張正海，董 艷，田 媛，姬妍茹，楊慶麗，石 杰

（黑龍江省科學(xué)院 大慶分院，黑龍江 大慶163319）

近年來，食品安全問題日益受到關(guān)注，已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題[1]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus），是一類球形、直徑約0.8μm、顯微鏡下呈葡萄串狀排列的革蘭氏陽性食源性病原體[2]。S.aureus易引起乳制品、肉類、蛋類、冰淇淋等食品腐敗污染，導(dǎo)致人類食物中毒[3]。在許多國家,病原菌食物中毒事件中，S.aureus列居第二或第三位[4]。其引起食物中毒的主要特征是：發(fā)病迅速，通常伴有惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉等癥狀，嚴重時會引發(fā)敗血癥、腦膜炎和中毒性毒素休克綜合征等疾病，對于嬰幼兒、老年人、術(shù)后患者或其他體質(zhì)較虛弱的人來說，S.aureus感染具有更大的威脅[5]。當前，防止食品污染、延長保質(zhì)期最簡單有效的方法是使用天然或化學(xué)防腐劑[6]。鹽、糖、醋和酒精是傳統(tǒng)的防腐劑，但一些細菌和霉菌可以耐受這些傳統(tǒng)的防腐劑。相比之下，人工合成的化學(xué)防腐劑，如苯甲酸/苯甲酸鈉、山梨酸/山梨酸鉀、硝酸鹽等，可有效抑制細菌生長，然而長期攝入這些化學(xué)防腐劑可能造成毒性累積，引起過敏、頭痛等癥狀，還可能產(chǎn)生細菌耐藥性[7-8]。此外，一些化學(xué)防腐劑對食品感官品質(zhì)也有一定影響。如今，植物源天然產(chǎn)物憑借不同抑菌機制發(fā)揮獨特抑菌性能，其潛在功效和較少的副作用受到廣泛關(guān)注[9]。

工業(yè)大麻（Hemp，Cannabis sativaL.）俗稱火麻、漢麻，為大麻科、大麻屬的一年生草本植物，是經(jīng)遺傳改良和人工選育的無毒新品種，其四氫大麻酚（Δ9-THC）的質(zhì)量分數(shù)低于0.3%[10]。多項研究表明，大麻對人體健康有益，可預(yù)防便秘、降低膽固醇、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、改善記憶等[11-12]。我國大麻資源豐富，在云南、廣西、黑龍江、吉林等地都有野生或人工栽培的大麻分布。近年來，醫(yī)用大麻二酚在癌癥治療方面的作用日益被重視，全球工業(yè)大麻種植、生產(chǎn)也不斷合法化，工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)鏈已從農(nóng)業(yè)、紡織業(yè)延伸到新材料、食品、生物醫(yī)藥等多個行業(yè)，工業(yè)大麻的種植面積逐漸增大。隨之產(chǎn)生了較多工業(yè)大麻葉副產(chǎn)物，但其利用程度有限。

多項研究證實工業(yè)大麻葉能有效抑制S.aureus生長。雋惠玲等[13]研究發(fā)現(xiàn)，工業(yè)大麻葉對S.aureus的最低抑菌濃度（MIC）為7.53 mg/mL；郭孟璧等[14]證實工業(yè)大麻雌株花葉多糖對S.aureus的MIC為3.125 mg/mL；張旭等[15]采用超臨界CO2萃取工業(yè)大麻中的大麻二酚（CBD）、六氫大麻酚（CBN）和四氫大麻酚（Δ9-THC），這3種大麻酚的混合物對S.aureus的MIC為6 mg/mL；Giovanni等[16]研究了工業(yè)大麻葉中5種大麻素對多種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）抑菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)大麻素的異戊二烯基主要參與脂類親和作用的調(diào)節(jié)，對抑菌作用影響較小，酚羥基的甲基化、乙?；?、前大麻素羧基的酯化以及第二個萜的引入都不利于抑菌活性，但其機制尚不明確。本課題組前期研究表明，來自大慶地區(qū)的工業(yè)大麻葉乙酸乙酯萃取物對S.aureus的MIC為7.81 mg/mL，且經(jīng)紫外輻射、添加蔗糖和不同溫度處理仍表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性[17]。目前，工業(yè)大麻葉對S.aureus抑菌的研究大多圍繞抑菌效果開展，而關(guān)于抑菌組成和抑菌機制的研究鮮有報道。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，對工業(yè)大麻葉萃取物進行硅膠柱分離，評價了按不同比例的石油醚與乙酸乙酯洗脫后，萃取物各餾分對S.aureus的抑菌活性，利用GC-MS確定高活性餾分的化合物組成，進一步分析工業(yè)大麻葉對S.aureus的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

