李 純，任 晉，熊 穎，栗建明，顧利紅

（廣州市藥品檢驗所，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質量評價重點實驗室，廣東 廣州 510160）

陳皮為蕓香科植物橘Citri reticulata Blanco 及其栽培變種的干燥成熟果皮，分為“陳皮”和“廣陳皮”［1]。近年來，陳皮在藥品、食品、化妝品工業(yè)用途開發(fā)廣泛［2-8]，品質與安全的保障需要快捷高效的檢測方法來滿足。柑橘中農藥殘留主要分布在果皮，其殘留量約占全果的80%以上，果肉中殘留值很低。目前柑橘類的農藥多殘留測定方法主要以新鮮柑橘全果或果肉部分為測定對象，大部分采用經典QuEChERS 法［9-14]，該方法更適用于水果柑橘類農殘檢驗。陳皮富含色素及小分子揮發(fā)油，纖維及淀粉含量、含水量低（小于10%），遇水溶脹性強，吸附作用大，因此在樣品前處理方法選擇上有別于水果柑橘?？紤]到方法的通用及簡便、快速，主要采用乙腈直接提取濃縮法同時參考QuEChERS 原方法、美國AOAC2007.01 法［14]等對凈化方法進行了篩選。本實驗選擇適用于液相質譜聯(lián)用儀的41 種農藥，根據陳皮基質的性質特點建立具有針對性的前處理方法以滿足農藥多殘留檢測要求。

1 材料

1.1 儀器 3200 QTRAP 質譜聯(lián)用儀（美國ABsciex 公司，分析軟件Analyst 1.6.3）；1200 高效液相色譜（美國Agilent 公司）；AG245、XP-26 電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；HS260 控制型往復振蕩搖床（德國IKA 公司）；Maxi MixⅡ渦旋混合器（美國Thermolyne 公司）；Milli-Q 超純水制備系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 41 種農藥化合物對照品（純度≥98%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司）。乙腈、丙酮（色譜純，德國Merck 公司）；內標磷酸三苯酯（純度≥98%）、醋酸、乙酸氨（色譜純）、氯化鈉、無水硫酸鎂（農殘級）、吸附劑N-丙基乙二胺和十八烷基鍵合硅膠，均購自上海安譜科技有限公司。57 批陳皮購自藥材市場，經廣州市藥品檢驗所顧利紅主任中藥師鑒定為正品，均符合2015 年版《中國藥典》 一部規(guī)定，粉碎，過3 號篩備用。

2 方法與結果

2.1 LC-MS/MS 條件 菲羅門Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）及預保護柱（4 mm×2.0 mm，2.6 μm）；流動相95%乙腈（含5 mmol/L 甲酸銨和0.1%甲酸，A）-水（含5 mmol/L 甲酸銨和0.1%甲酸，B），梯度洗脫（0～1 min，30% A；1～12 min，30%～100% A；12～14 min，100%A；14～15 min，100%～30%A；15～20 min，30%A）；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；樣品盤溫度20 ℃。

電噴霧（ESI）離子源，正離子模式；依賴保留時間的多反應監(jiān)測模式（Scheduled MRM）；檢測窗60 s；氣簾氣（CUR）30 psi（1 psi=6.895 kPa）；碰撞氣（CAD）8 psi；噴霧電壓（IS）5 500 V；離子化溫度（TEM）600 ℃；霧化氣（GS1）50 psi；輔助氣（GS2）50 psi。其他參數見表1。

表1 41 種農藥殘留及內標的離子對參數及碰撞電壓

2.2 供試品溶液制備 取樣品粉末約3 g，精密稱定，置50 mL 聚苯乙烯聚塞離心管中，加入0.3 g 氯化鈉，立即搖散，加入20 mL 乙腈，振蕩提取30 min，離心5 min（4 000 r/min），取上清液，同法提取2 次，合并提取液，40 ℃水浴中濃縮至3～5 mL，轉入10 mL 量瓶，用少量乙腈多次洗滌瓶壁，洗滌液一并轉入量瓶，乙腈定容至刻度，混勻。量取上述提取液8 mL，轉移至裝有1.2 g 無水硫酸鎂、300 mg 十八烷基鍵合硅膠、100 mg N-丙基乙二胺吸附劑的10 mL 塑料離心管中，渦旋混勻5 min，離心5 min（4 000 r/min），即得。

2.3 內標溶液 精密稱取磷酸三苯酯適量，乙腈制成0.2 mg/mL溶液，臨用前用水稀釋至0.20 μg/mL，即得。

2.4 空白基質制備 取不含農藥的空白陳皮樣品，按“2.2”項下方法制備，即得。

2.5 基質混合標準工作溶液 單一對照品用丙酮制成100 μg/mL單標貯備液，精密量取1 mL，乙腈定容至50 mL，制成2 μg/mL 溶液，臨用前用乙腈制成不同質量濃度。取空白陳皮基質，配制不同質量濃度（1、2、5、10、25、50、100 ng/mL）的溶液，即得。

2.6 測定方法 精密取系列質量濃度的基質混合標準工作溶液、供試品溶液各1 mL，精密加入0.3 mL 內標溶液，混勻，過0.22 μm 微孔濾膜，精密吸取2.0 μL，注入液質聯(lián)用儀，內標標準曲線法計算供試品中41 種農藥殘留量。

2.7 方法學考察

2.7.1 專屬性考察 采用混合標準溶液加陳皮空白供試品基質配成的混合標樣（50 ng/mL），對各色譜峰進行定位、確認，發(fā)現(xiàn)提取試劑、材料對供試品中各色譜峰無干擾，方法專屬性良好，見圖1。

