楊 丹，鄒 艷，劉 艷，徐 廣，朱曉富，鄧才富

（重慶市藥物種植研究所，重慶市道地藥材規(guī)范化生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，重慶 408400）

黨參為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.、素花黨參Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen 或川黨參Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根，具有補中益氣、生津養(yǎng)血、扶正祛邪的功效［1]，主要有效成分包括多糖類、揮發(fā)油類、炔苷類［2-4]等，主要活性包括抗氧化、增強免疫力、抗腫瘤［5]等。川黨參主要集中在湖北西部、重慶東部及四川東部，不同主產(chǎn)區(qū)其質(zhì)量狀況良好，作為我國出口藥材和中成藥生產(chǎn)中最常用的藥材之一，其質(zhì)量控制一直備受關(guān)注。重慶市巫山縣、巫溪縣、奉節(jié)縣及貴州省道真縣4 個產(chǎn)地川黨參的質(zhì)量差異不大，而湖北恩施與其他4 個產(chǎn)地的質(zhì)量差異較大［6]，不同主產(chǎn)區(qū)栽培土壤差異性是造成藥材質(zhì)量差異性最主要的原因之一，土壤酸堿性、微生物環(huán)境會直接影響藥材生長過程中生理指標(biāo)變化［7]，間接影響其有效成分含量及種類［8]等。同時，黨參產(chǎn)地加工方式等也是造成其質(zhì)量差異的原因［9]。目前，重慶黨參的種植現(xiàn)狀、質(zhì)量參差不齊、現(xiàn)行商品等級劃分不合理等存在一系列問題，為了探索不同主產(chǎn)區(qū)、栽培土壤對藥材質(zhì)量的影響，本實驗應(yīng)用HPLC-DAD對川黨參中黨參炔苷的含量進行分析，建立HPLC 指紋圖譜，根據(jù)化學(xué)模式評價結(jié)果，確定各主產(chǎn)區(qū)土壤因素及不同主產(chǎn)區(qū)之間藥材質(zhì)量差異性，以期提出科學(xué)、規(guī)范、合理的種植建議，為行業(yè)商品等級標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范化提供參考，為現(xiàn)代精準(zhǔn)扶貧項目和重慶市中藥材種植產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

1 材料

高效液相色譜儀LC-20AD、UV-2450 紫外分光光度計（日本島津公司）；純水儀（重慶摩爾水處理公司）；KQ3200DE 數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH8 恒溫數(shù)顯水浴鍋（上海汗諾儀器有限公司）；電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

川黨參信息見表1，經(jīng)重慶市藥物種植研究所鄧才富研究員鑒定為桔?？浦参锎h參Codonopsis pilosula，標(biāo)本保存于重慶市藥物種植研究所中藥材生產(chǎn)質(zhì)量控制研究中心。黨參炔苷（純度≥98%）。色譜純甲醇、乙腈及分析純D-葡萄糖對照品（阿拉丁試劑有限公司）；水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 黨參總多糖含量

2.1.1 葡萄糖對照品溶液制備 取D-無水葡萄糖對照品，105 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，精密稱取110 mg，置于100 mL量瓶中，加蒸餾水溶解定容至刻度，即得，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL“2.1.1”項下對照品溶液至10 mL 量瓶中，定容得系列質(zhì)量濃度溶液，分別精密量取1 mL 于試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫。取1 mL蒸餾水平行操作，作為空白對照，采用紫外-可見分光光度法在490 nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進行回歸，得方程A=8.037 8X-0.013 1（r=0.997 3），在1.10～110 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 參考文獻［9]，取樣品粉末2.0 g，精密稱定，置250 mL 圓底燒瓶中，加入80% 乙醇100 mL，水浴回流2 h，濾過，殘渣用80% 熱醇洗滌，濾過，殘渣放至室溫，將殘渣同濾紙放入錐形瓶中，加入蒸餾水50 mL，水浴提取2 h，離心，取上清液，殘渣及燒瓶用熱水10 mL 洗滌，洗液并入濾液，重復(fù)上述步驟，提取3 次，濃縮濾液定容至100 mL，取1 mL 稀釋至100 mL，即得。精密量取供試品溶液2 mL，按“2.1.1”項下方法測定吸光度，數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析（P＜0.05），結(jié)果見表2。

表2 各產(chǎn)區(qū)黨參總多糖含量（，n=3）

表2 各產(chǎn)區(qū)黨參總多糖含量（，n=3）

2.1.4 聚類分析 將16 批樣品中多糖含量進行預(yù)處理后，導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件，在Analyse 下進行聚類分析，見圖1，可知主要分為4 類，Ⅰ類包含2，Ⅱ類包含1、5～8、12，Ⅲ類包含4、10、17，Ⅳ類包括3、9、11、13～16。

