王丹丹，劉曉紅，宮遠(yuǎn)航

(遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東 118003)

鹿角靈芝(Ganodermaamboinense)隸屬于真菌界(Kingdom Fungi) 擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)多孔菌目(Polyporales)多孔菌科(Polyporaceae)靈芝菌屬(Ganoderma)，多生長(zhǎng)在云南的無(wú)量山以及海南的尖峰嶺、吊羅山等地區(qū)，因其菌柄較長(zhǎng)，常伴有多個(gè)鹿角狀分支，無(wú)菌蓋或偶見(jiàn)小菌蓋，表面具漆樣光澤、褐紅色或紫褐色；鹿角靈芝因生長(zhǎng)環(huán)境條件變化(如控制CO2的濃度)而形成，自然條件下卻極為罕見(jiàn)[1]。鹿角靈芝作為靈芝中的名貴品種，具有抗腫瘤、抗衰老、抑制組織胺釋放、增強(qiáng)單核吞噬細(xì)胞系與NK細(xì)胞功能、護(hù)肝、抗HIV病毒以及調(diào)節(jié)免疫力的作用，其關(guān)鍵藥效成分為靈芝三萜和靈芝多糖；試驗(yàn)證明，靈芝三萜類(lèi)具有迅速提高免疫力的作用，表現(xiàn)在促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，提高巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞的吞噬能力和殺傷力，并直接和間接毒殺腫瘤細(xì)胞[2]，同時(shí)能夠激活化療藥物難以殺死的G0期腫瘤細(xì)胞，進(jìn)行單獨(dú)和聯(lián)合毒殺[3]；羊毛甾烷型四環(huán)三萜的靈芝提取物在研究中顯示出對(duì)肝惡性腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，而對(duì)正常肝細(xì)胞并無(wú)抑制效果，其機(jī)理為快速降低細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)的活力以及延緩應(yīng)激活化蛋白激酶(Stress-activated protein kinase，SAPK)的激活[4]。

萜為種類(lèi)最多的一類(lèi)天然產(chǎn)物，是異戊二烯聚合物以及其衍生物的總稱(chēng)，分子式為異戊二烯整數(shù)倍的烯烴類(lèi)化合物[5]。萜類(lèi)在不同物種的生命活動(dòng)中具有不同的生理功能，如植物激素(脫落酸和赤霉素)、昆蟲(chóng)保幼激素、光合色素(胡蘿卜素和葉綠素)、電子載體(質(zhì)體醌和泛醌)、多糖合成介質(zhì)(多聚異戊烯磷酸)以及生物膜成分(甾醇)，此外，萜類(lèi)作為次生代謝產(chǎn)物也是鹿角靈芝的關(guān)鍵藥效成分[6]。

三萜類(lèi)物質(zhì)是由甲羥戊酸途徑合成(圖1)：首先合成活性異戊烯前體，即由三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)與乙酰乙酰輔酶A(Acetoacetyl-CoA)生成3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutary CoA，HMG-CoA)，后者還原生成甲羥戊酸(Mevalonic acid，MVA)，MVA經(jīng)數(shù)步反應(yīng)轉(zhuǎn)化成異戊烯基焦磷酸(Isopentenylpyrophosphate，IPP)，IPP再經(jīng)硫氫酶(Sulphydryl enzyme)及異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶(IPP isomerase)轉(zhuǎn)化為二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)；IPP和DMAPP兩者均可轉(zhuǎn)化為半萜，在酶的作用下，頭尾相接聚合為牦牛兒焦磷酸(Geranyl pyrophosphate，GPP)，GPP經(jīng)鯊烯合酶(Squalene synthetase，SQS)以法尼酯焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)為底物，生成鯊烯，進(jìn)而生成靈芝三萜[7]；可見(jiàn)，SQS是生成靈芝三萜的拐點(diǎn)，是催化兩分子法尼酯焦磷酸縮合產(chǎn)生鯊烯的關(guān)鍵酶，而鯊烯是生物合成三萜、甾醇、膽固醇等萜烯類(lèi)重要物質(zhì)的共同前體，所以SQS是靈芝三萜合成途徑的關(guān)鍵酶[8-9]。三萜類(lèi)物質(zhì)普遍存在于真核及原核生物的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，SQS是鹿角靈芝MVA途徑中的首個(gè)限速酶，目前，已在多個(gè)物種中成功克隆并表達(dá)，但關(guān)于鹿角靈芝三萜代謝調(diào)控及合成途徑關(guān)鍵酶基因SQS的克隆與表達(dá)分析尚未見(jiàn)報(bào)道[10]。

