陸 濤，張軍偉，唐 雪，周 鵬*，夏旭斌，胡 煒

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；3.山東好當(dāng)家海洋發(fā)展股份有限公司，山東 威海264200）

學(xué)習(xí)和記憶是大腦的重要功能之一。阿爾茲海默?。ˋlzheimer disease；AD）是目前最常見的神經(jīng)退行性疾病之一。它會(huì)讓人們的學(xué)習(xí)和記憶能力退化，理解和表達(dá)能力下降，導(dǎo)致癡呆等認(rèn)知障礙，嚴(yán)重影響人們的工作和生活?！妒澜绨柎暮Ｄ?015報(bào)告》指出，到2050年，全球該病患者數(shù)量將從4 680萬(wàn)增加至1.315億[1]。AD最明顯的病理學(xué)特征為：β-淀粉樣蛋白（β-amyloid；Aβ）[2]沉積在神經(jīng)元細(xì)胞周圍，最終形成的老年斑和神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)微管蛋白（Tau）過(guò)度磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles；NFTs）[3]。二者最終會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和突觸功能的喪失。但AD的發(fā)病機(jī)制并沒(méi)有完全被解釋清楚，主要有如下幾種學(xué)說(shuō)：膽堿能系統(tǒng)障礙[4]、氧化應(yīng)激[5]、免疫和炎癥反應(yīng)[6]、線粒體功能紊亂[7]、遺傳與基因突變[8]、腦內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)[9]?；谏鲜鰧W(xué)說(shuō)開發(fā)出了各種治療藥物，如膽堿酶抑制劑他克林[10]、多奈哌齊[11]、利斯的明[12]，NMDA受體拮抗劑美金剛[12]，大腦代謝調(diào)節(jié)劑尼麥角林[13]、吡拉西坦[14]，抗炎藥吲哚美辛[15]、萘普生，其他還有一些自由基清除劑和抗氧化劑[16]等保護(hù)神經(jīng)的藥物目前也引起了人們的關(guān)注。這些藥物在一定程度上緩解了AD病情的發(fā)展。

海參是一種珍貴的海洋資源，其體內(nèi)含有蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、海參多糖、皂苷、磷脂。目前關(guān)于海參改善記憶的研究也有報(bào)道。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)：源自刺參的肽能通過(guò)免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用來(lái)改善小鼠在Y迷宮和Morris水迷宮的表現(xiàn)。Lin等[18]也發(fā)現(xiàn)：海參酶解后通過(guò)超濾純化得到的多肽產(chǎn)物可抑制小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)氧化水平，同時(shí)還下調(diào)了腦部乙酰膽堿酯酶（AchE）的表達(dá)。Li等[19]對(duì)大鼠灌胃40 mg/kg海參腦苷脂27 d后，大鼠腦部神經(jīng)元的損傷和細(xì)胞凋亡被明顯抑制。海參花屬于海參的內(nèi)臟，主要是海參的卵。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)海參花的研究鮮見報(bào)道。海參加工過(guò)程中海參花大多作為加工副產(chǎn)物被丟棄，使海參花含有的活性因子和營(yíng)養(yǎng)成分不被利用。市場(chǎng)上人們也主要食用海參體壁。這些都造成了較大浪費(fèi)。成分分析測(cè)得：海參花蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，為（62.08±0.83）%。其含有的氨基酸種類豐富，有19種。其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是谷氨酸和天冬氨酸，兩者是腦內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[20]。海參花還含有不飽和脂肪酸，在抑制炎癥反應(yīng)方面有一定效果。張婕等[21]研究發(fā)現(xiàn)海參花還具有抗氧化作用，小鼠灌胃海參花后，其性腺內(nèi)的超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）明顯升高，脂質(zhì)過(guò)氧化水平明顯降低（MDA）。此外海參花還含有多糖、釩等其他珍貴的活性成分。因此海參花具有很大的開發(fā)、應(yīng)用價(jià)值。