圖1 各樣品TIC-MRM 色譜圖

2.7.2 基質效應考察 考察41 個農藥殘留的基質效應，質量濃度為10 ng/mL，發(fā)現(xiàn)34 個符合要求（80%～120%），其中甲胺磷、咪鮮胺等4 個低于50%；多菌靈、單甲脒受基質輕度抑制，為50%～80%，這可能與陳皮中含揮發(fā)性小分子物質較多，更容易競爭性占據離子化位點有關。為盡可能地消除基質效應的影響，減少測定結果的誤差，采用基質匹配內標校準曲線對樣品中的農藥殘留進行定量。

2.7.3 線性關系考察 以對照品與內標物峰面積比值為縱坐標（Y），對照品與內標物質量濃度比值為橫坐標（X）進行回歸，權重系數1/x。結果表明，r 在0.994 0～0.999 6之間，各農藥殘留在各自范圍內線性關系良好。再逐步稀釋對照品基質溶液至各待測指標信噪比為3～5，測得方法定量限（LOQ）在0.7～26.7 μg/kg 之間。

2.7.4 加樣回收率試驗 設定加標質量濃度3 個水平分別為20、50、100 μg/kg，各平行處理6 份，代入隨行標準曲線計算。結果，41 個農藥殘留的平均加樣回收率68.9%～110.0%，RSD 0.1%～14.1%。取基質配制標準工作溶液（質量濃度為25 ng/mL）1 份，重復進樣6 次，測得各待測物與內標的峰面積比值RSD 1.9%～10.9%。

3 結果與分析

購自藥材市場的57 批樣品一共檢出13 類農藥，檢出率較高的基本為殺菌保鮮劑、殺蟲劑、殺螨劑，共10 種，均超過40%，可見在陳皮種植過程中農藥種類使用廣泛。具體見表2，方法學考察結果見表3。

表2 陽性樣品測定結果

表3 各農藥殘留方法學考察結果

共檢出4 種屬于國家農業(yè)農村部明令禁止的農藥，分別為克百威（克百威與3-羥基克百威總和）、甲胺磷、硫線磷、治螟磷，均為廣譜殺蟲劑。國家藥典委員會于2019年8 月27 日發(fā)布2015 年《中國藥典》 四部“0212 藥材和飲片檢定通則”修訂草案公示稿中，33 類禁用農藥規(guī)定不得檢出（低于定量限）［15]，根據此限度，共10 批樣品檢出克百威超限（超限率18.0%），其余3 種不超限。殺撲磷為柑橘類果樹中禁止使用的農藥，殘留量0.01～3.2 mg/kg，數量相差320 倍，提示部分農戶存在違規(guī)使用禁用農藥的現(xiàn)象。

咪鮮胺是柑橘在儲存運輸中使用的抑菌保鮮劑，57 批樣品中檢出28 批，檢出率49.1%，參考“GB 2763—2016食品安全國家標準-食品中農藥最大殘留限量”［6]中柑橘殘留限度5 mg/kg，有9 批超限，超限率15.7%，均為當年產的新皮，課題組調研結果證明，部分藥用陳皮來源于柑橘取完果肉后廢棄果皮進一步加工制成，是其副產品之一。藥用陳皮無需保鮮，而柑橘采收時間比其滯后，導致果皮營養(yǎng)物質流失。因此，可考慮制定咪鮮胺限量以控制柑橘棄皮被當做藥用陳皮的情況。

4 討論

本實驗嘗試用經典QuEChERS 方法的醋酸水及直接乙腈2 種提取方式。陳皮粉末加入水浸泡，溶脹情況十分嚴重，溶出色素及雜質較多，對部分待測指標色譜峰造成干擾。由于待測目標成分的結構差異大、極性范圍廣，考慮到方法的便捷性及通用性，本品采用乙腈作為提取溶劑，樣品經乙腈2 次振蕩提取，合并提取液后低溫旋蒸濃縮，部分待測指標對溫度敏感，因此旋蒸溫度不高于40 ℃。

QuEChERS 方法的通用性在于，根據基質特性以及不同的待測指標，靈活挑選搭配不同比例的吸附劑達到凈化目的［16-18]。課題組在凈化材料的選擇與配比方面做了部分探索。凈化填料含1.2 g 無水硫酸鎂，N-丙基乙二胺和十八烷基鍵合硅膠總量共400 mg。結果顯示，0.4 g N-丙基乙二胺對磺隆類農藥吸附作用大，回收率偏低（甲磺隆19.8%、氨苯磺隆8.4%、苯磺隆50%、氯磺隆21.2%），因為磺隆類農藥含酰氨鍵，與N-丙基乙二胺的氨基形成氫鍵作用造成吸附；0.4 g 十八烷基鍵合硅膠對除去揮發(fā)油效果好，但是丁硫克百威幾乎全部被十八烷基鍵合硅膠吸附，回收率僅為0.29%，因為丁硫克百威含硫原子，脂溶性大，難以洗脫。當0.1 g N-丙基乙二胺和0.3 g 十八烷基鍵合硅膠時，90%以上待測農藥回收率在70%～116%之間，達到痕量分析的要求。

本研究建立了經改良型QuEChERS 凈化的高效液相色譜-串聯(lián)質譜同時測定陳皮藥材中41 種農藥殘留的檢測方法。該方法簡單高效、重復性好、準確度高，為可用于陳皮藥材的日常監(jiān)控、殘留限度制定及風險評估等。