汪 亮，李忠秋，唐曉東，張海峰，劉 娣，張冬杰

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150086)

V-ATP酶最早是在酵母細(xì)胞的液泡膜上發(fā)現(xiàn)的，其主要功能是利用水解ATP產(chǎn)生的能量實(shí)現(xiàn)氫離子的跨膜運(yùn)輸，在水解ATP、調(diào)節(jié)pH值和產(chǎn)生電勢(shì)梯度等方面具有重要作用[1]。在進(jìn)化上高度保守，主要存在于不同生物的細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜上。V-ATP酶是一種復(fù)雜的異聚體蛋白，包括2個(gè)結(jié)構(gòu)復(fù)合體V1和V0，V1存在于膜表面，屬于催化區(qū)域，負(fù)責(zé)ATP的水解；V0包埋在膜內(nèi)，屬于質(zhì)子傳導(dǎo)區(qū)域，負(fù)責(zé)質(zhì)子的轉(zhuǎn)運(yùn)。V1由8個(gè)亞基組成(A、B、C、D、E、F、G、H)，V0由6個(gè)亞基組成(a、c、c′、c″、d、e)[2]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)V-ATP酶除了可以轉(zhuǎn)運(yùn)H+，調(diào)節(jié)細(xì)胞器內(nèi)的pH值外，還參與許多其他的生物學(xué)過(guò)程。比如，在植物中，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓，促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)以及幫助植物適應(yīng)干旱、鹽堿、低溫等非生物逆境脅迫[3]。在昆蟲中，可調(diào)節(jié)煙草天蛾、東亞飛蝗等的蛻皮活動(dòng)，參與柑橘小實(shí)蠅雄蟲的生殖過(guò)程，在家蠶絲腺細(xì)胞中建立電勢(shì)差，利于細(xì)胞的胞吐作用以及后續(xù)絲膠蛋白的分泌[4]。

ATP6V0A4編碼V-ATP酶的a4亞基，被認(rèn)為是遺傳性遠(yuǎn)端腎小管性酸中毒的致病基因，該疾病因遠(yuǎn)端腎小管泌氫障礙，使得可滴定酸及尿NH4+排出減少，從而導(dǎo)致一系列的臨床表現(xiàn)[5]。ATP6V0A4基因缺失小鼠到斷奶時(shí)，表現(xiàn)出嚴(yán)重的代謝性酸中毒，低血鉀和早起腎鈣化，聽力嚴(yán)重受損。除非堿化，否則它們會(huì)快速死亡[6]。民豬資源研究與利用課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，民豬在遭受冷應(yīng)激后，其背部皮下脂肪內(nèi)的ATP6V0A4基因的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)顯著升高(P<0.05)。目前，還未見該基因與脂肪代謝或體溫調(diào)節(jié)相關(guān)的報(bào)道，但其作為編碼V-ATP酶亞基的一個(gè)基因，參與細(xì)胞內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子活動(dòng)，這種活動(dòng)對(duì)于pH值的穩(wěn)定和膜電位的產(chǎn)生至關(guān)重要，而膜電位是細(xì)胞代謝的驅(qū)動(dòng)力[7]。為了后續(xù)探討ATP6V0A4基因在冷應(yīng)激過(guò)程中的生物學(xué)功能，本研究對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)的核心序列進(jìn)行了篩選和分析，從分子水平探討其可能存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1頭12月齡的雌性民豬基因組DNA由黑龍江省家畜育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存，內(nèi)切酶KpnⅠ、Hind Ⅲ和pMD18-T Vector購(gòu)自TaKaRa，雙熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自Promega。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 根據(jù)NCBI已有的豬ATP6V0A4基因組序列設(shè)計(jì)引物(GenBank登錄號(hào)：NC_010460)，擴(kuò)增-1 504～-1 bp序列(將起始密碼子“A”的位置定義為1)，引物序列見表1。

以豬的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為模板DNA 1 μL(50 ng/μL)；2×PCR Mix 10 μL；上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL；ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min；4 ℃保存。