工業(yè)大麻葉：經(jīng)鑒定為火麻1號品種，于2019年7月中旬采自黑龍江省科學(xué)院大慶分院東風(fēng)農(nóng)場試驗田；金黃色葡萄球菌標準菌株[ATCC 25923]：上海魯微科技有限公司產(chǎn)品；硅膠粉：青島海洋生物有限公司產(chǎn)品；氨芐青霉素鈉：德國Ruibio公司產(chǎn)品；AKP試劑盒、可溶性蛋白質(zhì)含量測定試劑盒、ATP含量試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司產(chǎn)品；SOD試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；戊二醛固定液：福州phygene生物科技公司產(chǎn)品；無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、叔丁醇（AR）：均為遼寧泉瑞試劑有限公司產(chǎn)品。

7890B-7000c氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫公司產(chǎn)品；Epoch多功能酶標儀：美國BioTek公司產(chǎn)品；UV-759紫外可見分光光度計：上海高致精密儀器有限公司產(chǎn)品；JSM7200F掃描電子顯微鏡：日本電子公司產(chǎn)品；DDS307電導(dǎo)率儀：上海紅益儀器儀表有限公司產(chǎn)品；VFD-4500型冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產(chǎn)品；RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上?；ゼ褍x器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工業(yè)大麻葉提取物制備 根據(jù)張正海等[17]的方法，取1.5 kg陰干工業(yè)大麻葉，粉碎并過60目篩，以料液質(zhì)量體積比為1 g∶15 mL的比例加入體積分數(shù)為88%的乙醇，超聲輔助提取20 min，真空抽濾，重復(fù)3次，合并濾液，于40℃旋蒸至膏狀（182 g）。乙酸乙酯萃取，減壓濃縮后得浸膏57 g，用85.5 g硅膠（100～200目）拌樣后干法上樣，經(jīng)200～300目硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫（體積比分別為1∶0，50∶1，20∶1，5∶1，1∶1，0∶1），根據(jù)薄層色譜（TLC）合并相似餾分，共得到Fr1—Fr6共6個餾分，旋蒸后調(diào)整質(zhì)量濃度至10 mg/mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾除菌后，4℃保存，用于抑菌試驗。

1.2.2 菌懸液制備 在無菌的條件下，將活化好的S.aureus單菌落接種于已滅菌的MH培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)16 h，室溫4 000 r/min離心后收集菌體，用無菌生理鹽水稀釋菌懸液至單位體積的菌落數(shù)為106～107CFU/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 最低抑制濃度（MIC）測定 參考Tang等[18]和Zhou等[19]的方法并適當修改，采用微量2倍稀釋法，向96孔板中加入90μL/孔菌懸液和10μL/孔的工業(yè)大麻葉提取物，使其質(zhì)量濃度分別為1 000、500、250、125、62.5、31.25、16、8μg/mL，并設(shè)空白對照（不含細菌）和陽性對照（含等質(zhì)量濃度的氨芐青霉素鈉），37℃恒溫培養(yǎng)24 h，肉眼直接觀察，不出現(xiàn)渾濁的最小質(zhì)量濃度即為MIC。

1.2.4 GC-MS化學(xué)成分分析 利用Fr1—Fr6篩選S.aureus的活性后，取活性最佳的餾分并分析其組成。用甲醇稀釋Fr5至質(zhì)量濃度為1 mg/mL，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后進行GC-MS。GC：HP-5MS（30 m×250μm，0.25μm），He氣流量為：1.1 mL/min；升溫程序為：100℃保持1 min，以10℃/min速率升溫到280℃保持12 min；MS：四級桿溫度：150℃，離子源（EI）：70 eV，240℃，質(zhì)量掃描范圍：m/z 50.0～500.0。

