鐘 誠(chéng)

（惠州市中心人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 廣東 惠州 516001）

夫精人工授精（AIH）是指通過非性交方式將丈夫精液優(yōu)化處理，去除精漿，使精子優(yōu)化獲能后，注入女性生殖道內(nèi)，從而使精卵自然受精達(dá)到妊娠的目的。與體外受精-胚胎移植（IVF-ET）、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）等輔助生殖技術(shù)相比，人工授精因其授精方式更接近自然受孕，故具有操作簡(jiǎn)便、手術(shù)創(chuàng)傷少、治療費(fèi)用低廉、患者并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，容易被患者所接受。人工授精臨床妊娠率受女方年齡、男方精液質(zhì)量等因素影響較大，其中男方因素中，精液優(yōu)化處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)是影響臨床妊娠率的主要因素[1]。本文擬探討精液優(yōu)化處理后的孵育時(shí)間是否與臨床妊娠率存在相關(guān)性，從而為臨床實(shí)踐提供指導(dǎo)。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月—10月在我院生殖醫(yī)學(xué)中心行夫精人工授精的不孕不育患者，共200例。記錄男方精液優(yōu)化處理結(jié)束后至行宮腔內(nèi)人工授精手術(shù)間的時(shí)間，即精液孵育時(shí)間，孵育時(shí)間為0～30 min分為A組100例，孵育時(shí)間為31～60 min分為B組100例。患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）女方年齡≤35歲，時(shí)段內(nèi)的首個(gè)人工授精周期；（2）女方至少有一側(cè)輸卵管通暢，存在優(yōu)勢(shì)卵泡；（3）男女雙方均符合夫精人工授精的適應(yīng)證[2]；（4）男方精液優(yōu)化處理方法為密度梯度離心法。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）男方精液優(yōu)化處理后前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）百分率＜90%；（2）男方精液優(yōu)化處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)＜5×106；（3）男女任一方患有嚴(yán)重精神疾病、泌尿生殖系統(tǒng)急性感染；（4）男女任一方具有吸毒等不良嗜好。

1.2 方法

1.2.1精液優(yōu)化處理 男方禁欲2～7 d，于人工授精日當(dāng)天手淫取精，留取全部精液于無菌取精杯。待精液完全液化后，采用密度梯度離心法對(duì)精液進(jìn)行優(yōu)化處理。用SpermRinse洗精液將SpermGrad梯度液稀釋成90%和45%兩種濃度梯度液，火焰消毒巴氏吸管，15 mL錐形離心管底部加入1.5 mL 90%梯度液，再在其上部緩慢加入1.5 mL 45%梯度液。最后在45%梯度液的表層再緩慢加入2～4 mL液化后的精液。如患者精液量大于4 mL，則分置于2管含梯度液的離心管中。500 g離心20 min，去除精漿和梯度液，將底部沉淀加入另一支裝有2 mL洗精液的離心管內(nèi)，混勻，500 g離心5 min。棄上清，將沉淀重懸于0.5 mL洗精液中，同時(shí)取5μL樣本，計(jì)數(shù)精子濃度、總活力及前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)。

1.2.2人工授精方法 患者術(shù)前排空膀胱，取膀胱截石位，用生理鹽水清洗外陰、陰道，拭凈宮頸分泌物。窺器暴露宮頸，將優(yōu)化處理后的0.5 mL精子懸液用人工授精導(dǎo)管通過宮頸緩慢注入宮腔內(nèi)。術(shù)后14 d測(cè)血β-HCG陽性為生化妊娠，5～6周B超見孕囊確定臨床妊娠。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）女方年齡：分別記錄每例女性患者行人工授精術(shù)時(shí)的年齡；（2）前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)：精液優(yōu)化處理后，取5μL樣本，運(yùn)用西班牙SCA全自動(dòng)精子質(zhì)量分析儀，按照世界衛(wèi)生組織（WHO）第五版《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》標(biāo)準(zhǔn)行精液常規(guī)分析，計(jì)數(shù)精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率等指標(biāo)，計(jì)算前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)。前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)=精子濃度（106/mL）×優(yōu)化處理后精子懸液量（mL）×前向運(yùn)動(dòng)精子百分率（%）；（3）臨床妊娠率：依據(jù)血β-HCG及B超結(jié)果確定臨床妊娠例數(shù)，計(jì)算A、B兩組的臨床妊娠率。臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/人工授精總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（± s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組女方年齡、精液優(yōu)化處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)比較