目前，對(duì)影響鹿角靈芝三萜類(lèi)化合物含量的研究主要集中在培養(yǎng)基成分上，而合成途徑中關(guān)鍵酶基因和藥物誘導(dǎo)對(duì)靈芝三萜含量的影響未見(jiàn)報(bào)道[11]。靈芝三萜含量多少是衡量鹿角靈芝品質(zhì)的重要指標(biāo)；本研究參考靈芝(DQ494674.1)的三萜化合物合成關(guān)鍵酶基因SQS，設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR與RACE技術(shù)克隆鹿角靈芝SQS全長(zhǎng)基因，命名為GaSQS基因。通過(guò)蛋白序列比對(duì)、結(jié)構(gòu)域分析、蛋白網(wǎng)絡(luò)互作以及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，分析調(diào)控靈芝三萜合成的關(guān)鍵酶基因GaSQS的特性，為深入研究GaSQS蛋白的功能，并最終解釋鹿角靈芝三萜合成途徑的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)；在鹿角靈芝深層發(fā)酵過(guò)程中添加外源茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)，采用qRT-PCR技術(shù)分析茉莉酸甲酯在鹿角靈芝生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期對(duì)靈芝三萜含量誘導(dǎo)影響，有助于揭示鹿角靈芝三萜合成調(diào)控的分子機(jī)制，以期采用基因工程手段提高鹿角靈芝的藥用活性和商品價(jià)值打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)菌株

鹿角靈芝由遼東學(xué)院生物產(chǎn)業(yè)研究所提供，鹿角靈芝接種于液體PDA培養(yǎng)基中(250 mL錐形瓶裝100 mL PDA培養(yǎng)基)，從試管斜面培養(yǎng)的菌株中，挑取5～6塊1 cm2菌絲接種到試驗(yàn)培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)8 d，為了研究不同濃度MeJA對(duì)GaSQS基因表達(dá)的影響，采用乙醇為助溶劑，將MeJA配制成50，100，150，200，250，300 μmol/L，分別加入培養(yǎng)基中誘導(dǎo)12 h，另取一組不加MeJA為對(duì)照組[12]。每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取平均值。

1.2 總RNA提取

收集MeJA誘導(dǎo)后的新鮮菌絲，離心去除上清液，取60～100 mg置于液氮中研磨，研磨徹底成粉末狀，按照真菌總 RNA 快速抽提試劑盒(Fungal Total RNA Isolation Kit)步驟抽提鹿角靈芝總RNA，120 V、1%瓊脂糖電泳20 min，檢測(cè)RNA完整性[13]。以鹿角靈芝總RNA為模板，GaSQS1為引物(表1)，采用一步法 RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒(M-MuLV)生成cDNA第一鏈，為克隆鹿角靈芝GaSQS基因核心序列的模板，-20 ℃保存。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.3 鹿角靈芝GaSQS全長(zhǎng)基因的克隆

以靈芝(DQ494674.1)SQS基因序列設(shè)計(jì)引物(表1)SQS-coreF/R，以1.2反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板，克隆鹿角靈芝SQS基因核心序列，反應(yīng)體系15 μL，即1 μL cDNA，1.5 μL LA緩沖液 (10×)，2.5 μL dNTP Mix，0.5 μL上下游引物(20 μmol/L)，0.2 μL LA聚合酶混合液 (5 U/μL)，滅菌ddH2O 加至15 μL；PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，回收至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。以GaSQS核心片段設(shè)計(jì)GaSQS1-F1/F2特異性正向引物，分別與GaSQS1-R2反向引物組合進(jìn)行2次巢式PCR，獲得鹿角靈芝GaSQS基因3′端；根據(jù)GaSQS基因核心片段設(shè)計(jì)GaSQS2-R1、GaSQS2-R2和GaSQS-R3特異性反向引物，分別與SMARTerTM RACE cDNA Amplication試劑盒中UPM引物組合進(jìn)行3次巢式PCR，得到GaSQS基因5′端序列，反應(yīng)條件均同上[14]。