1.2.5 生長曲線繪制 參考Liu等[20]的方法，按體積分數(shù)1%的接種量將S.aureus分別接種于含0 MIC、0.5 MIC、1 MIC的工業(yè)大麻葉提取物的培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，酶標儀每隔2 h測定OD600nm，繪制OD600nm-時間生長曲線。

1.2.6 菌懸液中AKP活力[21]、可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度[22]、核酸相對濃度[23]和電導(dǎo)率的測定[24]分別向含有0 MIC、0.5 MIC、1 MIC的工業(yè)大麻葉提取物的培養(yǎng)基中加入菌懸液，使得菌懸液單位體積菌落數(shù)為106CFU/mL，于37℃，振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取5 mL菌液，4℃、4 000 r/min離心取上清液，按照各自試劑盒說明書的方法測定AKP活力和可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度、紫外分光光度計測定260 nm波長下吸光值、去離子水稀釋20倍后電導(dǎo)率儀測定各時間點電導(dǎo)率。

1.2.7 胞內(nèi)ATP濃度[25]、SOD活性[26]測定 分別于0、2、4、6、8、10 h取1 mL菌液，4℃、4 000 r/min離心后，棄上清液，按各自試劑盒說明書方法測定菌體ATP濃度和SOD活性。

1.2.8 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察及樣品制備 按Zhou等[27]的方法并稍加改動，將對數(shù)生長期S.aureus菌懸液單位體積的菌落數(shù)調(diào)整為107CFU/mL，加入工業(yè)大麻葉提取液使質(zhì)量濃度分別為0 MIC、1 MIC，于37℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。取800μL菌體于室溫下、4 000 r/min離心后棄上清液，用0.1 mol/mL、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，離心收集菌體后用體積分數(shù)為2.5%的戊二醛溶液固定過夜。依次用體積分數(shù)為30.0%、50.0%、70.0%、80.0%、90.0%、100.0%的乙醇梯度脫水，叔丁醇置換。取細菌-叔丁醇懸浮液10μL滴于10 mm×10 mm硅片上，用真空冷凍干燥機干燥，噴金后SEM觀察。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 試驗重復(fù)3次，結(jié)果采用DPS 7.05軟件對數(shù)據(jù)進行Duncan多重比較分析，GraphPad Prism 7軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 工業(yè)大麻葉不同餾分對S.aureus的抑菌活性

表1顯示了不同餾分對S.aureus的最低抑制濃度（質(zhì)量濃度）。在供試范圍內(nèi)Fr1—Fr4對S.aureus無抑菌作用，說明Fr1—Fr4餾分內(nèi)可能不含或含有很少量的活性化合物。Fr5和Fr6對S.aureus的生長有明顯的抑制作用，最低抑菌濃度（質(zhì)量濃度）分別為31.25μg/mL和500μg/mL，其中Fr5的抑菌效果與氨芐青霉素鈉的31.25μg/mL相當，此結(jié)果與Chakraborty等[28]的研究結(jié)果接近，較柱分離前最低抑菌濃度（質(zhì)量濃度7.53 mg/mL）顯著提高，說明抑菌活性成分大部分富集于Fr5餾分，以此為依據(jù)，選擇Fr5分析其化學(xué)組成并探討其抑菌機理。

2.2 工業(yè)大麻葉Fr5餾分的GC-MS結(jié)果

由表2可知，工業(yè)大麻葉Fr5餾分，經(jīng)GC-MS分析，共鑒定出24種化合物，其中包括酯類14個，醇類3個，酚類3個，烯烴類2個。主要成分為亞麻酸甲酯（相對質(zhì)量分數(shù)40.79%）、棕櫚酸甲酯（相對質(zhì)量分數(shù)13.12%）、9-順，11-反-癸二烯酸甲酯（相對質(zhì)量分數(shù)4.55%）。說明工業(yè)大麻葉Fr5餾分的抗菌活性可能與酯類、醇類、酚類及其他微量化合物有關(guān)，不同成分也可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。