常用的記憶損傷模型有：Aβ模型[22]、東莨菪堿模型[23]、D-半乳糖模型[24]、轉(zhuǎn)基因模型[25]、正常衰老模型[26]和血管性癡呆模型[27]。本研究選用東莨菪堿模型，相比其他造模方法更加便捷和經(jīng)濟(jì)。東莨菪堿是一種毒蕈堿膽能受體（M受體）拮抗劑。它能夠阻滯乙酰膽堿與受體結(jié)合，降低腦內(nèi)乙酰膽堿的含量，從而導(dǎo)致膽堿能功能障礙和認(rèn)知障礙，使得小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。Goverdhan等[28]發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠連續(xù)9 d腹腔注射1.4 mg/kg東莨菪堿后會(huì)誘發(fā)腦內(nèi)氧化應(yīng)激。Demirci等[29]發(fā)現(xiàn)對(duì)大鼠連續(xù)14 d腹腔注射1 mg/kg東莨菪堿后，大鼠腦部和血漿的脂質(zhì)過(guò)氧化水平（MDA）以及血漿的腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白介素-1β（IL-1β）和白介素-4（IL-4）的水平比空白組均有所升高。此外東莨菪堿還增加了大鼠腦部凋亡基因的表達(dá)，如半胱天冬酶-3（caspase-3），半胱天冬酶-9（caspase-9）和DNA修復(fù)酶（poly ADP-ribose polymerase；PARP）。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

70只3周齡SPF級(jí)雄性ICR小鼠：購(gòu)自海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；海參花凍干粉：購(gòu)自山東好當(dāng)家海洋發(fā)展股份有限公司；氫溴酸東莨菪堿：購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司;吡拉西坦片：購(gòu)自東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司；氯化鈉注射液：購(gòu)自安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司；動(dòng)物飼料：江南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 儀器與設(shè)備

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置、新物體識(shí)別裝置、Y迷宮裝置、Morris水迷宮裝置、避暗裝置：均由江南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；行為學(xué)分析軟件EthoVision XT：荷蘭Noldus公司產(chǎn)品；分析天平：梅特勒托利多國(guó)際貿(mào)易上海有限公司產(chǎn)品；Agilent 1260高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；氣質(zhì)聯(lián)用儀四極桿質(zhì)譜：美國(guó)布魯克公司產(chǎn)品；凱氏定氮儀：上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司產(chǎn)品；超低溫冷凍冰箱：美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品；臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 成分測(cè)定 水分測(cè)定按照GB5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定》第一法直接干燥法；蛋白質(zhì)測(cè)定按照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》第一法凱氏定氮法；游離脂肪和總脂肪測(cè)定分別按照GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測(cè)定》第一法索氏抽提法和第二法酸水解法；鹽分測(cè)定按照SC/T 3011-2001《水產(chǎn)品中鹽分的測(cè)定》直接滴定法；多糖的測(cè)定按照苯酚硫酸法[30]；灰分測(cè)定按照GB 5009.4-2016《食品中灰分的測(cè)定》第一法食品中總灰分的測(cè)定；氨基酸測(cè)定按照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測(cè)定》；色氨酸采用GB/T 18246-2000堿水解法前處理，高效液相色譜法測(cè)定；脂肪酸測(cè)定按照GB 5009.168-2016《食品中脂肪酸的測(cè)定》完成樣品前處理后，用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）測(cè)定。