1.2.2 克隆測(cè)序 參照TransGen Biotech膠回收試劑盒(EG101-02)說(shuō)明書操作。將回收后的PCR產(chǎn)物連入pMD18-T載體，構(gòu)建pMD18-T-ATP6V0A4質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞。應(yīng)用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切鑒定。雙酶切體系為KpnⅠ和Hind Ⅲ各0.5 μL(10 U/μL)，10×Buffer 1.0 μL，質(zhì)粒 4.0 μL；ddH2O 4.0 μL。反應(yīng)條件為37 ℃酶切15 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后選取陽(yáng)性克隆菌落送至北京華大基因科技有限公司測(cè)序。應(yīng)用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3 熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建 將測(cè)序正確的克隆載體與pGL3-Basic空載體分別使用KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切處理，回收目的片段后，將帶有黏性末端的目的片段與線性化的pGL3-Basic載體相連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，經(jīng)菌液PCR、雙酶切、測(cè)序驗(yàn)證后，提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒(提取方法嚴(yán)格按照天根無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書操作)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 轉(zhuǎn)染與熒光素酶活性檢測(cè) 將報(bào)告基因重組質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至豬PK15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天以4×105～8×105細(xì)胞/皿的密度鋪至24孔板中，使第2天轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合，轉(zhuǎn)染過(guò)程嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000 (Invitrogen)說(shuō)明書操作。每孔加入總質(zhì)量為0.5 μg的質(zhì)粒和2 μL轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染后4～6 h換液，24 h后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)按照Promega產(chǎn)品說(shuō)明書操作。

1.2.5ATP6V0A4基因啟動(dòng)子核心區(qū)鑒定 以克隆測(cè)序后的1 504序列為參考序列，設(shè)計(jì)一系列截短型上游引物，5′端引入KpnⅠ酶切位點(diǎn)，它們共用1條下游引物1504A(表1)，組成8對(duì)引物。以pMD18-T-ATP6V0A4質(zhì)粒為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段后分別連入pMD18-T載體，測(cè)序驗(yàn)證后將正確的質(zhì)粒連入雙熒光素酶報(bào)告基因載體，轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。

1.2.6ATP6V0A4基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控元件鑒定 為了保證預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在3個(gè)不同網(wǎng)站對(duì)ATP6V0A4基因的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行調(diào)控元件的預(yù)測(cè)(http：//www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html、http：//jaspar.genereg.net、http：//alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3和http：//www.ifti. org)。

表1 擴(kuò)增截短型啟動(dòng)子所用引物Tab.1 Primers for amplification of truncated promoter

依據(jù)不同片段熒光素酶活性的測(cè)定結(jié)果，同時(shí)結(jié)合軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果應(yīng)用重疊延伸PCR對(duì)部分元件進(jìn)行缺失突變，缺失突變用引物序列見表2。PCR反應(yīng)分2輪進(jìn)行，第1輪反應(yīng)利用含有缺失序列的引物與原有引物進(jìn)行配對(duì)擴(kuò)增，在相互重疊的PCR產(chǎn)物末端突變目的序列，第2輪反應(yīng)以第1輪反應(yīng)獲得的2個(gè)片段為模板，利用原有引物進(jìn)行拼接擴(kuò)增，將缺失突變引入產(chǎn)物內(nèi)部。質(zhì)粒的構(gòu)建與熒光素酶活性的測(cè)定同上。

表2 突變調(diào)控元件結(jié)合位點(diǎn)所用引物信息Tab.2 Primer information for binding sites of mutation regulatory elements

2 結(jié)果與 分析

2.1 ATP6V0A4基因啟動(dòng)子區(qū)的擴(kuò)增與鑒定

利用引物1504S和1504A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后在1 500 bp左右發(fā)現(xiàn)清晰明亮的條帶(圖1)，經(jīng)雙酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證后，證明所擴(kuò)增的片段為豬的ATP6V0A4基因啟動(dòng)子區(qū)。