兩組女方年齡、精液優(yōu)化處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組女方年齡、精液優(yōu)化處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)比較（ ± s）

表1 兩組女方年齡、精液優(yōu)化處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)比較（ ± s）

組別 例數(shù) 女方年齡/歲前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)/×106 A組 100 30.71±4.60 14.11±5.97 B組 100 29.93±3.42 15.54±5.51 t 0.732 0.455 P 0.467 0.650

2.2 兩組臨床妊娠率比較

A組臨床妊娠率22.00%，高于B組的10.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組臨床妊娠率的比較

3.討論

近年來，受生活工作壓力增大、環(huán)境改變、婚育年齡推遲等因素的影響，不孕不育發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。有調(diào)查顯示，在我國(guó)育齡夫婦中，發(fā)病率已高達(dá)25%[3]。人工授精適用于男方輕度少弱精、精液液化異常、性功能障礙、女方宮頸因素異常、生殖道畸形、免疫性不育、原因不明不育等的助孕治療。雖然人工授精具有操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、并發(fā)癥少、易于被患者接受等優(yōu)點(diǎn)，但是與IVF、ICSI等助孕方式相比，臨床妊娠率較低。受患者不孕原因等因素的影響，不同的生殖中心治療周期臨床妊娠率差異較大，為5.9%～23%[4]。既往有關(guān)夫精人工授精臨床妊娠率影響因素的研究，多側(cè)重于臨床相關(guān)因素的研究，多提示治療周期數(shù)、優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)、女方年齡、不孕年限、促排卵方案、子宮內(nèi)膜厚度等是重要的影響因素[5-7]。

目前，實(shí)驗(yàn)室常用的人工授精精液優(yōu)化處理方法有上游法和密度梯度離心法。上游法適用于精子濃度及活力等參數(shù)較好的精液標(biāo)本，利用前向運(yùn)動(dòng)精子向上游動(dòng)，從而達(dá)到與死精子、畸形精子及白細(xì)胞分層分離的目的。密度梯度離心法利用不同成熟階段精細(xì)胞密度不同的特點(diǎn)，通過在梯度液中離心，達(dá)到分離成熟精子的目的。與上游法相比，密度梯度離心法具有更高的精子回收率，也能更好地分離前向運(yùn)動(dòng)精子與精漿雜質(zhì)等成分。與此同時(shí)，相比上游法，密度梯度離心法由于經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間離心的過程，可能會(huì)對(duì)精子造成潛在的損傷，如精子膜的破壞、頂體不完整，同時(shí)死精子比例增高[8]。本文中，兩組精液標(biāo)本均采用密度梯度離心法對(duì)精液標(biāo)本進(jìn)行優(yōu)化處理，兩組精液優(yōu)化處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，臨床妊娠率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示精液優(yōu)化處理后孵育時(shí)間過長(zhǎng)，可能會(huì)對(duì)精液參數(shù)造成負(fù)面影響，從而影響臨床結(jié)局。既往研究均提示精液優(yōu)化處理后至行人工授精術(shù)時(shí)間間隔過長(zhǎng)，會(huì)對(duì)精液參數(shù)及臨床結(jié)局產(chǎn)生負(fù)面影響[9-13]。精液優(yōu)化處理的離心過程對(duì)精子損傷造成的負(fù)面影響，可能會(huì)隨著處理后孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而加劇。精液優(yōu)化處理后孵育時(shí)間過長(zhǎng)，精液中氧自由基含量增加，氧自由基通過損傷精子細(xì)胞膜、減低線粒體ATP產(chǎn)生從而減低精子運(yùn)動(dòng)能力。同時(shí)，孵育時(shí)間過長(zhǎng)，精子DNA碎片率也會(huì)相應(yīng)增高，從而對(duì)精子的受精能力產(chǎn)生影響。

綜上所述，夫精人工授精精液優(yōu)化處理后孵育時(shí)間控制在30 min以內(nèi)，能改善臨床結(jié)局?；诒緲颖玖可俚木窒扌裕诖嘀行母髽颖玖?，得出更為確切的結(jié)論，以便為實(shí)際臨床工作提供指導(dǎo)。