顧崇梅，郭華榮，李 瑤，陳慧潔

（酒泉市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 酒泉 735000）

金水咳喘康膠囊由黃芪、人參、肉桂、蛇床子、當(dāng)歸、沙參等13 味中藥組成，長(zhǎng)期服用可降低患者秋冬季慢性支氣管炎發(fā)作次數(shù)、時(shí)間、程度，療效理想，方中蛤蚧、人參、黃芪、蛇床子、金櫻子、肉桂功效補(bǔ)肺益腎，納氣定喘，貝母、黃精、百合功效潤(rùn)肺健脾、止咳化痰，地龍、水蛭、當(dāng)歸功效活血逐瘀、滌清頑痰伏飲，但目前其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅停留在顯微鑒別和貝母甲素、貝母乙素TLC鑒別上，不能全面反映其內(nèi)在質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)選擇金水咳喘康膠囊君藥黃芪、當(dāng)歸、肉桂、蛇床子中的主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷［1-3]、阿魏酸［4-6]、桂皮醛［7-8]、蛇床子素［9]作為指標(biāo)，通過HPLC 法同時(shí)測(cè)定四者含量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Waters e2695，配置DAD 檢測(cè)器（美國Waters 公司）；MS205DU 電子天平［梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]；KH-250DB 超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)111920-201505，純度97.1%）、阿魏酸（批號(hào)110773-201915，純度99.4%）、桂皮 醛（批號(hào)110710-201217，純度99.5%）、蛇床子素（批號(hào)110822-201710，純度99.5%）對(duì)照品均購于中國食品藥品檢定研究院。金水咳喘康膠囊由酒泉市中醫(yī)院提供，陰性樣品為自制。乙腈為色譜純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇為分析純（天津化學(xué)試劑廠）；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent 5 HC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.086%磷酸（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm（0～16 min）、303 nm（16～20 min）、322 nm（20～25 min）、303 nm（25～33 min）；進(jìn)樣量20 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為2.005 6、5.017 5、50.231 2、6.112 2 mg/mL 的貯備液，甲醇定容至刻度，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為0.100 3、0.501 8、5.023 1、0.305 6 mg/mL）。

2.2.2 供試品溶液 將膠囊去除囊殼，取內(nèi)容物約6 g（相當(dāng)于樣品20 粒），精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入100 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，浸泡過夜后超聲（350 W、50 kHz）處理1 h，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 根據(jù)處方及制劑工藝，分別制備缺黃芪、缺當(dāng)歸、缺肉桂、缺蛇床子的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品溶液中各成分均在對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處有色譜峰，分離度均大于1.5，陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液2、4、6、10、16、10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of variouis constituents

2.3.3 檢測(cè)限、定量限考察 以S/N=3 為檢測(cè)限，S/N=10 為定量限，測(cè)得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素檢測(cè)限分別為0.930 1、0.220 1、0.180 3、1.170 1 ng，定量限分別為3.100 3、0.733 7、0.601 1、3.900 3 ng。

2.3.4 耐用性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素峰面積RSD 分別為2.19%、2.05%、1.85%、1.98%，保留時(shí)間RSD 分別為0.23%、0.18%、0.35%、0.41%，表明該方法耐用性良好。

2.3.5 中間精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，采用Agilent 1260、Waters e2695 色譜儀，以及Agilent 5 HC-C18、Waters Symmetry C18、InertSustain C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素含量RSD，結(jié)果見表3，可知該方法中間精密度良好。

表3 各成分中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of intermediate precision tests for various constituents

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批膠囊，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素含量RSD 分別為2.28%、1.82%、1.99%、2.15%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素含量RSD 分別為2.68%、2.11%、2.10%、2.35%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批膠囊6 份，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液（毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素質(zhì)量濃度分別為0.501 4、0.301 1、0.803 7、2.139 3 mg/mL）各1 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定 取6 批膠囊，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，平行2 次，結(jié)果見表5。

表5 各成分含量測(cè)定結(jié)果Tab.5 Results of content determination of various constituents

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)甲醇-0.1%醋酸、乙腈-水、乙腈-0.086%進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)前兩者均不能同時(shí)檢測(cè)出毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素，而乙腈-0.086%磷酸可以，并且達(dá)到了完全分離的效果，故選擇其作為流動(dòng)相。

3.2 檢測(cè)方法選擇 金水咳喘康膠囊藥味多，組成復(fù)雜，單波長(zhǎng)、多波長(zhǎng)均無法有效排除不同成分之間的干擾，故本實(shí)驗(yàn)采用波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換法［10-16]進(jìn)行測(cè)定，效果理想。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 本實(shí)驗(yàn)采用DAD 檢測(cè)器，對(duì)供試品、陰性樣品溶液在190～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮葡萄糖苷在200、260 nm處有最大吸收，其中260 nm 處響應(yīng)值比較大，故確定為260 nm；阿魏酸在322 nm 處有最大吸收，同時(shí)在303 nm 處吸收也很大，而且色譜峰峰形更尖銳對(duì)稱，故確定為303 nm；桂皮醛在190～340 nm 處均有吸收，雖然290 nm 處吸收最大，但322 nm 處陰性干擾最小，故確定為322 nm；蛇床子素在303、322 nm 處均有最大吸收，其中303 nm 處陰性干擾最小，故確定為303 nm。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定金水咳喘康膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素的含量，該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，方法穩(wěn)定，重復(fù)性好，可作為該制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制的依據(jù)。