2.2 熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和Hind Ⅲ對(duì)構(gòu)建成功的克隆載體及pGL3-Basic空載體進(jìn)行雙酶切處理，純化目的片段及線性化的載體。經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后得到重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、測(cè)序鑒定。結(jié)果表明，成功地將NoxⅠ基因啟動(dòng)子區(qū)連入了pGL3-Basic載體。

2.3 熒光素酶活性檢測(cè)

將提取的pGL3-Basic-1504無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PK15細(xì)胞中，24 h后檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示-1504～-1 bp(圖2)片段含有啟動(dòng)子活性。

2.4 ATP6V0A4基因啟動(dòng)子區(qū)系列截短序列載體的構(gòu)建

以1504片段為模板，利用8條截短序列的上游引物與1504A配對(duì)，共擴(kuò)增出8條長(zhǎng)度不同的ATP6V0A4啟動(dòng)子區(qū)片段。將PCR擴(kuò)增出的目的片段與pMD18-T載體相連，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切(圖3)、測(cè)序驗(yàn)證后，分別連入pGL3-Basic載體，構(gòu)建8個(gè)報(bào)告基因重組載體，分別為pGL3-Basic-1124、pGL3-Basic-813、pGL3-Basic-581、pGL3-Basic-468、pGL3-Basic-368、pGL3-Basic-265、pGL3-Basic-185和pGL3-Basic-107(數(shù)字代表插入片段的長(zhǎng)度)。

2.5 熒光素酶活性分析

第1輪熒光素酶活性分析主要是從1 504 bp片段至265 bp片段，區(qū)間間隔大約為300 bp長(zhǎng)度。因此，共檢測(cè)了4個(gè)片段的熒光素酶活性，以空載體pGL3-Basic作為陰性對(duì)照，以pGL3-Basic-1504作為陽(yáng)性對(duì)照，具體檢測(cè)結(jié)果見圖4。由圖可知，1504截短至1124、813、581后，啟動(dòng)子活性無(wú)顯著變化，說(shuō)明-1 504--581 bp區(qū)域內(nèi)沒(méi)有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)。將581位置截短至265后，啟動(dòng)子活性顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明-581--265 bp區(qū)域內(nèi)存在負(fù)調(diào)控元件，-265--1 bp區(qū)域內(nèi)存在正調(diào)控元件。

第2輪缺失以發(fā)生顯著變化的區(qū)間-581--1 bp為基礎(chǔ)，將此區(qū)間進(jìn)一步分割，結(jié)果發(fā)現(xiàn)-265--185 bp區(qū)域內(nèi)存在正調(diào)控元件(圖5)。

2.6 ATP6V0A4基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的預(yù)測(cè)與鑒定

2.6.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果 根據(jù)前期雙熒光素酶測(cè)定結(jié)果，同時(shí)綜合3個(gè)在線轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件的分析結(jié)果，在-205--190 bp區(qū)間預(yù)測(cè)到8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，分別為E2F3、SP2、EGR1、E2F6、CTCFL、E2F1、SP1和ETF；在-120--110 bp區(qū)間預(yù)測(cè)到4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，分別為HNF4G、HNF4A、NR2F1和SP1。

2.6.2 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的驗(yàn)證 利用重疊延伸PCR法對(duì)預(yù)測(cè)的ATP6V0A4基因潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)-205--190 bp和-120--110 bp進(jìn)行缺失突變，經(jīng)酶切測(cè)序驗(yàn)證后，與pGL3-Basic載體相連構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失的報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-205和pGL3-Basic-121(數(shù)字表示突變位點(diǎn))。

以pGL3-Basic-265和pGL3-Basic-185為參照，將構(gòu)建的缺失突變體進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。結(jié)果顯示缺失-205--190 bp區(qū)域，雙熒光素酶活性顯著降低，說(shuō)明該區(qū)域存在正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子；缺失-121--110 bp區(qū)域，雙熒光素酶活性不降反而有上升趨勢(shì)，說(shuō)明這個(gè)區(qū)域可能含有轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子(圖6)。

