姜麗麗 ，牟 芮，劉尚武，張桂芝，金光輝

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 馬鈴薯研究所，黑龍江 哈爾濱 150086)

馬鈴薯是我國第四大主糧作物，2019年中國馬鈴薯種植面積478.95萬hm2，總產(chǎn)量9 193.8萬t，種植面積和總產(chǎn)量均占世界第一位[1]。

馬鈴薯生長過程中會遭受病毒的威脅，導(dǎo)致馬鈴薯種性退化、產(chǎn)量下降以及品質(zhì)變劣。馬鈴薯X病毒(PotatovirusX，PVX)是傳播范圍最廣的馬鈴薯病毒[2]，馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)是對馬鈴薯危害最為嚴(yán)重的病毒[3-4]，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potatospindletuberviroid，PSTVd)可造成馬鈴薯塊莖裂口且不能通過莖尖脫毒汰除[5]。當(dāng)2種或者2種以上病毒復(fù)合侵染馬鈴薯植株時，帶來的損失要遠(yuǎn)高于單一病毒侵染[6-7]。

轉(zhuǎn)化病毒外殼蛋白基因而獲得抗病毒植株是植物抗病毒基因工程的重要方法[8]。利用RNA干擾技術(shù)將病毒來源的基因轉(zhuǎn)化植物獲得抗性植株，可提高植物對病毒抗性，且此法安全有效[9]。amiRNA技術(shù)是利用植物體內(nèi)固有的通過miRNA進(jìn)行基因沉默的系統(tǒng)，以擬南芥miR159a等前體序列作為amiRNA的基木骨架序列，通過人工設(shè)計特異的miRNA，經(jīng)重疊PCR擴(kuò)增將天然miRNA的成熟序列替換成amiRNA的成熟序列來沉默目的基因的方法[10]。amiRNA技術(shù)具有高沉默效率、穩(wěn)定遺傳、高特異性等優(yōu)點(diǎn)[11]。利用amiRNA技術(shù)培育抗病毒植物已有大量報道[12-15]，然而關(guān)于利用amiRNA策略培育多抗病毒的轉(zhuǎn)基因植株方面的報道還較少。

本研究以擬南芥的pre-miRl59a為骨架，分別針對PVX編碼的P25、PVY編碼的HC-Pro以及PSTVd編碼的Vip1基因設(shè)計amiRNA并構(gòu)建表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化馬鈴薯品種費(fèi)烏瑞它轉(zhuǎn)基因植株并對T0轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行病毒抗性鑒定，amiRNA定量分析等。本研究利用miRNA介導(dǎo)兼抗PVX、PVY和PSTVd馬鈴薯植株為實現(xiàn)馬鈴薯兼抗多種病毒提供了新途徑，也為獲得馬鈴薯抗病毒病提供理論依據(jù)和基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

植物材料：以馬鈴薯品種費(fèi)烏瑞它為植物材料，費(fèi)烏瑞它脫毒試管苗由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)馬鈴薯研究所保存。費(fèi)烏瑞它是早熟鮮食型品種，中抗PVY，但在PVX和PVY混合侵染下，表現(xiàn)為重花葉、植株皺縮嚴(yán)重，產(chǎn)量下降45.7%[16]；費(fèi)烏瑞它感染PSTVd時塊莖變細(xì)長、呈現(xiàn)豌豆?fàn)?，部分芽眼突起[17]。

載體和菌株：pCAMBIA1300-221雙元植物表達(dá)載體、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)馬鈴薯研究所保存。

毒源馬鈴薯KX-PVX、PVYN和351-PSTVd，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所病毒實驗室提供。

1.2 P25、HC-Pro、Virp1基因序列獲得

TRIzol法分別提取感染PVX、PVY、PSTVd的馬鈴薯植株RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)NCBI中公布的P25、HC-Pro、Virp1基因序列分別設(shè)計引物，分別為：P25-F(5′-TGTCACCGACGTGGGGTAG-3′)，P25-R(5′-TGACCGGAGCGGTCAGTCT-3′)；HC-Pro-F(5′-GCTGCCGACTCAGACATTAT-3′)，HC-Pro-R(5′-TGCATTAGGAACACCACCAAG-3′)；Virp1-F(5′-CGGAACTAAACTCGTGGTTC-3′)，Virp1-R(5′-TGGAACCGCAGTTGGTTCCT-3′)。進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收測序。