圖1 16 批樣品聚類分析圖

2.2 黨參炔苷含量

2.2.1 色譜條件 參考文獻［10]，島津VP-ODS 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長268 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～7 min，5%A；7～15 min，5%～15%A；15～40 min，15%～30%A；30～45 min，30%～40%A；45～60 min，40%A；60～70 min，5%A）。

2.2.2 對照品溶液制備 取黨參炔苷對照品9.9 mg，甲醇溶解并定容50 mL 量瓶中，即得，置于4 ℃冰箱中備用。

2.2.3 供試品溶液制備 取樣品粉末0.5 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（250 W、40 kHz）提取30 min，甲醇補足減失質(zhì)量，濾過，取濾液，即得。在“2.2.1”項色譜條件下測定，計算含量，數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析（P＜0.05），見表3。

表3 各產(chǎn)地黨參炔苷含量（，n=3）

表3 各產(chǎn)地黨參炔苷含量（，n=3）

2.2.4 精密度試驗 精密吸取3 號供試品溶液10 μL，在“2.2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖，以黨參炔苷為參照峰，考察特征色譜峰保留時間和峰面積的一致性。結(jié)果，各共有峰相對保留時間RSD 均小于1%，共有峰峰面積RSD 小于2%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取3 號供試品溶液10 μL，在“2.2.1”項色譜條件下于0、4、8、12、24 h 進樣測定，記錄色譜圖，以黨參炔苷為參照峰，考察色譜峰保留時間和峰面積的一致性。結(jié)果，各共有峰相對保留時間RSD 均小于1%，共有峰峰面積RSD 小于3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 同時取3 號供試品6 份，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣10 μL 測定，記錄色譜圖，以黨參炔苷為參照峰，考察特征色譜峰保留時間和峰面積的一致性。結(jié)果，各共有峰相對保留時間RSD 均小于1%，共有峰峰面積RSD 小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的同一批樣品約0.25 g，共6 份，加入一定量對照品溶液。按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣，計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 黨參炔苷加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.3 指紋圖譜建立及相似度分析 在“2.2.1”項色譜條件下，建立了16 批樣品的HPLC 指紋圖譜（圖2），采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A 版）”軟件對圖譜進行處理，其中共有峰12 個。通過與圖3 比較，指認9 號峰為黨參炔苷，將其設(shè)為參照峰。各主產(chǎn)區(qū)指紋圖譜相似度均大于0.8，表明藥材整體化學(xué)成分相似，但個別含量可能存在較大差異。17 號樣品為市售，由于其質(zhì)量較各主產(chǎn)區(qū)相差較大，與其他樣品指紋圖譜相似度為0.568，故后續(xù)不以其為研究對象。

圖2 16 批樣品HPLC 指紋圖譜

圖3 黨參炔苷對照品HPLC 色譜圖

2.4 化學(xué)模式分析 將16 批樣品12 個色譜峰峰面積進行預(yù)處理后，以共有峰為變量，導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件進行聚類分析、主成分分析、OPLS-DA 分析，研究重慶不同主產(chǎn)區(qū)藥材質(zhì)量差異，以及各產(chǎn)區(qū)不同土壤栽培黨參的影響。

2.4.1 聚類分析 將16 批樣品12 個色譜峰峰面積進行預(yù)處理后，導(dǎo)入SIMCA 14.1 分析軟件進行聚類分析，見圖4，主要分為3 類，Ⅰ類包含1～2、5～9、11、15～16，Ⅱ類包括3～4、Ⅲ類包含10、12～14。

圖4 16 批樣品聚類分析圖

2.4.2 主成分分析 參考文獻［11]，將16 批樣品共有峰峰面積輸入Excel 表格，得到16×12 列的數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件進行主成分分析，見圖5，Ⅰ類包含1～2、5～9、11、15～16，Ⅱ類包括3～4，Ⅲ類包含10、12～14，與聚類分析結(jié)果一致，表明各主產(chǎn)區(qū)黨參質(zhì)量存在一定差異，同時部分同一產(chǎn)區(qū)由于栽培土壤不同，藥材質(zhì)量也存在相對差異。但各數(shù)據(jù)分布不集中，難以區(qū)分，因此需采用OPLS-DA 作進一步分析。