表1 工業(yè)大麻葉不同餾分對S.aureus的抑菌活性Table 1 Antibacterial activity of each fraction from industrial hemp leaves against S.aureus

表2 工業(yè)大麻葉Fr5餾分GC-MS結(jié)果Table 2 GC-MSidentification of Fr5 fractions from industrial hemp leaves

2.3 工業(yè)大麻葉提取物的抑菌機理

2.3.1 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對S.aureus生長曲線的影響 OD600nm的大小可間接反應(yīng)細菌的生長情況，圖1為添加了0 MIC、0.5 MIC、1 MIC 3種質(zhì)量濃度的Fr5后S.aureus的生長曲線。對照組在培養(yǎng)后快速繁殖，2 h進入對數(shù)生長期，14 h進入穩(wěn)定期，OD600nm為1.156±0.029。在0.5 MIC處理組，菌液OD600nm增長緩慢，對數(shù)增長階段被推遲至6 h，并于12 h進入穩(wěn)定階段，OD600nm為0.427±0.023，說明抑菌作用延緩對數(shù)生長進程，減少微生物數(shù)量。而當菌液中Fr5質(zhì)量濃度為1 MIC時，曲線平緩，細菌生長被嚴重抑制，不能進入對數(shù)生長期。因此，工業(yè)大麻葉Fr5餾分對S.aureus正常生長有抑制作用，且隨著藥物質(zhì)量濃度增加，對生長曲線影響增大。

圖1 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對S.aureus生長曲線的影響Fig.1 Effect of Fr5 from industrial hemp leaves extract on growth curve of S.aureus

2.3.2 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對菌體細胞壁的影響正常情況下AKP存在于細菌的細胞壁和細胞膜之間，當菌體細胞壁被破壞，AKP大量外泄，使培養(yǎng)液中AKP活力升高，因此可通過檢測胞外AKP活力的變化間接反映菌體細胞壁完整性[29]。細菌細胞壁的主要功能是：維持細菌固有形態(tài)，保護細菌免受低滲環(huán)境侵襲，起到屏障作用。一旦細胞壁功能被破壞，細菌會很快死亡。如圖2所示，隨著培養(yǎng)時間的增加，對照組AKP活力始終處于相對較低水平，但經(jīng)過1 MIC處理后的菌液，在2 h內(nèi)AKP活力迅速上升至較高水平（0.548±0.039 U/L），之后趨于平穩(wěn)狀態(tài)，而0.5 MIC處理的AKP活力在8 h達到最大值（0.335±0.020 U/L）遠低于1 MIC處理。這表明工業(yè)大麻葉Fr5餾分短時間內(nèi)能有效破壞S.aureus細胞壁的完整性，其中1 MIC的Fr5對菌體細胞壁完整性的破壞程度較0.5 MIC更明顯。

2.3.3 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對細胞膜通透性的影響細胞膜是菌體的保護屏障，其選擇性透過K+、Na+、H+等，可維持適合細菌生存的穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境、胞膜功能、酶活性和菌體正常代謝[30]。當細胞膜遭到破壞，通透性增加，內(nèi)部的電解質(zhì)會外泄至細胞外，進而使培養(yǎng)液電導(dǎo)率提高，因此菌液電導(dǎo)率的變化反映了細胞膜通透性的變化[25]。如圖3所示，第0小時，添加抑菌物質(zhì)的菌液電導(dǎo)率有一定程度的下降，可能是藥物與外泄的離子發(fā)生了靜電結(jié)合，從而導(dǎo)致離子濃度降低，電導(dǎo)率下降。隨著培養(yǎng)時間的增加，對照組電導(dǎo)率呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢，但變化幅度較小，這可能是菌液中菌體濃度增加和正常的裂解所致[31]。當加入工業(yè)大麻葉Fr5后，在短時間內(nèi)菌液電導(dǎo)率明顯高于對照組（P＜0.05），尤其是1 MIC工業(yè)大麻葉提取物作用后2 h，培養(yǎng)液電導(dǎo)率提高12%。這說明工業(yè)大麻葉Fr5可對S.aureus細胞膜造成損傷，且損傷程度與Fr5的濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