1.3 靶向P25、HC-Pro、Virp1人工miRNA前體的構(gòu)建

本試驗前體骨架選擇擬南芥 miR159a，以擬南芥DNA(CATB法提取)為模板，擴(kuò)增擬南芥pre-miR159a，引物為：miR159a-F(5′-CGATAGATCTTGA

TCTGACGATGG-3′)和miR159a-R(5′-GAGAAGGTG

AAAGAAGATGTAGAG-3′)。

利用在線軟件WMD(http：//wmd2.weigelworldorg/)設(shè)計針對P25、HC-Pro、Virp1基因的amiRNA，序列分別為5′-ATAGTGACTACTTTGAACTCA-3′(P25)；5′-TCGACTAGTATTCTAGGCAGT-3′(HC-Pro)；5′-ATCTCTTACAATTAAGGCGAG-3′(Virp1)。

以擬南芥DNA為模板，通過PCR把擬南芥miR319a的21個核苷酸分別替換為P25、HC-Pro、Virp1基因的amiRNA，引物序列見表1。

表1 pre-amiR-P25、pre-amiR-HCPro、pre-amiR-Virp1引物Tab.1 Sequence primers of pre-amiR-P25，pre-amiR-HCPro，pre-amiR-Virp1

1.4 pre-amiR-P25、pre-amiR-HCPro、pre-amiRNA-Virp1序列連接

為使pre-amiR-P25、pre-amiR-HCPro、pre-amiR-Virp13段序列連入pCAMBIA1300-211載體，分別在pre-amiRNA-P25中引入EcoR Ⅰ、BglⅡ酶切位點(diǎn)，pre-amiR-HCPro引入SpeⅠ、BglⅡ酶切位點(diǎn)，pre-amiRNA-Virp1引入SpeⅠ、PstⅠ酶切位點(diǎn)，并進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)束后分別回收產(chǎn)物并保存。

采用over-lapping PCR將pre-amiR-P25、pre-amiR-HCPro和pre-amiR-Virp13段序列連接，在pre-amiRNA-P25中引入EcoR Ⅰ和BglⅡ酶切位點(diǎn)，pre-amiR-HCPro中引入BglⅡ和SpeⅠ酶切位點(diǎn)，pre-amiR-Virp1引入SpeⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)，連接過程見圖1。將連接片段命名為pre-amiR-P25-HCPro-Virp1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并連入pMD18-T載體，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。

1.5 pre-amiR-P25-HCPro-Virp1植物表達(dá)載體構(gòu)建

將pCR回收產(chǎn)物與含pCAMBIA1300-221載體的質(zhì)粒，分別用EcoR Ⅰ和PstⅠ雙酶切pMD18-T-pre-amiR-P25-HCPro-Virp1質(zhì)粒和pCAMBIA1300-221載體，37 ℃酶切2～4 h。將質(zhì)粒與載體酶切產(chǎn)物按3∶1的比例混合，用T4連接酶16 ℃連接過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將重組質(zhì)粒命名為p1300-221-amiR-P25-HCPro-Virp1，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定與酶切鑒定，陽性重組載體質(zhì)粒電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞。

1.6 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯脫毒微型薯片遺傳轉(zhuǎn)化

取度過休眠期的費(fèi)烏瑞它脫毒微型薯，自來水沖洗30 min，酒精浸泡30 s，次氯酸鈉消毒20 min，無菌純凈水沖洗3～4遍后，置于超凈工作臺中，去皮將薯肉切成1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm的方塊。侵染含p1300-221-amiR-P25-HCPro-Virp1載體農(nóng)桿菌菌液，具體方法參照姜麗麗[18]進(jìn)行。將侵染后的微型薯片接種至分化培養(yǎng)基中(MS+0.5 mg/L IAA(吲哚乙酸)+ 4 mg/L ZT(玉米素)+0.25 mg/LGA3(赤霉素)+300 mg/L Cef(頭孢霉素)+50 mg/L Hyg(潮霉素))，培養(yǎng)條件為(24±2)℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx、光照周期為光16 h/暗8 h；7 d 后轉(zhuǎn)入抗性篩選培養(yǎng)基中(分化培養(yǎng)基中添加50 mg/L Hyg)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件不變。

