李 純，任 晉，熊 穎，栗建明，顧利紅

（廣州市藥品檢驗(yàn)所，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510160）

陳皮為蕓香科植物橘Citri reticulata Blanco 及其栽培變種的干燥成熟果皮，分為“陳皮”和“廣陳皮”［1]。近年來(lái)，陳皮在藥品、食品、化妝品工業(yè)用途開(kāi)發(fā)廣泛［2-8]，品質(zhì)與安全的保障需要快捷高效的檢測(cè)方法來(lái)滿足。柑橘中農(nóng)藥殘留主要分布在果皮，其殘留量約占全果的80%以上，果肉中殘留值很低。目前柑橘類的農(nóng)藥多殘留測(cè)定方法主要以新鮮柑橘全果或果肉部分為測(cè)定對(duì)象，大部分采用經(jīng)典QuEChERS 法［9-14]，該方法更適用于水果柑橘類農(nóng)殘檢驗(yàn)。陳皮富含色素及小分子揮發(fā)油，纖維及淀粉含量、含水量低（小于10%），遇水溶脹性強(qiáng)，吸附作用大，因此在樣品前處理方法選擇上有別于水果柑橘?？紤]到方法的通用及簡(jiǎn)便、快速，主要采用乙腈直接提取濃縮法同時(shí)參考QuEChERS 原方法、美國(guó)AOAC2007.01 法［14]等對(duì)凈化方法進(jìn)行了篩選。本實(shí)驗(yàn)選擇適用于液相質(zhì)譜聯(lián)用儀的41 種農(nóng)藥，根據(jù)陳皮基質(zhì)的性質(zhì)特點(diǎn)建立具有針對(duì)性的前處理方法以滿足農(nóng)藥多殘留檢測(cè)要求。

1 材料

1.1 儀器 3200 QTRAP 質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)ABsciex 公司，分析軟件Analyst 1.6.3）；1200 高效液相色譜（美國(guó)Agilent 公司）；AG245、XP-26 電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；HS260 控制型往復(fù)振蕩搖床（德國(guó)IKA 公司）；Maxi MixⅡ渦旋混合器（美國(guó)Thermolyne 公司）；Milli-Q 超純水制備系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 41 種農(nóng)藥化合物對(duì)照品（純度≥98%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司）。乙腈、丙酮（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；內(nèi)標(biāo)磷酸三苯酯（純度≥98%）、醋酸、乙酸氨（色譜純）、氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂（農(nóng)殘級(jí)）、吸附劑N-丙基乙二胺和十八烷基鍵合硅膠，均購(gòu)自上海安譜科技有限公司。57 批陳皮購(gòu)自藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣州市藥品檢驗(yàn)所顧利紅主任中藥師鑒定為正品，均符合2015 年版《中國(guó)藥典》 一部規(guī)定，粉碎，過(guò)3 號(hào)篩備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 LC-MS/MS 條件 菲羅門Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）及預(yù)保護(hù)柱（4 mm×2.0 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相95%乙腈（含5 mmol/L 甲酸銨和0.1%甲酸，A）-水（含5 mmol/L 甲酸銨和0.1%甲酸，B），梯度洗脫（0～1 min，30% A；1～12 min，30%～100% A；12～14 min，100%A；14～15 min，100%～30%A；15～20 min，30%A）；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；樣品盤溫度20 ℃。

電噴霧（ESI）離子源，正離子模式；依賴保留時(shí)間的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Scheduled MRM）；檢測(cè)窗60 s；氣簾氣（CUR）30 psi（1 psi=6.895 kPa）；碰撞氣（CAD）8 psi；噴霧電壓（IS）5 500 V；離子化溫度（TEM）600 ℃；霧化氣（GS1）50 psi；輔助氣（GS2）50 psi。其他參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 41 種農(nóng)藥殘留及內(nèi)標(biāo)的離子對(duì)參數(shù)及碰撞電壓