3 討論

目前，關(guān)于ATP6V0A4基因的研究幾乎全部集中在人類的原發(fā)性遠(yuǎn)端腎小管酸中毒(dRTA)疾病上，dRTA是一種罕見的遺傳性疾病，其特征是遠(yuǎn)端腎單位的尿液酸化過(guò)程受損，導(dǎo)致堿性尿的產(chǎn)生[8]。其致病機(jī)理還不清楚，但ATP6V0A4的突變與dRTA顯著相關(guān)[9]。此外，ATP6V0A4還與乳腺癌的內(nèi)臟轉(zhuǎn)移相關(guān)，發(fā)生內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者該基因顯著高表達(dá)[10]。ATP6V0A4為組織特異性表達(dá)基因，在腎臟、內(nèi)耳、嗅覺(jué)上皮和雄性生殖道的質(zhì)膜、雌性的子宮、胚胎內(nèi)臟卵黃囊等組織表達(dá)[11]，說(shuō)明該基因具有廣泛的生物學(xué)功能。

河北省植物生理及分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，民豬在遭受冷應(yīng)激刺激后，其背部脂肪內(nèi)的ATP6V0A4基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，上升倍數(shù)可達(dá)8.42倍，但在正常情況下，脂肪型的民豬與瘦肉型的大白豬相比，大白豬背脂內(nèi)的ATP6V0A4基因轉(zhuǎn)錄水平比民豬的高8.83倍[12]。據(jù)此，筆者推測(cè)該基因可能與豬的脂肪代謝相關(guān)，并且受冷應(yīng)激誘導(dǎo)，但目前還未見相關(guān)的研究報(bào)道。只知其最后的聚合產(chǎn)物V-ATP酶的組裝和活性會(huì)受到葡萄糖饑餓的誘導(dǎo)[13]，而冷應(yīng)激也會(huì)通過(guò)胰島素依賴途徑增強(qiáng)葡萄糖氧化，進(jìn)而刺激外周組織中的葡萄糖的攝取[14]。為了開展ATP6V0A4基因后續(xù)的功能分析，本研究在分子水平上對(duì)該基因啟動(dòng)子區(qū)的正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了篩選與分析，發(fā)現(xiàn)-581--265 bp區(qū)域內(nèi)存在負(fù)調(diào)控元件，-205--190 bp區(qū)域內(nèi)存在正調(diào)控元件，利用在線軟件預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)-205--190 bp 區(qū)域內(nèi)存在E2F3、SP2、EGR1、E2F6、CTCFL、E2F1、SP1和ETF共計(jì)8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別序列。

E2F3、E2F6和E2F1都屬于E2F轉(zhuǎn)錄因子家族，它們通過(guò)調(diào)節(jié)控制細(xì)胞DNA合成及與細(xì)胞增殖有關(guān)的基因表達(dá)而起作用，同時(shí)本身的活性也受到其他在細(xì)胞周期進(jìn)程中有重要作用的蛋白所調(diào)控[15]。如高遷移率族蛋白B1(HMGB1)可通過(guò)上調(diào)E2F3促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲能力[16]。SP1和SP2同屬于Sp樣轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族共有8個(gè)成員，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等多種生理病理過(guò)程，調(diào)控作用廣泛[17]。而EGR1、CTCFL和ETF這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的研究報(bào)道較少，多集中在癌癥的相關(guān)研究上[18-20]。本研究中，確定了正、負(fù)調(diào)控元件的結(jié)合區(qū)域，但具體哪個(gè)轉(zhuǎn)錄因子會(huì)結(jié)合到ATP6V0A4基因的啟動(dòng)子區(qū)正調(diào)控/負(fù)調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄，還需要后續(xù)的定點(diǎn)缺失試驗(yàn)驗(yàn)證。