殷 實(shí)，王 斌，曲尼拉姆，楊柳青，袁鈺潔，李 鍵，2，3

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041； 2.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041； 3.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；4.西南民族大學(xué) 現(xiàn)代生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

組蛋白乙?；羌?xì)胞內(nèi)染色質(zhì)修飾的一種重要方式，正常情況下細(xì)胞內(nèi)的組蛋白乙?；胶庥山M蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HDACs)和組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(Histone acetylases，HATs)共同維持，HDACs能夠移除組蛋白賴(lài)氨酸上的乙酰化基團(tuán)，使組蛋白所帶的正電荷增加，進(jìn)而促進(jìn)其與帶負(fù)電的DNA分子間的結(jié)合變的緊密，使染色質(zhì)由松弛轉(zhuǎn)變成凝集狀態(tài)并促使基因沉默[1-2]，而HATs則執(zhí)行相反的過(guò)程，由此可見(jiàn)，組蛋白的乙酰化調(diào)控對(duì)于細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及染色質(zhì)構(gòu)象的改變等過(guò)程至關(guān)重要。

HDACs分為Ⅰ類(lèi) (HDAC1、HDAC2、HDAC8)、 Ⅱ類(lèi) (HDAC4-7、HDAC9、HDAC10)、 Ⅲ類(lèi) (Sirtuins) 及Ⅳ類(lèi) (HDAC10)[3]。Histone deacetylases 2 (HDAC2) 屬于Ⅰ類(lèi)HDAC，已有文獻(xiàn)報(bào)道HDAC2參與了多個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程，例如HDAC2對(duì)小鼠的胚胎及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育至關(guān)重要。Hdac2突變的小鼠具有較高的胚胎致死率，存活下來(lái)的小鼠體質(zhì)量、大腦質(zhì)量及生育力與野生型小鼠相比均明顯下降[4-5]，而過(guò)表達(dá)Hdac2則會(huì)損害小鼠突觸的可塑性及記憶的穩(wěn)定性[6]；HDAC2在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中也扮演著重要角色，在大腸癌及胰腺癌等腫瘤細(xì)胞中敲除HDAC2會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停滯并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7-8]。

精子發(fā)生的順利進(jìn)行是維持雄性動(dòng)物生殖能力的重要條件，在這一過(guò)程中大量基因的表達(dá)發(fā)生了變化，與此同時(shí)，染色體構(gòu)象以及組蛋白的結(jié)構(gòu)也發(fā)生了劇烈變化[9-10]。在小鼠等模式動(dòng)物中的研究表明，精子發(fā)生的過(guò)程需要組蛋白去乙?；木_調(diào)控，例如在雄性小鼠腹腔內(nèi)注射HDACs抑制劑苯丁酸鈉后圓形精細(xì)胞形態(tài)異常[11]；生殖細(xì)胞缺失組蛋白去乙?；窼IRT1的小鼠無(wú)法繁育，其睪丸與正常小鼠相比明顯變小，減數(shù)分裂進(jìn)程延遲，且出現(xiàn)大量形狀異常的精子[12]。牦牛(Bosgrunniens)是一種主要在我國(guó)青藏高原上活動(dòng)的特有動(dòng)物，是牧民重要的交通運(yùn)輸工具，也是其重要的經(jīng)濟(jì)來(lái)源[13]。然而野生牦牛的初次交配成功率不到40%[14]，雄性牦牛直到4～5歲才發(fā)育至性成熟[15]。 因此，對(duì)牦牛的繁殖性能進(jìn)行研究對(duì)于青藏高原人民生活水平的提高和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有推動(dòng)作用。本試驗(yàn)將通過(guò)基因克隆的方法獲得牦牛的HDAC2基因，對(duì)基因的保守性及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，并檢測(cè)HDAC2的mRNA在牦牛睪丸中的表達(dá)及定位。本研究對(duì)后續(xù)研究HDAC2在牦牛精子發(fā)生中的作用提供了一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

采樣地點(diǎn)為成都市青白江區(qū)屠宰場(chǎng)。依據(jù)齒齡將牦牛劃分為幼年組(0.5～1歲)、成年組(3～5歲)及老年組(7～9歲)。用無(wú)菌剪刀采集斷頸剖腹后的成年組牦牛肝臟、腎臟、肺、胃、脾臟、腦、心臟及卵巢組織，并采集各時(shí)間段牦牛睪丸組織(n=3)。分離下的組織用無(wú)菌剪刀剪成1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小，立即轉(zhuǎn)移至-80 ℃液氮罐中保存。對(duì)于要進(jìn)行原位雜交的組織，立即放于4%多聚甲醛(無(wú)RNA酶)中進(jìn)行固定。