2.2 供試品溶液制備 取樣品粉末約3 g，精密稱定，置50 mL 聚苯乙烯聚塞離心管中，加入0.3 g 氯化鈉，立即搖散，加入20 mL 乙腈，振蕩提取30 min，離心5 min（4 000 r/min），取上清液，同法提取2 次，合并提取液，40 ℃水浴中濃縮至3～5 mL，轉(zhuǎn)入10 mL 量瓶，用少量乙腈多次洗滌瓶壁，洗滌液一并轉(zhuǎn)入量瓶，乙腈定容至刻度，混勻。量取上述提取液8 mL，轉(zhuǎn)移至裝有1.2 g 無(wú)水硫酸鎂、300 mg 十八烷基鍵合硅膠、100 mg N-丙基乙二胺吸附劑的10 mL 塑料離心管中，渦旋混勻5 min，離心5 min（4 000 r/min），即得。

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取磷酸三苯酯適量，乙腈制成0.2 mg/mL溶液，臨用前用水稀釋至0.20 μg/mL，即得。

2.4 空白基質(zhì)制備 取不含農(nóng)藥的空白陳皮樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 單一對(duì)照品用丙酮制成100 μg/mL單標(biāo)貯備液，精密量取1 mL，乙腈定容至50 mL，制成2 μg/mL 溶液，臨用前用乙腈制成不同質(zhì)量濃度。取空白陳皮基質(zhì)，配制不同質(zhì)量濃度（1、2、5、10、25、50、100 ng/mL）的溶液，即得。

2.6 測(cè)定方法 精密取系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、供試品溶液各1 mL，精密加入0.3 mL 內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，精密吸取2.0 μL，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品中41 種農(nóng)藥殘留量。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 專屬性考察 采用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加陳皮空白供試品基質(zhì)配成的混合標(biāo)樣（50 ng/mL），對(duì)各色譜峰進(jìn)行定位、確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)提取試劑、材料對(duì)供試品中各色譜峰無(wú)干擾，方法專屬性良好，見(jiàn)圖1。

圖1 各樣品TIC-MRM 色譜圖

2.7.2 基質(zhì)效應(yīng)考察 考察41 個(gè)農(nóng)藥殘留的基質(zhì)效應(yīng)，質(zhì)量濃度為10 ng/mL，發(fā)現(xiàn)34 個(gè)符合要求（80%～120%），其中甲胺磷、咪鮮胺等4 個(gè)低于50%；多菌靈、單甲脒受基質(zhì)輕度抑制，為50%～80%，這可能與陳皮中含揮發(fā)性小分子物質(zhì)較多，更容易競(jìng)爭(zhēng)性占據(jù)離子化位點(diǎn)有關(guān)。為盡可能地消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，減少測(cè)定結(jié)果的誤差，采用基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行定量。

2.7.3 線性關(guān)系考察 以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，權(quán)重系數(shù)1/x。結(jié)果表明，r 在0.994 0～0.999 6之間，各農(nóng)藥殘留在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。再逐步稀釋對(duì)照品基質(zhì)溶液至各待測(cè)指標(biāo)信噪比為3～5，測(cè)得方法定量限（LOQ）在0.7～26.7 μg/kg 之間。

2.7.4 加樣回收率試驗(yàn) 設(shè)定加標(biāo)質(zhì)量濃度3 個(gè)水平分別為20、50、100 μg/kg，各平行處理6 份，代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。結(jié)果，41 個(gè)農(nóng)藥殘留的平均加樣回收率68.9%～110.0%，RSD 0.1%～14.1%。取基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（質(zhì)量濃度為25 ng/mL）1 份，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得各待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值RSD 1.9%～10.9%。

3 結(jié)果與分析

購(gòu)自藥材市場(chǎng)的57 批樣品一共檢出13 類農(nóng)藥，檢出率較高的基本為殺菌保鮮劑、殺蟲(chóng)劑、殺螨劑，共10 種，均超過(guò)40%，可見(jiàn)在陳皮種植過(guò)程中農(nóng)藥種類使用廣泛。具體見(jiàn)表2，方法學(xué)考察結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 陽(yáng)性樣品測(cè)定結(jié)果