1.4 鹿角靈芝GaSQS全長(zhǎng)基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)GaSQS基因全長(zhǎng)序列，采用ORF Finder預(yù)測(cè)GaSQS基因開(kāi)放閱讀框，在線(xiàn)分析軟件Prot Param分析理化特性，Prot Scale分析氨基酸序列的疏水性和親水性，SWISS MODEL在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，在String(http：//string-db.org/)中預(yù)測(cè)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BlastP程序預(yù)測(cè)氨基酸保守域及同源性分析，DNAMAN軟件對(duì)其同源氨基酸進(jìn)行多重比對(duì)，用ClustalX和MEGA 7.0 軟件構(gòu)建鹿角靈芝GaSQS基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[15]。

1.5 茉莉酸甲酯對(duì)鹿角靈芝GaSQS基因的誘導(dǎo)表達(dá)

采用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)特異性引物GaSQS-qF/R，以18S-RNA-F/18S-RNA-R為內(nèi)參引物(表1)，通過(guò)qRT-PCR對(duì)GaSQS基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，檢測(cè)不同濃度MeJA誘導(dǎo)下GaSQS基因表達(dá)量的差異[16-17]，3次生物學(xué)重復(fù)取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿角靈芝GaSQS基因cDNA全長(zhǎng)克隆

以SQS-coreF/R引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得972 bp基因片段(圖2-A)，經(jīng)BlastP比對(duì)表明該片段編碼氨基酸與較多多孔科菌類(lèi)的鯊烯合酶均具較高的同源性(80%～99%)，可見(jiàn)，分離得到的片段為鹿角靈芝SQS基因的核心序列；基于SQS基因核心序列，進(jìn)行5′-RACE與3′-RACE PCR擴(kuò)增，分別得到676，795 bp的明亮條帶(圖2-B-C)，采用SeqMan程序?qū)?′-RACE、核心序列與3′-RACE 3段DNA序列進(jìn)行拼接，獲得一條長(zhǎng)度為1 969 bp的DNA片段。通過(guò)ORF Finder 預(yù)測(cè)SQS基因cDNA為1 515 bp，設(shè)計(jì)跨ORF引物GaSQS-F/R進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，得到約2 000 bp的片段(圖2-D)，說(shuō)明該片段包含完整SQS基因的ORF，表明成功獲得鹿角靈芝SQS基因的全長(zhǎng)序列，即GaSQS。

2.2 鹿角靈芝GaSQS基因理化特性分析

GaSQS蛋白表達(dá)圖譜如圖3，與2.1預(yù)測(cè)大小一致。鹿角靈芝GaSQS基因全長(zhǎng)為1 969 bp(圖4)，包含一個(gè)1 515 bp的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼504個(gè)氨基酸，其5′-UTR長(zhǎng)204 bp，3′-UTR長(zhǎng)250 bp，ProtParam 分析表明，GaSQS蛋白質(zhì)分子式為C2594H4051N735O742S25，含8 147個(gè)原子，分子量為58.2 ku，等電點(diǎn)pI為6.62，含有68個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基，65個(gè)帶正電荷氨基酸殘，亮氨酸(Leu)含量最高(10.3%)，半胱氨酸(Leu)含量最高(1.8%)，脂肪系數(shù)84.98；ProtScale分析表明，GaSQS蛋白親水性氨基酸數(shù)量顯著多于疏水性氨基酸數(shù)量，242，243位氨基酸殘基的親水性最強(qiáng)(MIN：-2.544)，81位的疏水性最強(qiáng)(MAX：3.144)，推斷GaSQS蛋白為親水性蛋白；SignalP-4.1預(yù)測(cè)GaSQS蛋白無(wú)信號(hào)肽，無(wú)剪切位點(diǎn)，說(shuō)明該蛋白翻譯后無(wú)需跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；PSORT Prediction預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位表明，該蛋白質(zhì)可能存在于細(xì)胞質(zhì)中；Smart在線(xiàn)分析，GaSQS蛋白具有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(56～343，9.2e-24)；Blast保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)GaSQS蛋白具有萜類(lèi)化合物典型的3個(gè)保守區(qū)：2個(gè)酶的底物結(jié)合域、底物-Mg2+結(jié)合位點(diǎn)與2個(gè)富含天冬氨酸域。SOPMA預(yù)測(cè)GaSQS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋(59.52%)、無(wú)規(guī)則卷曲(28.37%)、延伸鏈(8.53%)和β-轉(zhuǎn)角(3.57%)；SWISS-MODEL預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5)表明，GaSQS蛋白具有由多個(gè)α-螺旋形成的中央激活位點(diǎn)空穴區(qū)域，符合鯊烯合酶的理化特性，有利于形成底物結(jié)合域和催化位點(diǎn)，該區(qū)域可與Mg2+結(jié)合，而Mg2+又能與底物二磷酸結(jié)合，因此，推測(cè)該核心部位可能是酶的活性中心。