1.3.2 動(dòng)物分組及模型建立 70只雄性SPF級(jí)ICR小鼠經(jīng)過(guò)一周自由采食適應(yīng)性飼養(yǎng)后，按體質(zhì)量分為6組[31-32]：空白組、東莨菪堿模型組、吡拉西坦陽(yáng)性組、海參花低劑量組、海參花中劑量組和海參花高劑量組。其中空白組和模型組每組15只，其他組別每組10只。空白組和模型組每日灌胃生理鹽水，陽(yáng)性組按400 mg/kg劑量灌胃吡拉西坦。海參花低、中、高3個(gè)組劑量分別為75、150、450 mg/kg。灌胃體積為10 mL/kg。每日灌胃30 min后，除空白組腹腔注射生理鹽水，其他組別均腹腔注射1 mg/kg的東莨菪堿，注射體積為10 mL/kg。30 d后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。第1天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，緊接著第2天和第3天進(jìn)行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)，休息5 d后進(jìn)行Y迷宮實(shí)驗(yàn)，再休息5 d后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，最后休息6 d后進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在開始前1 h灌胃受試樣品，開始前30 min腹腔注射東莨菪堿。整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中一直給小鼠灌胃受試樣品。

1.3.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

1）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)[33]（open filed test）主要用于評(píng)價(jià)小鼠的自發(fā)活動(dòng)行為和探索行為。曠場(chǎng)裝置由一個(gè)40 cm×40 cm×50 cm的實(shí)驗(yàn)箱組成，上方有紅外攝像頭追蹤小鼠的路徑。底部的測(cè)試區(qū)被分為16塊10 cm×10 cm正方形，中間4塊被定義為中心區(qū)。每只小鼠從曠場(chǎng)中心點(diǎn)放下，自由活動(dòng)10 min。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)箱以消除氣味的影響。記錄小鼠的速度、路程、中心區(qū)域的活動(dòng)時(shí)間等指標(biāo)。

2）新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)[34]（object recognition test）是利用嚙齒類動(dòng)物天生喜歡探索新事物的特點(diǎn)建立的一種學(xué)習(xí)記憶評(píng)價(jià)方法。它主要分為：適應(yīng)期、熟悉期和測(cè)試期。每個(gè)時(shí)期間隔24 h。在適應(yīng)期將小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，自由探索環(huán)境8 min。在熟悉期，箱內(nèi)有兩個(gè)完全相同的的圓柱積木（底部直徑4 cm；高度10 cm），積木擺放的位置距兩邊的墻角分別為5 cm。小鼠在箱內(nèi)自由探索8 min。24 h后將其中一個(gè)圓柱體積木替換為圓錐體積木（底部直徑4 cm；高度10 cm），再次讓小鼠自由活動(dòng)8 min。小鼠在放入箱內(nèi)時(shí)背對(duì)著積木，從積木對(duì)面墻面的中心點(diǎn)放下。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)箱以消除氣味的影響。實(shí)驗(yàn)期間由紅外攝像頭追蹤記錄小鼠對(duì)新、舊物體探索的時(shí)間。評(píng)價(jià)指標(biāo)用辨別指數(shù)（DI）來(lái)計(jì)算，DI=（新物體探索時(shí)間-舊物體探索時(shí)間）/總探索時(shí)間。

3）Y迷宮[35]主要用于評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物的工作記憶。實(shí)驗(yàn)裝置由3個(gè)夾角各呈120°的水平臂組成。實(shí)驗(yàn)期間任意定義3個(gè)臂分別為A、B、C。實(shí)驗(yàn)開始后將小鼠從任意一個(gè)臂內(nèi)放下，紅外攝像頭記錄小鼠進(jìn)入每個(gè)臂的順序和次數(shù)。定義連續(xù)進(jìn)入不同的臂為一次交替（如ABC、BAC、CBA，而不是BAB）。評(píng)價(jià)Y迷宮的指標(biāo)為：自發(fā)交替=交替數(shù)/（進(jìn)入臂的總次數(shù)-2）。每次測(cè)試時(shí)間為5 min，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)箱以消除氣味的影響。

4）Morris水迷宮[36]是評(píng)估嚙齒類動(dòng)物空間記憶最經(jīng)典的方法之一。實(shí)驗(yàn)裝置由一個(gè)直徑120 cm，高60 cm的水池組成。水池按照東、南、西、北被分為4個(gè)象限。實(shí)驗(yàn)期間，水池放入40 cm深的水，并用黑色墨汁染黑。水溫維持在(21±1)℃。實(shí)驗(yàn)分為：臺(tái)可見期、定位航行期和空間探索期3個(gè)時(shí)期。