1.7 轉(zhuǎn)amiR-P25-HCPro-Virp1植株P(guān)CR檢測

提取轉(zhuǎn)化amiR-P25-HCPro-Virp1費(fèi)烏瑞它潮霉素篩選陽性植株DNA，以未轉(zhuǎn)化植株作為陰性對照，上下游引物分別為amiR-P25-F和amiR-Virp301-R，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 轉(zhuǎn)基因植株熒光定量PCR表達(dá)分析

為檢測費(fèi)烏瑞它轉(zhuǎn)化植株中amiRNA的表達(dá)量，用熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測amiR-P25-HCPro-Virp1基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況。以馬鈴薯的看家基因StEF-1α作為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因引物序列為：StEF-1α-F(ATTGGAAACGGATATGCTCCA)，StEF-1α-R(TCCTTACCTGAACGCCTGTCA)，目的基因引物為amiR-P25-F和amiR-Virp301-R。

根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM的說明書要求，在熒光定量PCR儀(Bio-Rad，CFX-96)上進(jìn)行，3次重復(fù)。PCR體系含2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，10 μmol/L引物各0.2 μL，cDNA模板2 μL，加RNase-free ddH2O至終體積20 μL。PCR條件為95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性7 s，61 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，45個循環(huán)；68 ℃延伸5 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。數(shù)據(jù)由熒光定量PCR儀自動讀取，采用2-ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行相對定量分析，計算amiRNA的表達(dá)水平。

1.9 轉(zhuǎn)amiR-P25-HCPro-Virp1植株的抗病性鑒定

1.9.1 試管苗移栽 費(fèi)烏瑞它陽性轉(zhuǎn)化植株及未轉(zhuǎn)化對照移栽至裝有蛭石和珍珠巖的花盆中，并轉(zhuǎn)移至網(wǎng)棚中培養(yǎng)，定期噴施Hoagland營養(yǎng)液壯苗，保持溫室溫度在25～30 ℃，每天光照12 h。

1.9.2 汁液摩擦法接種PVX、PVY、PVSTd病毒 取PVX、PVY、PVSTd毒源植株葉片各2 g置于滅菌研缽中加入20 mL的研磨緩沖液(1×PBS Buffer，pH值7.4)研磨成勻漿備用，轉(zhuǎn)化植株長至6～8片葉時，在植株上部完全展開的葉片上均勻噴灑過直徑為20 μm篩的金剛砂，用消毒毛刷蘸取少量混合毒源汁液均勻涂抹在費(fèi)烏瑞它轉(zhuǎn)化植株及未轉(zhuǎn)化植株(CK)嫩葉上，接毒120 min后用無菌超純水將葉片清洗干凈。定期觀察植株的癥狀，并對植株進(jìn)行RT-PCR分子檢測。

根據(jù)PVX、PVY和PSTVd的基因保守序列，設(shè)計引物，序列見表2。其中PVX目的片段為711 bp，PVY目的片段為447 bp，PSTVd目的片段為356 bp。

表2 PVX、PVY及PSTVd病毒檢測引物Tab.2 Primers of PVX，PVY and PSTVd virus detection

2 結(jié)果與分析

2.1 amiR-P25、amiR-HCPro、amiR-Virp1前體的構(gòu)建

以擬南芥DNA為模板，特異性引物(amiR-P25-F/amiR-P25-R，amiR-HCPro-F/amiR-HCPro-R，amiR-Virp1-F/amiR-Virp1-R)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擬南芥pre-miR159a分別改造為pre-amiR-P25、pre-amiR-HCPro、pre-amiR-Virp1，均得到大小為239 bp的條帶(圖2)，與所預(yù)測的片段大小相符。

2.2 p1300-221-amiR-P25-HCPro-Virp1植物表達(dá)載體的構(gòu)建

連接后的pre-amiR-P25-HCPro-Virp1序列克隆到pMD18-T載體上，為了與目的載體連接，擴(kuò)增序列時在引物中引入了EcoR Ⅰ和PstⅠ位點(diǎn)。本試驗采用的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-221雙元載體，構(gòu)建載體時用EcoR Ⅰ和PstⅠ雙酶切p1300-221質(zhì)粒及pMD18-T-pre-amiR-P25-HCPro-Virp1，回收兩片段并進(jìn)行連接，經(jīng)PCR及不同的酶切驗證，結(jié)果表明載體構(gòu)建正確(圖3)。p1300-221-pre-amiR-P25-HCPro-Virp1載體構(gòu)建圖譜見圖4。