圖5 16 批樣品主成分分析圖

2.4.3 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）參考文獻［12] 進行OPLS-DA 分析，將16 批樣品共有峰面積導(dǎo)入SIMCA14.1 軟件進行OPLS-DA 分析，見圖6，可知模型參數(shù)R2X=0.993，R2Y=0.998，Q2=0.968，其中R2X 和R2Y 表示模型的擬合程度，自變量X 和因變量Y 表示模型的解釋表明的能力，Q2Y 表示模型的預(yù)測能力，三者的數(shù)值越接近1，表明模型的擬合程度和預(yù)測能力越好；各產(chǎn)區(qū)數(shù)據(jù)均落在95% 的置信區(qū)間范圍內(nèi)，表明藥材成分相似，質(zhì)量穩(wěn)定，但各數(shù)據(jù)分布在不同區(qū)域，且同一產(chǎn)區(qū)大多集中在一個區(qū)域并比較集中，表明藥材總體質(zhì)量差異不顯著，同時不同產(chǎn)區(qū)藥材整體質(zhì)量上存在一定的差異。載荷散點圖見圖7，距離遠點越遠，權(quán)重值越大，表明該成分的變化對區(qū)分各產(chǎn)區(qū)藥材質(zhì)量的作用越大。將VIP＞1 的成分確定為貢獻較大者，共有4 個，即1 號峰（VIP=1.232 8）、5號峰（VIP=1.198 2）、6 號峰（VIP=1.096 3）、7 號峰（VIP=1.237 7）、9 號峰（VIP=1.196 2），均對各產(chǎn)區(qū)藥材質(zhì)量分類具有顯著性影響，見圖8。

圖6 16 批樣品OPLS-DA 得分圖

圖7 16 批樣品載荷散點圖

圖8 16 批樣品共有峰VIP 值

3 討論

黨參是一種滋補中草藥，廣泛的應(yīng)用在日常生活中和中藥復(fù)方中，為我國用量居多的中藥材之一。近年來，研究黨參質(zhì)量評價等方面越來越多，通過調(diào)整施肥量、施肥種類、施用激素來改變黨參生產(chǎn)質(zhì)量和藥材質(zhì)量［13-14]，提高藥農(nóng)經(jīng)濟效益。同時黨參藥材質(zhì)量還受環(huán)境和遺傳因素的影響，種內(nèi)居群間遺傳相似性與地理分布又呈一定相關(guān)性，不同基原黨參藥材的化學(xué)成分受到栽培環(huán)境因素的影響［15-16]，這些觀念的提出為中藥材生產(chǎn)的產(chǎn)地環(huán)境選擇、栽培措施管理提供了方法和依據(jù)。

對17 批藥材分析其總多糖、黨參炔苷含量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)、同一產(chǎn)區(qū)不同土壤栽培均有所差異，由于17 號為市售黨參，與其他重慶周邊主產(chǎn)區(qū)川黨參藥材質(zhì)量差異比較大。將16 批黨參藥材12 個色譜峰峰面積進行預(yù)處理后，進行化學(xué)模式分析，通過聚類分析，經(jīng)過細致分類，同一產(chǎn)區(qū)不同土壤栽培并未歸為一類，表明黨參整體質(zhì)量存在一定的差異，因此在各主產(chǎn)區(qū)栽培種植黨參藥材時要找到相適宜的土壤進行栽培，以提高黨參藥材的整體質(zhì)量。OPLS-DA 分析結(jié)果與聚類分析相同，各主產(chǎn)區(qū)之間黨參總體質(zhì)量存在差異，同一栽培環(huán)境不同的栽培土壤對黨參質(zhì)量存在影響。甘肅省發(fā)布了針對中藥黨參的相關(guān)地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，貴州省則申請了貴州威寧黨參地理標(biāo)志［17-18]，同時有學(xué)者針對甘肅主產(chǎn)黨參做出了商品規(guī)格等級及研究不同栽培措施對黨參質(zhì)量的影響［19-20]等。重慶市對川黨參種苗繁育技術(shù)發(fā)布了地方標(biāo)準(zhǔn)，但本課題組所購買的市售黨參與栽培川黨參比較質(zhì)量較差，因此研究其產(chǎn)地質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、栽培技術(shù)規(guī)章、商品等級、加工炮制規(guī)章，是今后亟待解決的主要問題。建議根據(jù)產(chǎn)品質(zhì)量要求配合不同的栽培土壤，結(jié)合產(chǎn)地生態(tài)因子，繼續(xù)研究川黨參栽培土壤微生物環(huán)境等條件，做好藥材栽培規(guī)劃，建立藥材種植區(qū)GAP 基地建設(shè)，從而提高藥材總體質(zhì)量。同時，應(yīng)在黨參主產(chǎn)區(qū)建立種苗培育基地，穩(wěn)定藥材品質(zhì)，保證優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定、高效的生產(chǎn)格局及西南地區(qū)相關(guān)生產(chǎn)的持續(xù)、健康發(fā)展。