第1天為平臺(tái)可見期，平臺(tái)高出水面1 cm，同時(shí)放置一面旗幟以增加可視度。水池的四周貼上不同的標(biāo)識(shí)物，供小鼠參考方向。實(shí)驗(yàn)開始后，將小鼠面朝池壁從平臺(tái)順時(shí)針一邊的象限放入，上方紅外攝像頭追蹤小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。測(cè)試時(shí)間為60 s，小鼠在測(cè)試時(shí)間內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間，即為逃避潛伏期。若超過(guò)測(cè)試時(shí)間，逃避潛伏期則記為60 s。每只小鼠進(jìn)行4次訓(xùn)練，每次訓(xùn)練更換平臺(tái)所在的象限位置。

第2天起進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，平臺(tái)固定在水下1 cm處，且在一個(gè)象限內(nèi)不移動(dòng)。實(shí)驗(yàn)開始后，將小鼠面朝池壁從其中一個(gè)象限放入，上方紅外攝像頭追蹤小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。測(cè)試時(shí)間為60 s，小鼠在測(cè)試時(shí)間內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間，即為逃避潛伏期。若超過(guò)測(cè)試時(shí)間，逃避潛伏期則記為60 s。未找到平臺(tái)的小鼠需要引導(dǎo)它找到平臺(tái)并在上面待滿15 s。每只小鼠訓(xùn)練4次，每次從不同的象限放入，連續(xù)訓(xùn)練5 d。

第7天起進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將平臺(tái)從水池撤掉。將小鼠從原先平臺(tái)所在象限的對(duì)角處面朝池壁放入。測(cè)試時(shí)間為60 s，記錄小鼠的速度、潛伏期、路程、穿臺(tái)次數(shù)等指標(biāo)。

5）避暗實(shí)驗(yàn)[37]又稱被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)（passive avoidance），是利用小鼠趨暗避明的特點(diǎn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方法。該實(shí)驗(yàn)常用于檢測(cè)條件性恐懼記憶，適合檢測(cè)小鼠記憶再現(xiàn)過(guò)程。裝置由一個(gè)暗室和一個(gè)明室組成，兩室中間有一扇小門可通過(guò)。底部鋪滿銅柵，暗室的銅柵可通電，電壓為36 V，電流為0.2～0.3 mA。小鼠進(jìn)入暗室一次則記為犯錯(cuò)一次。實(shí)驗(yàn)分為學(xué)習(xí)訓(xùn)練期和記憶保持測(cè)試期。訓(xùn)練前，先將小鼠放入避暗箱內(nèi)自由活動(dòng)3 min以適應(yīng)環(huán)境。

學(xué)習(xí)階段：將小鼠背朝暗室放入明室，此時(shí)暗室通電，并開始計(jì)時(shí)。小鼠從明室進(jìn)入暗室的時(shí)間為潛伏期。整個(gè)訓(xùn)練期為5 min，記錄每只小鼠的第一次潛伏期和整個(gè)實(shí)驗(yàn)中的犯錯(cuò)次數(shù)。

24 h后同一時(shí)間段進(jìn)行記憶保持測(cè)試。斷開暗室的電流，測(cè)試時(shí)間為3 min，其他條件與訓(xùn)練期的相同。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇擦拭實(shí)驗(yàn)箱以消除氣味的影響。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表示為（X±SD）。采用IBM SPSS Statistics 23.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊次后，采用單因素方差分析（ANOVA）。組間有差異時(shí)采用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。當(dāng)數(shù)據(jù)不滿足方差齊次時(shí)，通過(guò)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換來(lái)滿足齊次。若轉(zhuǎn)換后仍然不滿足方差齊次，則采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。組間差異顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01。

2 結(jié)果分析

2.1 海參花基本成分組成

由表1可知海參花是一種蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)低的食物。其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)（62.08±0.83）%。