1.2 主要試劑及儀器

TRIzol(Invitrogen)；PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)；Premix TapTMDNA聚合酶(TaKaRa)；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa)；pMD19-T載體(TaKaRa)；DNA膠回收試劑盒(TIANGEN)；DEPC H2O(TIANGEN)；感受態(tài)細(xì)胞DH5α(TIANGEN)；Real-time PCR Master (ROX)(Roche)；CISH試劑盒(上海歌凡生物有限公司)；紫外分光光度計(jì)(NanoDrop)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.3 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

各組織總RNA通過(guò)TRIzol進(jìn)行提取，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定的260，280 nm 吸光值的比值在1.8～2.0的RNA樣品可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。反轉(zhuǎn)錄體系20 μL：RNA樣品1 μL，gDNA Purge 1 μL，NovoScript Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 10 μL，RNase Free Water 8 μL。反應(yīng)條件：50 ℃孵育30 min，75 ℃孵育5 min，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.4 基因克隆測(cè)序

依據(jù)參考GenBank中黃牛HDAC2基因序列(登錄號(hào)：NM_001075146.1)(表1)設(shè)計(jì)克隆引物，以牦牛肝臟cDNA為模板，通過(guò)普通PCR進(jìn)行牦牛HDAC2基因的克隆。反應(yīng)體系如下：2×LA Taq Master Mix 12.5 μL；上、下游引物及模板cDNA各1 μL；ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，38個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。將產(chǎn)物與pMD19-T載體在16 ℃條件下連接15 h，之后與感受態(tài)細(xì)胞混合并在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h，離心后將沉淀菌液均勻涂到含有0.1%氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取白色單菌落接種于液態(tài)LB培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)8 h，隨后選陽(yáng)性菌株交由南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

牦牛HDAC2基因及氨基酸序列的預(yù)測(cè)，以及同源性比對(duì)分析由DNAMAN 8軟件完成。通過(guò)MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，通過(guò)ProtParam、ProtScale、NetPhos 3.1、PSIPRED、Pfam 以及SWISS MODE分別預(yù)測(cè)牦牛HDAC2蛋白的基本理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)。

1.6 熒光定量PCR(Real-time PCR)

牦牛各組織及不同時(shí)期睪丸的cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系為15 μL：模板cDNA及上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 7.5 μL，ddH2O 5.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性2 min；95 ℃ 變性10 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 30 s，其中變性、退火和延伸共持續(xù)40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.7 反轉(zhuǎn)錄PCR (Reverse transcription PCR，RT-PCR)

以牦牛不同時(shí)期睪丸的cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參基因。 反應(yīng)體系：2×LA Taq Master Mix 12.5 μL；上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)；模板1 μL(800～1 000 ng/μL)；ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃ 7 min。其中變性、退火及延伸共持續(xù)38個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物信息Tab.1 The information about PCR primers

1.8 色素原位雜交(Chromogenicin Situ Hybridization，CISH)

原位雜交的步驟參照CISH試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，主要步驟如下：石蠟包埋后的組織切片常規(guī)脫蠟至水洗，隨后用30% H2O2及純甲醇按照1∶9的比例配制混合液，室溫處理10 min，玻片置于濕盒內(nèi)，滴加0.25%鹽酸，常溫孵育15 min；蛋白酶 K 覆蓋組織并于37 ℃處理 20 min，0.1 mol/L 甘氨酸洗1 min；4% PFA 固定10 min，分別用乙酸酐(pH值8.0)及5×SSC(Saline Sodium Citrate，檸檬酸鈉)(pH值7.5)清洗，預(yù)雜交液覆蓋組織并于65 ℃預(yù)雜交 1 h，用連接了地高辛的探針(500 ng/mL)覆蓋切片，65 ℃暗中雜交48 h，封閉液覆蓋切片，室溫反應(yīng)30 min；滴加生物素地高辛抗體，37 ℃反應(yīng)60 min；滴加 SABC(Strept Avidin-Biotin Complex，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物)，37 ℃反應(yīng)20 min；滴加生物素化過(guò)氧化物酶，37 ℃反應(yīng)20 min，DAB(3,3′-diaminobenzidine,二氨基聯(lián)苯胺)顯色，蘇木精染核。HDAC2的探針序列：5′-CACAAGCTATTCGTTTGTCTGATGCTCGAATAGAAATTCTCTTGT-3′，一個(gè)線(xiàn)蟲(chóng)的非特異性序列探針作為陰性對(duì)照(Negative control，NC)，其序列為5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用One-way ANOVA (Tukey′s 多重比較檢驗(yàn))分析數(shù)據(jù)的顯著性差異。結(jié)果以平均值標(biāo)準(zhǔn)誤形式表示，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛HDAC2基因的序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)克隆得到的HDAC2序列進(jìn)行分析表明，牦牛HDAC2基因的ORF(Open reading frame，開(kāi)放閱讀框)一共為1 467 bp，編碼488個(gè)氨基酸(圖1)，序列的同源性分析結(jié)果表明，其與黃牛(Bostaurus)和野牛(Bisonbison)的基因及氨基酸序列相似度最高，均為100%，與馬(Equuscaballus)、野豬(Susscrofa)、白鰭豚(Lipotesvexillifer)、羊駝(Vicugnapacos)和人(Homosapiens)中HDAC2的序列相似度也均在90%以上 (表2、圖2)。