2.3 轉(zhuǎn)amiR-P25-HCPro-Virp1植株獲得

農(nóng)桿菌侵染后的費(fèi)烏瑞它微型薯片在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d后，薯塊邊緣逐漸泛綠，21 d后，薯片顏色加深，轉(zhuǎn)為深綠，當(dāng)培養(yǎng)至28 d左右時，在薯塊表面形成多個生長點(diǎn)，繼續(xù)培養(yǎng)至生長點(diǎn)發(fā)展成再生芽，再生芽長至1.5～2.0 cm時，剪下來接入添加50 mg/L Hyg的MS培養(yǎng)基中(圖5)。

2.4 T0植株P(guān)CR檢測

費(fèi)烏瑞它微型薯片經(jīng)含amiR-P25-HCPro-Virp1質(zhì)粒農(nóng)桿菌侵染、再生、壓力篩選，抗性植株分化及植株壯苗共獲得轉(zhuǎn)化株系15株，用amiR-P25-HCPro-Virp1特異性引物對轉(zhuǎn)化株系PCR檢測。檢測結(jié)果如圖6所示，有10個轉(zhuǎn)化株系擴(kuò)增出與質(zhì)粒正對照同樣大小約729 bp的片段，而未轉(zhuǎn)化植株沒有擴(kuò)增片段，可以初步說明amiR-P25-HCPro-Virp1基因轉(zhuǎn)化至馬鈴薯中。

2.5 T0轉(zhuǎn)化植株的qRT-PCR檢測

為檢測amiR-P25-HCPro-Virp1基因在馬鈴薯植株中的表達(dá)水平，對PCR陽性轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行qRT-PCR檢測。各轉(zhuǎn)化株系相對表達(dá)量如圖7所示，amiR-P25-HCPro-Virp1基因在10個轉(zhuǎn)化植株中均有所表達(dá)，從相對表達(dá)量來看，各轉(zhuǎn)化株系間相對表達(dá)量差異顯著，9號轉(zhuǎn)化株系相對表達(dá)量最高為21.37，1號轉(zhuǎn)化株系最低為7.68。

2.6 T0轉(zhuǎn)化植株病毒抗性評價

PVX、PVY和PVSTd病毒等比例混合液摩擦接種轉(zhuǎn)化植株感病情況如圖8。接種病毒混合液后費(fèi)烏瑞它未轉(zhuǎn)化植株矮小，節(jié)間縮短，葉緣上卷，葉片斑駁；隨著植株的生長感染植株會出現(xiàn)花期滯后，少量塊莖表皮裂口等情況。轉(zhuǎn)amiR-P25-HCPro-Virp1植株則生長正常，葉片嫩綠、平展，塊莖表皮光滑。

接種病毒混合液20 d后取葉分別以PVX、PVY、PVSTd檢測引物進(jìn)行RT-PCR檢測結(jié)果如圖9，在未轉(zhuǎn)化對照植株中分別檢測到與PVX病毒基因長度一致的711 bp片段(圖9-A)，與PVY病毒基因長度一致的450 bp片段(圖9-B)，與PVSTd病毒基因長度一致的356 bp片段(圖9-C)，而接種病毒混合液的轉(zhuǎn)化植株未出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶。這表明，轉(zhuǎn)amiR-P25-HCPro-Virp1基因植株對PVX、PVY、PVSTd這3種病毒具有抗性。

3 結(jié)論與討論

合適的植物內(nèi)源miRNA前體骨架是獲得amiRNA前體的基礎(chǔ)[19]。已有研究表明，miR156、miR159、miR164、miR165、miR167、miR169、miR171、miR172、miR319、miR528等多個植物內(nèi)源miRNA被用于構(gòu)建人工miRNA骨架[20-24]。 盡管在amiRNA構(gòu)建中最好是用自身固有的miRNA前體作為骨架，然而目前已被證實功能的前體骨架中并沒有馬鈴薯內(nèi)源miRNA前體，而擬南芥中已有多個miRNA前體骨架被證明具有加工功能且已經(jīng)應(yīng)用到多種外源作物中，艾濤波[25]通過比較擬南芥miR159a、miR167b、miR171a 3種前體骨架沉默效率結(jié)果表明，與pre-miR167b和pre-miR171a相比，miR159a的莖環(huán)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，更容易被DCL1 所識別，提高了miR159a沉默靶基因的效率，且以miR159a為前體構(gòu)建的靶向體用于抗PVX和PVY的amiRNA已有研究，本研究以擬南芥miR159a為前體骨架分別改造并構(gòu)建了amiR-P25、amiR-HCPro和amiR-Virp1，為進(jìn)一步構(gòu)建兼抗PVX、PVY和PSTVd表達(dá)載體奠定基礎(chǔ)。