表3 各農(nóng)藥殘留方法學(xué)考察結(jié)果

共檢出4 種屬于國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部明令禁止的農(nóng)藥，分別為克百威（克百威與3-羥基克百威總和）、甲胺磷、硫線磷、治螟磷，均為廣譜殺蟲(chóng)劑。國(guó)家藥典委員會(huì)于2019年8 月27 日發(fā)布2015 年《中國(guó)藥典》 四部“0212 藥材和飲片檢定通則”修訂草案公示稿中，33 類禁用農(nóng)藥規(guī)定不得檢出（低于定量限）［15]，根據(jù)此限度，共10 批樣品檢出克百威超限（超限率18.0%），其余3 種不超限。殺撲磷為柑橘類果樹(shù)中禁止使用的農(nóng)藥，殘留量0.01～3.2 mg/kg，數(shù)量相差320 倍，提示部分農(nóng)戶存在違規(guī)使用禁用農(nóng)藥的現(xiàn)象。

咪鮮胺是柑橘在儲(chǔ)存運(yùn)輸中使用的抑菌保鮮劑，57 批樣品中檢出28 批，檢出率49.1%，參考“GB 2763—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品中農(nóng)藥最大殘留限量”［6]中柑橘殘留限度5 mg/kg，有9 批超限，超限率15.7%，均為當(dāng)年產(chǎn)的新皮，課題組調(diào)研結(jié)果證明，部分藥用陳皮來(lái)源于柑橘取完果肉后廢棄果皮進(jìn)一步加工制成，是其副產(chǎn)品之一。藥用陳皮無(wú)需保鮮，而柑橘采收時(shí)間比其滯后，導(dǎo)致果皮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失。因此，可考慮制定咪鮮胺限量以控制柑橘棄皮被當(dāng)做藥用陳皮的情況。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)嘗試用經(jīng)典QuEChERS 方法的醋酸水及直接乙腈2 種提取方式。陳皮粉末加入水浸泡，溶脹情況十分嚴(yán)重，溶出色素及雜質(zhì)較多，對(duì)部分待測(cè)指標(biāo)色譜峰造成干擾。由于待測(cè)目標(biāo)成分的結(jié)構(gòu)差異大、極性范圍廣，考慮到方法的便捷性及通用性，本品采用乙腈作為提取溶劑，樣品經(jīng)乙腈2 次振蕩提取，合并提取液后低溫旋蒸濃縮，部分待測(cè)指標(biāo)對(duì)溫度敏感，因此旋蒸溫度不高于40 ℃。

QuEChERS 方法的通用性在于，根據(jù)基質(zhì)特性以及不同的待測(cè)指標(biāo)，靈活挑選搭配不同比例的吸附劑達(dá)到凈化目的［16-18]。課題組在凈化材料的選擇與配比方面做了部分探索。凈化填料含1.2 g 無(wú)水硫酸鎂，N-丙基乙二胺和十八烷基鍵合硅膠總量共400 mg。結(jié)果顯示，0.4 g N-丙基乙二胺對(duì)磺隆類農(nóng)藥吸附作用大，回收率偏低（甲磺隆19.8%、氨苯磺隆8.4%、苯磺隆50%、氯磺隆21.2%），因?yàn)榛锹☆愞r(nóng)藥含酰氨鍵，與N-丙基乙二胺的氨基形成氫鍵作用造成吸附；0.4 g 十八烷基鍵合硅膠對(duì)除去揮發(fā)油效果好，但是丁硫克百威幾乎全部被十八烷基鍵合硅膠吸附，回收率僅為0.29%，因?yàn)槎×蚩税偻蛟?，脂溶性大，難以洗脫。當(dāng)0.1 g N-丙基乙二胺和0.3 g 十八烷基鍵合硅膠時(shí)，90%以上待測(cè)農(nóng)藥回收率在70%～116%之間，達(dá)到痕量分析的要求。

本研究建立了經(jīng)改良型QuEChERS 凈化的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定陳皮藥材中41 種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)單高效、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，為可用于陳皮藥材的日常監(jiān)控、殘留限度制定及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等。