2.3 鹿角靈芝GaSQS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

經(jīng)Blast比對(duì)，GaSQS蛋白與較多多孔菌科菌類(lèi)均具有較高同源性(80%～99%)，從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)選取16個(gè)與GaSQS蛋白高度同源的SQS氨基酸序列，用MEGA 7.0構(gòu)建SQS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖6)。結(jié)果表明，17個(gè)SQS氨基酸序列匯聚為兩大支，其中木蹄層孔菌(Heliocybesulcata(TFK48357.1))單獨(dú)聚為一支，為法呢酯焦磷酸合酶(FPS)，另一支均為多孔菌科的鯊烯合酶SQS，鹿角靈芝的GaSQS蛋白與靈芝(Ganodermalucidum(ABF57213.1))的SQS蛋白表現(xiàn)出較高的同源性(99%)，其次是靈芝(AHN91949.1)和紫芝(GanodermasinenseZZ0214-1(PIL24868.1))，三者均屬于靈芝屬，親緣關(guān)系最為相近，說(shuō)明該蛋白高度保守。

2.4 鹿角靈芝GaSQS基因表達(dá)分析

2.4.1 不同發(fā)育階段GaSQS基因表達(dá)水平與含量變化 以GaSQS-qF/R為引物，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)GaSQS基因在鹿角靈芝不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量，即菌絲期、原基期和子實(shí)體期。結(jié)果表明：GaSQS基因在鹿角靈芝的不同發(fā)育階段表達(dá)水平呈動(dòng)態(tài)化波動(dòng)(圖7)，菌絲期1～15 d 該基因的表達(dá)量有逐漸上升趨勢(shì)，在原基期達(dá)到峰值，子實(shí)體期略下降，原基期表達(dá)量約為子實(shí)體期的1.14倍，約為菌絲期5 d 的4.84倍；提取不同發(fā)育階段的靈芝三萜，在波長(zhǎng)551 nm時(shí)測(cè)定吸光度，并計(jì)算靈芝三帖的含量。結(jié)果顯示，靈芝三帖的含量在原基期最高(4.68 mg/g)，約為菌絲期第5天的 3.44倍，與其他發(fā)育階段的含量均存在差異，子實(shí)體期三萜含量略有下降趨勢(shì)，說(shuō)明鹿角靈芝在原基和子實(shí)體初期鯊烯合酶(GaSQS)的表達(dá)量與產(chǎn)量均較高。

2.4.2 不同濃度茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下GaSQS基因表達(dá)水平 以濃度為50～300 μmol/L的MeJA處理鹿角靈芝12 h(圖8)，均能誘導(dǎo)GaSQS基因的高效表達(dá)，且相對(duì)表達(dá)量呈先上升后急劇下降的趨勢(shì)，其中MeJA的濃度在200 μmol/L時(shí)，GaSQS基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，約為空白對(duì)照組的9.74倍。結(jié)果表明，MeJA能誘導(dǎo)靈芝三萜生物合成途徑中關(guān)鍵酶GaSQS基因有效表達(dá)，提高靈芝三萜產(chǎn)量，當(dāng)茉莉酸甲酯的濃度為200 μmol/L時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)效果最佳，當(dāng)濃度大于200 μmol/L時(shí)，可能出現(xiàn)抑制作用而誘導(dǎo)效果減弱。