表2 牦牛與部分物種HDAC2核苷酸及氨基酸的序列同源性比對(duì)Tab.2 Alignment of HDAC2 nucleotide and amino acid sequences between yak and some species

氨基酸組成分析表明，HDAC2 蛋白由20種氨基酸構(gòu)成，其中所占比例最高的為甘氨酸(Gly，9.0%)、賴(lài)氨酸(Lys，8.2%)、天冬氨酸(Asp，8.0%)及谷氨酸(Glu，8.0%)(表3)。在所有氨基酸中，帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)有63個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp+Glu)有78個(gè)，由此可得，HDAC2蛋白整體上帶負(fù)電。HDAC2的最大疏水性指數(shù)為2.967，最小疏水性指數(shù)為-3.367，分別位于第161及454位氨基酸，其平均親水指數(shù)為-0.713(圖3)，由此表明，HDAC2具有疏水脂溶性蛋白的特點(diǎn)。蛋白修飾位點(diǎn)分析表明，牦牛HDAC2 蛋白中一共含有50個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)，其中絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)分別為21，14，15個(gè)(圖4)。牦牛HDAC2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)成，其比例分別占38.73%，9.22%,52.05%，同時(shí)該蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽(圖5-A)。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HDAC2含有一個(gè)組蛋白去乙?；附Y(jié)構(gòu)域(圖5-B)，HDAC2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)相吻合(圖5-C)。

表3 牦牛HDAC2蛋白氨基酸組成Tab.3 The amino acids composition of yak HDAC2 protein

2.2 牦牛HDAC2 mRNA在各組織中的表達(dá)情況

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果表明，在所檢測(cè)的9個(gè)牦牛組織中均發(fā)現(xiàn)有HDAC2mRNA的表達(dá)，其中在卵巢和睪丸中表達(dá)顯著高于其他組織，在腦、心臟和脾臟中的表達(dá)次之，在胃、肺、腎臟及肝中表達(dá)顯著低于其他組織(圖6)。

2.3 HDAC2在牦牛不同發(fā)育時(shí)期睪丸中的表達(dá)和定位

利用RT-PCR檢測(cè)了HDAC2在不同發(fā)育階段(幼年期、成年期及老年期)睪丸中的表達(dá)，結(jié)果表明，HDAC2在幼年期牦牛睪丸中的表達(dá)量最高，在成年期及老年期表達(dá)量較低(圖7)。原位雜交結(jié)果表明，HDAC2mRNA 在牦牛睪丸的非生殖類(lèi)細(xì)胞支持細(xì)胞及睪丸間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中均有所表達(dá)，在生殖類(lèi)的精原細(xì)胞及精母細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了HDAC2的表達(dá)。然而HDAC2不在精細(xì)胞中表達(dá)(圖8)。

3 討論與結(jié)論

HDAC2所屬的組蛋白去乙?；讣易迨且活?lèi)影響細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；降闹匾割?lèi)[2，16]，已有報(bào)道HDAC2參與了人和小鼠等模式動(dòng)物的胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及腫瘤生成等生物學(xué)過(guò)程[4-8]，然而有關(guān)牦牛HDAC2的信息知之甚少。本研究克隆了牦牛HDAC2的CDS序列，并分析了該序列的保守型及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)，同時(shí)檢測(cè)了HDAC2的mRNA在牦牛睪丸中的表達(dá)及定位。