人工miRNA序列與目的基因靶序列之間的互補(bǔ)性對于轉(zhuǎn)化植株的抗病能力至關(guān)重要[26-27]。本研究設(shè)計P25、HC-Pro、Virp1基因人工miRNA序列時利用在線軟件WMD進(jìn)行設(shè)計同時也參考了這3個基因測序中出現(xiàn)頻率較高的位點(diǎn)，最大程度保證了沉默效率。自amiRNA技術(shù)應(yīng)用于植物基因工程以來，己有多項研究報道了向植物體中轉(zhuǎn)入amiRNA不僅可以改變植物的表型特征，還能使植物獲得抗病毒特性以及其他優(yōu)良特性，如煙草[28]、黃瓜[29]、草莓[30]、番茄[13]，馬鈴薯[31]等。如果將2種或2種以上針對不同病毒基因的amiRNA轉(zhuǎn)入同一植物中，可同時沉默多個基因，進(jìn)而使植物獲得2種或2種以上病毒的抗性[32]。Ai等[33]構(gòu)建了靶向PVX、PVY的amiR-P25-HC-Pro表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，使轉(zhuǎn)化植株獲得同時抗 PVX 和 PVY 的雙重抗性。Kung等[34]將西瓜銀斑駁病毒(WatermelonsilvermottlevirusWSMoV)中的5個靶向區(qū)段A、B1、B2、C、D和 E中的AB1E和B2DC構(gòu)建了amiRNA表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化植株對WSMoV具有完全抗性。

已有研究表明，PVX和PVY復(fù)合侵染會產(chǎn)生協(xié)同作用而使植株的病情加重[35]，PVY和PSTVd混合感染會導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量下降加劇[17]。本研究中，費(fèi)烏瑞它未轉(zhuǎn)化植株感染病毒混合液后同時檢測到了PVX、PVY和PSTVd，這表明病毒混合液中3種病毒(類病毒)均具感染性，本研究未對非轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PVX、PVY和PSTVd的定量分析，因此，無法判斷三者之間感染力的差別。在今后工作中，將進(jìn)一步完善此方面的研究。此外，本研究僅對T0轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行了抗性研究，且轉(zhuǎn)化株系表現(xiàn)出兼抗PVX、PVY和PSTVd的特性，然而Petchthai等[36]在amiRNA獲得兼抗煙草研究建蘭花葉病毒 (CymMV)和齒蘭環(huán)斑病毒 (ORSV) 中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)4轉(zhuǎn)基因煙草對CymMV表現(xiàn)100%抗性，而對ORSV僅有16%的抗性。分析原因，可能與前體骨架選擇及病毒中存在沉默抑制子有關(guān)。盡管本研究優(yōu)選擬南芥miR159a為前體骨架，且設(shè)計amiRNA時針對3種病毒(類病毒)的沉默抑制子，仍會繼續(xù)評價高世代轉(zhuǎn)化植株兼抗病毒特性和穩(wěn)定性。

本研究針對馬鈴薯PVX、PVY、PVSTd蛋白的P25、HC-Pro、Virp1基因，以擬南芥pre-miR159a為骨架分別構(gòu)建靶向這3個基因的amiRNA，并構(gòu)建植物表達(dá)載體p1300-221-pre-amiR-P25-HCPro-Virp1，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化費(fèi)烏瑞它脫毒微型薯片，經(jīng)抗性篩選、PCR檢測共獲得10株陽性轉(zhuǎn)化植株，熒光定量PCR結(jié)果表明，外源基因在陽性轉(zhuǎn)化植株中均有表達(dá)。對T0陽性轉(zhuǎn)化植株摩擦接種病毒混合液接結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化植株對PVX、PVY和PVSTd混合感染下具有兼抗的特性。