2.5 鹿角靈芝GaSQS蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

String蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明，與GaSQS蛋白互作的蛋白質(zhì)共有10個(gè)(圖9)，即：鯊烯環(huán)氧酶、甾醇14α-去甲基化酶、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶、甲基固GaSqs.鹿角靈芝鯊烯合酶；Sqle.鯊烯環(huán)氧酶；Cyp51.甾醇14α-去甲基化酶； ldi1.異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶； Msmo1.甲基固醇單加氧酶；Ggps1.牦牛兒基焦磷酸合酶； Lss.羊毛甾醇合酶；Mvd.焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶；Sc5d.烯膽固烷醇氧化酶；Fdps.法呢酯焦磷酸合酶；Nsdhl.4α-羧基固醇-3-脫氫酶。

醇單加氧酶、牦牛兒基焦磷酸合酶、羊毛甾醇合酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶、烯膽固烷醇氧化酶法呢酯焦磷酸合酶和4-羧基固醇3-脫氫酶，這些蛋白均是生物合成三萜、甾醇、膽固醇等萜烯類(lèi)重要酶類(lèi)，說(shuō)明GaSQS是靈芝三萜合成途徑中最關(guān)鍵的酶，與靈芝三萜含量的多少有著密切的關(guān)系。

3 討論

近年來(lái)，人們對(duì)天然藥物的需求不斷增加，從天然藥物中提取高含量、高藥效的次生代謝產(chǎn)物已備受關(guān)注，萜類(lèi)次生代謝工程很大程度上解決了藥用真菌類(lèi)天然藥物資源短缺的問(wèn)題，利用次生物質(zhì)代謝工程調(diào)控合成途徑的代謝流來(lái)提高藥效成分的終產(chǎn)量；礙于真菌類(lèi)生物遺傳背景復(fù)雜，基因信息挖掘甚少，致使該類(lèi)生物的次生代謝研究緩慢。隨著基因工程與分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，結(jié)合基因組學(xué)技術(shù)，深入挖掘、分離功能基因，如鹿角靈芝三萜類(lèi)化合物合成代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因GaSQS，探究其次生代謝過(guò)程，提高靈芝三萜含量具有重要價(jià)值，并最終達(dá)到調(diào)控靈芝三萜合成途徑的目的；專(zhuān)家對(duì)靈芝三萜具有保肝、抗腫瘤、抗HIV病毒等方面進(jìn)行了深入的研究，尤其抗腫瘤作用已成為研究的熱點(diǎn)，如有效抑制人類(lèi)肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等多種腫瘤的生長(zhǎng)，Gao等[18]發(fā)現(xiàn)靈芝三萜可通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的蛋白表達(dá)，達(dá)到抑制口腔黏膜癌的效果；唐慶九等[19]發(fā)現(xiàn)靈芝三萜可導(dǎo)致腸癌細(xì)胞凋亡，并對(duì)多種腫瘤具有抑制效果；陳潔等[20]發(fā)現(xiàn)三萜類(lèi)化合物對(duì)由CCL4導(dǎo)致的小鼠肝臟纖維化抑制明顯，并對(duì)小鼠肝肉瘤細(xì)胞增殖抑制作用較明顯，其機(jī)制可能是通過(guò)降低合成膠原纖維的相關(guān)蛋白表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究通過(guò)生物信息學(xué)手段挖掘、解析鹿角靈芝功能基因GaSQS的結(jié)構(gòu)與功能，鯊烯合酶(SQS)位于法呢酯焦磷酸(FPP)分支到靈芝三萜合成途徑，F(xiàn)PP除了可以被SQS催化生成鯊烯(SQ)外，在其他酶的催化下亦可以生成類(lèi)胡蘿卜素、赤霉素等；可見(jiàn)，SQS是三萜、甾醇、膽固醇等萜烯類(lèi)生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，所以SQS的含量與活性決定了后續(xù)產(chǎn)物靈芝三萜的產(chǎn)量。本研究通過(guò) RT-PCR與RACE技術(shù)克隆了調(diào)控靈芝三萜合成限速步驟的關(guān)鍵酶GaSQS全長(zhǎng)基因，以期實(shí)現(xiàn)利用次生代謝工程手段提高鹿角靈芝有效成分靈芝三萜的含量，以提高鹿角靈芝的品質(zhì)，為采用分子育種技術(shù)改良和培育鹿角靈芝新品種，促進(jìn)該品種的可持續(xù)、優(yōu)良發(fā)展以及次生代謝工程的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

