離心5 min，沉淀物繼續(xù)加100 mL蒸餾水水洗去除雜質(zhì)，并重復(fù)一次；然后加入100 mL0.4%氫氧化鈉在沸水中堿煮1 h，8 000 r/min 離心8 min去除堿液，加入100 mL1.0%乙酸進(jìn)行中和10 min 后，離心水洗至中性。將得到的細(xì)菌纖維素在60℃烘箱中烘干至恒重，最后測定其干重并計(jì)算每升發(fā)酵液產(chǎn)量[18]。

1.2.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1）碳源

選取蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、甘油、乳糖、麥芽糖共7 種碳源按照50 g/L 的添加量添加到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵96 h 后測定細(xì)菌纖維素產(chǎn)量。

2）氮源

對基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的含氮量進(jìn)行換算后，選取魚粉蛋白胨、胰蛋白胨、安琪蛋白胨FP326、FP410、安琪酵母浸粉FM802、FM902、FM803、玉米漿共8 種單一氮源，在保持培養(yǎng)基的氮含量為1.625 g/L 的條件下添加到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵96 h 后測定細(xì)菌纖維素產(chǎn)量。

3）乙酸

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入濃度為0、1、2、3、4、5 mL/L 的乙酸，發(fā)酵96 h 后測定細(xì)菌纖維素產(chǎn)量。

4）乙醇

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入濃度為0、10、15、20、30、40 mL/L 的乙酸，發(fā)酵96 h 后測定細(xì)菌纖維素產(chǎn)量。

1.2.2.4 正交實(shí)驗(yàn)

通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定對木糖駒形氏桿菌產(chǎn)細(xì)菌纖維素影響較顯著的3 個(gè)因素分別為葡萄糖、安琪蛋白胨FP410 及乙酸，選取該3 個(gè)因素作為正交實(shí)驗(yàn)因子，以最適宜條件作為參考設(shè)置3 個(gè)水平，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.3 性質(zhì)分析

1.3.1 掃描電子顯微鏡

將純化的細(xì)菌纖維素進(jìn)行冷凍干燥，然后將干燥好的細(xì)菌纖維素樣品使用離子濺射鍍膜儀在樣品表面噴鉑金，在冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡3.0 kV，放大倍數(shù)10.0 k 條件下進(jìn)行細(xì)菌纖維素表面形態(tài)觀察[19]。

1.3.2 紅外光譜

將干燥的細(xì)菌纖維素樣品使用紅外光譜掃描儀對樣品進(jìn)行波長為4 000～500 cm-1的掃描[19]。

1.3.3 熱失重分析

將干燥的細(xì)菌纖維素樣品磨碎成直徑小于0.2 μm 的粉末，取3～5 mg 樣品粉末加入熱重分析儀中檢測樣品的熱穩(wěn)定性，溫度檢測范圍為30～600℃，升溫速度為10℃/min，N2通氣流量為50 mL/min，記錄隨著溫度升高細(xì)菌纖維素質(zhì)量的變化[19]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)至少有3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，并以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照組進(jìn)行發(fā)酵。使用Origin 2018、SPSS 23.0進(jìn)行圖形繪制及結(jié)果分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 菌種篩選及鑒定

2.1.1 篩選菌種菌落形態(tài)及初篩產(chǎn)量

實(shí)驗(yàn)以櫻桃、油桃、蘋果、芒果、橘子和柿子等6 種腐爛的水果為材料，共篩選出42 種產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌種，并分別觀察記錄其菌落形態(tài)。通過對菌落形態(tài)分析，選出了20 種菌落形態(tài)差異較大的菌株，按照“1.2.1.4”方法動(dòng)態(tài)發(fā)酵并測定細(xì)菌纖維素產(chǎn)量（見表2）。

表2 細(xì)菌纖維素菌株篩選情況統(tǒng)計(jì)

從表2 可以看出，從櫻桃等6 種水果的腐爛組織中，均篩選出來能夠產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌株，其中從柿子中初篩的菌株P(guān)1-1，動(dòng)態(tài)發(fā)酵初篩產(chǎn)量為4.71 g/L，遠(yuǎn)高于其他菌株。

2.1.2 P1-1 菌株16S rDNA 鑒定及生理生化特征

生理生化鑒定結(jié)果見表3。該菌株能夠利用甘油代謝產(chǎn)生酮類物質(zhì)，體內(nèi)存在乙醇氧化酶，不能液化明膠，具有耐酸、耐高糖的優(yōu)良特性，具體表現(xiàn)為可在pH 值為4.5、含0.35%乙酸、含30% D-葡萄糖的環(huán)境種生長。該菌株的生長條件簡單，碳源利用廣泛，可以利用除阿拉伯糖、鼠李糖外的絕大多數(shù)碳源，如葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖生長。據(jù)上述生理生化特征，查閱《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[20]，確定為駒形氏桿菌屬。對菌株P(guān)1-1 進(jìn)行16S rDNA 鑒定，由圖1 可知，菌株P(guān)1-1 與Komagataeibacter xyliusATCC53524 同源性最高，鑒定為木糖駒形氏桿菌（Komagataeibacter xylinus）。與已經(jīng)報(bào)道的自然篩選的木糖駒形氏桿菌（含木醋桿菌或木葡糖酸醋桿菌）的動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量相比（表4），菌株P(guān)1-1 有一定的優(yōu)勢。