圖2 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對S.aureus細胞壁的影響Fig.2 Fr5 from industrial hemp leaves on wall of S.aureus

圖3 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect of Fr5 from industrial hemp leaves extract on electric conductivity of culture medium

蛋白質(zhì)和核酸是影響細胞結(jié)構(gòu)和遺傳信息的重要大分子，菌體細胞正常生長情況下，蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)貫穿于整個胞膜和胞質(zhì)當中，核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的外溢表明胞膜完整性遭到了破壞[32]。菌懸液在260 nm處的吸光度常用來判斷核酸的相對濃度[33]。如圖4所示，0 h時，各組間核酸的吸光度和可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度均無明顯區(qū)別。隨時間增加，對照組核酸的吸光度和可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度處于較低范圍且變化均較為平緩，而經(jīng)0.5 MIC和1 MIC的Fr5處理后，培養(yǎng)液中核酸的吸光度和可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度在2 h迅速升高，與0 h相比：核酸的吸光度分別增加了0.183、0.407，可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度分別增加了0.129 g/L、0.187 g/L。0 h后，兩個處理組的核酸吸光度和可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度均始終高于對照組（P＜0.05）。對照組蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度有少量增加是因為：隨菌落數(shù)大幅增加，出現(xiàn)部分自然死亡細胞，釋放一定量蛋白質(zhì)。加入抑菌物質(zhì)后，S.aureus細胞膜遭破壞，DNA、RNA等大分子隨小分子相繼流出細胞，從而增加菌懸液核酸和蛋白質(zhì)的濃度。這說明工業(yè)大麻葉提取物可導(dǎo)致菌體的膜功能障礙，細胞內(nèi)容物泄露，無法維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而達到抑菌作用。

圖4 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對S.aureus核酸吸光度和可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effect of Fr5 from industrial hemp leaves extract on the nucleic acid absorbance and the soluble protein content of S.aureus

2.3.4 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對菌體能量代謝的影響ATP在細胞物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用，其濃度的變化直接關(guān)系到細胞的能量代謝。圖5反映了經(jīng)過不同濃度的Fr5處理后，S.aureus胞內(nèi)ATP濃度的變化：對照組樣品細胞內(nèi)ATP濃度隨時間增加呈上升趨勢，而經(jīng)0.5 MIC和1 MIC Fr5處理后，細胞內(nèi)ATP濃度在2 h顯著升高（P＜0.05），隨后降低，在10 h降低至26.175±3.336μmol/L和16.154±2.672μmol/L，較0 h分別降低了51.96%和70.35%?？赡苁且志镔|(zhì)刺激了菌體，細胞為了維持正常生理功能出現(xiàn)應(yīng)激，ATP濃度在2 h內(nèi)迅速上升。在4～10 h，因電解質(zhì)損失，細菌細胞質(zhì)子動力降低，影響還原氫利用，ATP合成受抑制。另外，細胞內(nèi)ATP濃度降低也可能因為：細胞過度凋亡造成ATP合成速率降低和ATP的水解速率增加[34]。其他抗菌藥物，如檸檬烯等也有類似現(xiàn)象[24]。因此，工業(yè)大麻葉提取物會影響S.aureus的ATP合成或消耗，結(jié)合膜通透性變化，造成胞內(nèi)ATP濃度下降，從而抑制菌體代謝。

圖5 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對S.aureus ATP濃度的影響Fig.5 Effect of Fr5 from industrial hemp leaves extract on the ATP content of S.aureus