鹿角靈芝作為大型藥用真菌，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值，鹿角靈芝生長(zhǎng)的環(huán)境條件對(duì)靈芝三萜的含量影響顯著，通過(guò)增加外源誘導(dǎo)物和環(huán)境信號(hào)作為環(huán)境激發(fā)子，提高生物合成途徑中關(guān)鍵酶的活性和表達(dá)量，最終達(dá)到提高靈芝三萜產(chǎn)量的目的。MeJA是通過(guò)硬脂酸途徑產(chǎn)生的脂肪衍生物，存在于大多數(shù)植物中，當(dāng)植物受創(chuàng)后會(huì)產(chǎn)生受傷信號(hào)，并產(chǎn)生茉莉酸類(lèi)物質(zhì)(如MeJA)來(lái)提高植物的抗性，所以，MeJA被認(rèn)為是一種信號(hào)分子，能誘導(dǎo)許多植物及真菌類(lèi)產(chǎn)生生理反應(yīng)，MeJA對(duì)生物體的調(diào)節(jié)作用主要體現(xiàn)在兩方面：一是在轉(zhuǎn)錄水平影響次生代謝過(guò)程，調(diào)節(jié)防御系統(tǒng)；二是調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育及衰老等過(guò)程。目前，國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家致力于將MeJA作為誘導(dǎo)物調(diào)控生物次生代謝途徑，Lee等[21]研究表明，MeJA可誘導(dǎo)香樹(shù)素合成酶和鯊烯環(huán)氧酶的過(guò)表達(dá)，提高人參中人參皂苷的含量；Hayashi等[22]研究表明，MeJA不僅能誘導(dǎo)萜烯類(lèi)化合物大豆皂甙的生物合成，激活氧化鯊烯環(huán)化酶和香樹(shù)素合成酶基因的活性，而且MeJA也可誘導(dǎo)萜類(lèi)和甾醇類(lèi)生物合成途徑中的關(guān)鍵酶SQS。所以，本試驗(yàn)在鹿角靈芝液體培養(yǎng)條件下，探究添加不同濃度MeJA對(duì)靈芝三萜表達(dá)量的影響，結(jié)果表明，MeJA可以信號(hào)分子的形式誘導(dǎo)鹿角靈芝次生代謝物靈芝三萜表達(dá)量的增加，調(diào)控關(guān)鍵酶基因GaSQS的過(guò)表達(dá)，提高關(guān)鍵酶的活性，其中當(dāng)MeJA的濃度為200 μmol/L時(shí)，GaSQS基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的9.74倍，達(dá)到調(diào)控靈芝三萜表達(dá)的目的。Song等[23]發(fā)現(xiàn)MeJA可誘導(dǎo)靈芝細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、蛋白質(zhì)降解等相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)，如SNARE蛋白和泛素連接酶等，SNARE是膜泡運(yùn)輸途徑中的關(guān)鍵蛋白，參與真菌產(chǎn)孢和維持細(xì)胞壁完整性等過(guò)程，推測(cè)MeJA可能是通過(guò)誘導(dǎo)SNARE蛋白的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而提高靈芝三萜生物合成途徑中GaSQS的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，達(dá)到提高靈芝三萜產(chǎn)量的目的，有助于揭示調(diào)控靈芝三萜生物合成的分子機(jī)制，以期采用基因工程手段提高鹿角靈芝藥用成分活性，為其他萜烯類(lèi)化合物的生物合成調(diào)控提供線(xiàn)索與借鑒，此外，深入開(kāi)展次生代謝產(chǎn)物合成途徑的調(diào)控研究，有利于培育鹿角靈芝優(yōu)良品系，為滿(mǎn)足市場(chǎng)需求化種植和質(zhì)量調(diào)控提供技術(shù)支持，更好地推動(dòng)中藥材品質(zhì)發(fā)展。