圖1 P1-1 菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

表3 P1-1 菌株生理生化結(jié)果

表4 不同木糖駒形氏桿菌細(xì)菌纖維素產(chǎn)量比較

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定

2.2.1 掃描電鏡觀察

菌株P(guān)1-1 動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素電鏡圖片如圖2 所示，纖維絲緊密交錯(cuò)且纖維絲粗細(xì)存在明顯不均勻情況，纖維絲直徑為納米級(jí)，經(jīng)過分析計(jì)算，該菌株所產(chǎn)的細(xì)菌纖維素纖維直徑為27.25±11.86 nm。Gao等報(bào)道三個(gè)Komagataeibacter xylinus菌株動(dòng)態(tài)和靜態(tài)發(fā)酵纖維素直徑為20～40 nm 之間[18]，Lu 等發(fā)現(xiàn)Komagataeibactersp.nov.CGMCC17276 菌株動(dòng)態(tài)發(fā)酵纖維素直徑為22.63±5.52 nm[17]，周伶俐報(bào)道靜態(tài)和動(dòng)態(tài)三角瓶發(fā)酵的纖維素直徑約為10～80 nm[29]，這與本論文結(jié)果接近。另外，卞玉榮也報(bào)道木醋桿菌動(dòng)態(tài)或靜態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)生的纖維素平均直徑為50 nm[30]。

圖2 P1-1 動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素掃描電鏡圖（a）及粒徑分析圖（b）

2.2.2 紅外光譜分析

對菌株P(guān)1-1 動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素進(jìn)行紅外光譜分析，如圖3 所示，可觀察到纖維素的典型吸收峰。3343 cm-1處為分子內(nèi)氫鍵的伸縮振動(dòng)峰[31]，2917 cm-1為C-H 伸縮振動(dòng)吸收峰[32]，1110 cm-1和1055 cm-1是由C-O 伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，與文獻(xiàn)報(bào)道的純細(xì)菌纖維素的紅外光譜結(jié)果基本一致[33-34]。

圖3 P1-1 動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素紅外光譜圖

2.2.3 熱重分析

如圖4 所示，菌株P(guān)1-1 動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)的細(xì)菌纖維素的重量的損失主要有三個(gè)階段，第一階段質(zhì)量損失發(fā)生在100℃附近，損失量為4.46%，主要失去的是細(xì)菌纖維素表面的一些結(jié)合水；第二階段質(zhì)量損失發(fā)生在250℃附近，損失量為34.38%，與文獻(xiàn)中報(bào)道第二階段在240℃有最大的失重基本一致[35]；第三階段質(zhì)量損失發(fā)生在430℃附近，損失量為15.16%，細(xì)菌纖維素繼續(xù)被分解。熱重分析表明該菌株所產(chǎn)的細(xì)菌纖維素最大的失重溫度在250℃，具有耐高溫的性質(zhì)。

圖4 P1-1 動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素?zé)嶂胤治鰣D

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 不同碳源對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

碳源是微生物發(fā)酵的主要供能物質(zhì)，也是細(xì)菌纖維素合成的基礎(chǔ)營養(yǎng)。本文研究不同種類碳源對其產(chǎn)量的影響。由圖5 可知，以葡萄糖為碳源的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最高，達(dá)到3.31 g/L，其次為甘露醇，達(dá)到2.81 g/L，而乳糖和麥芽糖的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量明顯較低，說明菌株對二糖的利用效率低。史志強(qiáng)等發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為碳源比較有利于菌體產(chǎn)膜，而甘露糖醇不利于菌體產(chǎn)膜[36]。因此確定最佳碳源種類為葡萄糖，在后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)中采用葡萄糖作為碳源。

圖5 不同碳源對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

2.3.2 不同氮源對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

本文探究了不同的有機(jī)氮源對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對照。由圖6 可知，以安琪蛋白胨FP410 為氮源的產(chǎn)量達(dá)到4.08 g/L，使用安琪酵母浸粉FM902 產(chǎn)量則達(dá)到3.79 g/L。李靜等研究指出氮源中蛋白胨對BC 產(chǎn)量的影響高于酵母粉[37]；孫東平等的研究指出當(dāng)?shù)鞍纂藶槲ㄒ坏磿r(shí)，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量最高[38]；薛璐等也報(bào)道了以蛋白胨為氮源時(shí)，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量高于酵母膏和牛肉膏[39]。從產(chǎn)量因素考慮，最終確定最佳氮源種類為安琪蛋白胨FP410，后續(xù)正交試驗(yàn)氮源均用FP410。