2.3.5 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對菌體氧化損傷的影響菌體自由基能攻擊生物膜并引起細胞損傷，形成丙二醛等過氧化物。SOD是細胞中重要的保護酶，SOD特異性催化超氧陰離子，將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫，CAT進一步催化過氧化氫分解為水，它們協(xié)調(diào)工作，維持細胞內(nèi)活性氧的代謝平衡。由圖6可知，對照組SOD活力相對穩(wěn)定且維持在較低水平，說明細胞膜未受到損傷。不同濃度工業(yè)大麻葉Fr5處理后的S.aureus胞內(nèi)SOD活力均呈先升高后降低的趨勢，實驗結(jié)束時0 MIC、0.5 MIC、1 MIC細胞內(nèi)SOD活力分別為0.203±0.014、0.180±0.023、0.132±0.011 U，推測菌體在提取物的逆境脅迫下，前期SOD增加，清除有害物質(zhì)從而保護菌體免受毒害，但后期由于氧自由基的累積、膜脂過氧化的加重和蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致保護酶水平的降低，使菌體自身防御能力下降。故推測：Fr5以劑量依賴的方式造成S.aureus的氧化損傷。

圖6 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對S.aureus SOD活性的影響Fig.6 Effect of Fr5 from hemp leaves extract on the SOD activity of S.aureus

2.3.6 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對細胞顯微特征的影響用0 MIC和1 MIC濃度的Fr5分別處理細菌，掃描電鏡觀察S.aureus的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征變化。結(jié)果如圖7所示，對照組大部分S.aureus細胞呈球形，表面規(guī)則、光滑、外觀飽滿且結(jié)構(gòu)完整；然而，經(jīng)工業(yè)大麻葉1 MIC提取物處理10 h后，菌體表面出現(xiàn)皺縮，可見明顯破潰的菌體。這與細胞壁完整性、細胞膜通透性研究結(jié)果一致。細菌被抑制的原因可能是細胞膜被破壞，即使是膜結(jié)構(gòu)微小的變化也能極大影響細胞代謝并導(dǎo)致細胞死亡，其他研究也有類似結(jié)論[31，35]。以上結(jié)果再次證明：工業(yè)大麻葉Fr5餾分可以使S.aureus膜結(jié)構(gòu)造成破壞。

圖7 工業(yè)大麻葉提取物處理后S.aureus的掃描電鏡圖（50μm）Fig.7 SEM images of S.aureus with or without Fr5 from hemp leaves extract treatment

3 結(jié) 語

為了應(yīng)對過度使用化學(xué)防腐劑造成的健康風(fēng)險和細菌耐藥性問題，本研究探索了工業(yè)大麻葉對S.aureus的抑菌組成并對其機理進行探索，證實了工業(yè)大麻葉Fr5餾分（V石油醚∶V乙酸乙酯=1∶1）可有效抑制S.aureus的生長，MIC值為31.25μg/mL。經(jīng)GCMS分析，共鑒定出24種化合物。由胞外AKP活力的升高、電導(dǎo)率的增加和細胞內(nèi)生物大分子（核酸和蛋白質(zhì)）的滲漏以及掃描電鏡下菌體的微觀機構(gòu)變化，推測：工業(yè)大麻葉可能與陽性對照氨芐青霉素鈉有相似的抑菌機制，均能破壞細菌細胞壁和細胞膜完整性。在食品加工過程中，控制微生物生長的主要目標是對細菌細胞膜的滅活處理[35]。細菌細胞膜可保護細胞免受周圍環(huán)境傷害，并負責(zé)運輸細胞生長和代謝所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。當細胞膜受損時，細菌的生長和代謝就會被破壞[36]。工業(yè)大麻葉Fr5作用于S.aureus后，可能是其中的化合物通過脂質(zhì)雙分子層疏水羥基的積累，作用于細胞膜或?qū)е录毎饽ぶ嗵轻尫?，從而造成膜通透性和膜電位變化[37]。維持正常膜電位是產(chǎn)生ATP維持細胞功能的前提[20]。由于細胞膜的通透性增加，細胞生長繁殖所需的能量和關(guān)鍵物質(zhì)無法及時合成，影響菌體的能量代謝并造成氧化損傷，最終導(dǎo)致細胞生長受到抑制。這些結(jié)果為工業(yè)大麻葉在食品保鮮方面的綜合利用和新型天然防腐劑的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，但抑菌物質(zhì)仍需進一步分離、鑒定，并需要在分子水平上深入研究作用機制，尋找其具體靶點。