生物信息學(xué)的分析結(jié)果表明，牦牛HDAC2基因序列的保守性較高。HDAC2蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)剛好證實(shí)了這一點(diǎn)。在牦牛HDAC2蛋白中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)保守的組蛋白去乙?；复呋Y(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域廣泛存在于Ⅰ型去乙酰化酶的不同成員中，通過(guò)與鋅離子結(jié)合催化賴(lài)氨酸進(jìn)行去乙?；痆17-19]。此外，牦牛HDAC2的蛋白結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)潛在的磷酸化修飾位點(diǎn)，暗示該蛋白可能受到磷酸化調(diào)控。已有研究表明，HDAC2的磷酸化參與了多個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程，例如在大鼠中熱休克蛋白70(Heat Shock Protein 70，HSP70)能夠通過(guò)磷酸化HDAC2導(dǎo)致心肌肥大[20]，在小鼠中HDAC2 能夠通過(guò)其第394位絲氨酸的磷酸化與叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型3a(Forkhead box O3，F(xiàn)OXO3A)形成復(fù)合體，在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠小腦顆粒神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮重要作用[21]。本研究預(yù)測(cè)的牦牛HDAC2蛋白結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域及轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)為后續(xù)進(jìn)一步研究牦牛HDAC2的功能提供了一定的研究基礎(chǔ)。

在不同組織中的表達(dá)檢測(cè)表明，HDAC2的轉(zhuǎn)錄本在卵巢中的水平較高，提示HDAC2可能參與了牦牛卵巢發(fā)育的調(diào)控。研究表明，在小鼠的卵母細(xì)胞中敲除Hdac2會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞的著絲粒出現(xiàn)異常，導(dǎo)致其無(wú)法完成減數(shù)分裂并進(jìn)而引起小鼠不孕等[22]；在家貓卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中HDAC2會(huì)從細(xì)胞核的核質(zhì)向核仁轉(zhuǎn)移，這一過(guò)程對(duì)于GV期卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的沉默及卵子的成熟是必需的[23]。而HDAC2是否參與牦牛卵母細(xì)胞的成熟依然有待進(jìn)一步研究。

HDAC2 的轉(zhuǎn)錄本在牦牛睪丸的除精細(xì)胞和精子之外的各類(lèi)細(xì)胞中均有表達(dá)，這與小鼠睪丸中HDAC2的表達(dá)分布類(lèi)似[24]。研究表明：精母細(xì)胞向精子轉(zhuǎn)變的過(guò)程中組蛋白需要被魚(yú)精蛋白所替代，這一過(guò)程需要核心組蛋白H3及H4 多個(gè)賴(lài)氨酸位點(diǎn)的高度乙?；痆25]。推測(cè)精細(xì)胞中缺少HDAC2很可能是為了保證組蛋白H3及H4 高度乙?；倪M(jìn)行，進(jìn)而保證組蛋白能夠被順利的替換。HDAC2蛋白在牦牛睪丸中的表達(dá)隨年齡的增長(zhǎng)不斷降低，推測(cè)這可能與不同階段睪丸本身的細(xì)胞組成有關(guān)，幼年期的牦牛睪丸中以精原干細(xì)胞和精原細(xì)胞為主，缺少成熟的精細(xì)胞，而隨著個(gè)體年齡的增加，精細(xì)胞所占比例持續(xù)增加[26]，因此，成年期中HDAC2mRNA水平的下調(diào)很可能是由于該階段睪丸中精細(xì)胞比例的增高所致；而在老年期牦牛睪丸中各類(lèi)生精細(xì)胞的數(shù)量急劇下降[27]，這可能是導(dǎo)致該階段HDAC2表達(dá)下降的一個(gè)重要原因。

牦牛HDAC2基因的開(kāi)放閱讀框包含1 467個(gè)堿基，編碼488個(gè)氨基酸。牦牛HDAC2基因在哺乳動(dòng)物中高度保守，預(yù)測(cè)的牦牛HDAC2蛋白是一個(gè)疏水脂溶性蛋白，包含一個(gè)組蛋白去乙?；附Y(jié)構(gòu)域和多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，在幼年期睪丸組織中牦牛HDAC2mRNA的表達(dá)較高，其定位除精細(xì)胞之外的各類(lèi)睪丸細(xì)胞中。本研究對(duì)于未來(lái)深入探討HDAC2對(duì)牦牛雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供了一定的參考數(shù)據(jù)。