圖6 不同氮源對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

2.3.3 乙酸對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

馬霞等證實(shí)在培養(yǎng)基中添加檸檬酸、乙酸和乳酸可以提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，但當(dāng)乙酸濃度高于臨界值時(shí)產(chǎn)量會(huì)出現(xiàn)下降[40]；付莉等發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙酸濃度在1～4 g/L 時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量隨乙酸濃度上升而上升，但當(dāng)乙酸濃度高于臨界值時(shí)產(chǎn)量出現(xiàn)下降[41]。從圖7 中可看到，不同濃度的乙酸對細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量有顯著影響，在乙酸添加量為2 mL/L 時(shí)細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量達(dá)到最大值，為4.18 g/L。隨后細(xì)菌纖維素產(chǎn)量隨乙酸濃度升高有明顯的下降。菌體通過乙酸產(chǎn)生ATP，提高葡萄糖轉(zhuǎn)化成UDP-葡萄糖的效率[40]，其中UDP-葡萄糖為合成細(xì)菌纖維素的前體物質(zhì)，添加少量乙酸會(huì)促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)化為細(xì)菌纖維素。因此，乙酸的最佳添加濃度為2 mL/L。

圖7 乙酸對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

2.3.4 乙醇對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

茍金霞等報(bào)道乙醇可以促進(jìn)細(xì)菌纖維素的合成，但是乙醇的體積分?jǐn)?shù)過高,就會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)酸過多,使大部分的菌體細(xì)胞迅速衰老，錯(cuò)過產(chǎn)膜期，使纖維素產(chǎn)量降低[42]。研究證明當(dāng)添加一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量達(dá)到最大值，之后產(chǎn)量出現(xiàn)下降[43]。由圖8 可得知，乙醇并不適合P1-1 菌株生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，當(dāng)不添加乙醇時(shí)，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最高，達(dá)到了4.07 g/L，之后隨著乙醇濃度的增加，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量出現(xiàn)明顯的降低。該試驗(yàn)結(jié)果表明P1-1 菌株在乙醇代謝上有一定特殊性。

圖8 乙醇對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

2.4 正交實(shí)驗(yàn)確定產(chǎn)細(xì)菌纖維素最優(yōu)發(fā)酵條件

單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果表明，對P1-1 菌株產(chǎn)細(xì)菌纖維素影響較為顯著的3 個(gè)因素分別為葡萄糖、安琪蛋白胨FP410和乙酸濃度，由此本文選取這3個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，并添加KH2PO43 g/L和MgSO4·7H2O 20 g/L。

由表5 可知，根據(jù)直接分析得出各因素對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量影響從大到小順序?yàn)镃＞B＞A，即乙酸＞葡萄糖＞安琪蛋白胨FP410。其中3 個(gè)因素的最佳組合為A3B1C1，即葡萄糖60 g/L，安琪蛋白胨FP410 14.41 g/L，乙酸濃度1 mL/L。利用該組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為4.30±0.12 g/L，是基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)量（1.76 g/L）的2.44 倍，顯著提高了P1-1 菌株的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量。

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本文從櫻桃、油桃、蘋果、芒果、橘子和柿子等6 種水果中篩選出一株高產(chǎn)菌株P(guān)1-1，經(jīng)鑒定為木糖駒形氏桿菌（Komagataeibacter xylinus），對P1-1 菌株動(dòng)態(tài)發(fā)酵產(chǎn)的細(xì)菌纖維素進(jìn)行性質(zhì)分析表明，該菌株產(chǎn)的細(xì)菌纖維素具有更好的熱穩(wěn)定性，并且纖維直徑僅有27 nm。通過單因素試驗(yàn)，確定了P1-1 菌株發(fā)酵的碳源為葡萄糖，氮源為安琪蛋白胨FP410，添加2 mL/L 的乙酸促進(jìn)細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)。選擇葡萄糖、安琪蛋白胨FP410、乙酸三個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，最終得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖60 g/L，安琪FP410蛋白胨14.41 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 20 g/L，乙酸1 mL/L，優(yōu)化后P1-1 菌株細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量達(dá)4.30 g/L，該結(jié)果為今后細(xì)菌纖維素的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。該菌株用于工業(yè)化生產(chǎn)還有很大的提升空間，包括工業(yè)化生產(chǎn)中是否能夠穩(wěn)定高產(chǎn)，其它發(fā)酵條件對其影響等，需要進(jìn)一步研究和優(yōu)化。