表1 海參花基本成分組成Table 1 Components of sea cucumber ovum

2.2 海參花氨基酸組成

由表2可知，海參花氨基酸種類豐富，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的是谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）。Glu和Asp是腦部的興奮性氨基酸，在神經(jīng)元信息傳遞中起著重要的作用。此外，有研究表明海參多肽具有抗氧化、降血壓、降血糖、抗疲勞、改善記憶等多種功能，而這些功能機(jī)制又與多肽的氨基酸組成、氨基酸序列和空間構(gòu)象有關(guān)[38-39]。

Rupsingh等[40]研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦部的Glu含量比正常老年人腦部的含量低，這表明海馬體內(nèi)Glu減少可能是AD的一種特征。Hosseini等[41]研究發(fā)現(xiàn)Arg可以延長(zhǎng)大鼠在避暗實(shí)驗(yàn)中的潛伏期并改善機(jī)體的氧化應(yīng)激水平。景洪江等[42]用添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%Gln的飼料喂養(yǎng)大鼠2周后。大鼠的主動(dòng)回避反應(yīng)率顯著增加，被動(dòng)逃避時(shí)間縮短，腦中Glu、Asp、Gln、Arg含量增加。

表2 海參花氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of sea cucumber ovum

2.3 海參花脂肪酸組成

由表3可知，海參花脂肪酸中飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為30%，不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為70%。脂肪酸占比最多的是棕櫚油酸（palmitoleic acid）。Souza等[43]研究發(fā)現(xiàn)棕櫚油酸可改善小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子的基因表達(dá)。目前已知ω-3脂肪酸可以促進(jìn)大腦發(fā)育，提高人的記憶力。海參花中含有的ω-3脂肪酸主要為二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid；EPA）。Kawashima等[44]研究發(fā)現(xiàn)EPA能顯著增加神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)EPA含量以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)DHA的含量。同時(shí)EPA可以通過(guò)調(diào)節(jié)突觸可塑性和激活PI3-K/Akt途徑來(lái)預(yù)防神經(jīng)退行性變。

表3海參花脂肪酸組成Table 3 Fatty acid composition of sea cucumber ovum

2.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4可知小鼠在注射東莨菪堿30 min后，活動(dòng)量增加了。其他組別與空白組相比，路程顯著增加（P＜0.01），速度顯著提高（P＜0.01）。SAHBA等[32]的研究也發(fā)現(xiàn)，東莨菪堿會(huì)增大小鼠的活動(dòng)量，使小鼠情緒上變得焦慮。東莨菪堿對(duì)大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，但對(duì)呼吸系統(tǒng)有興奮作用。模型組在中心區(qū)域停留的時(shí)間比空白組顯著降低（P＜0.01），中心區(qū)域停留時(shí)間的占比顯著減少（P＜0.01）。而海參花對(duì)此結(jié)果有一定改善作用。其中海參花低劑量組與模型組相比，中心區(qū)域停留時(shí)間顯著提高（P＜0.05），中心區(qū)域停留時(shí)間的占比顯著增加（P＜0.05）。而陽(yáng)性組在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中效果并不明顯，只是有一定改善趨勢(shì)。如圖1所示，與空白組相比，模型組的活動(dòng)軌跡主要集中在曠場(chǎng)周圍，自發(fā)探索活動(dòng)大大減少。海參花組的活動(dòng)軌跡與模型組相比更傾向于中心區(qū)域。綜上所述，海參花能夠增加小鼠的探索行為，可能在抗焦慮方面也有一定改善作用。

表4 海參花對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)和探索行為的影響Table 4 Effect of sea cucumber ovum on spontaneous activity and exploration behavior in mice

圖1 海參花對(duì)小鼠軌跡線路的影響Fig.1 Effect of sea cucumber ovum on mouse trajectory

2.5 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表5可知：與空白組相比，模型組的辨別指數(shù)顯著降低（P＜0.01），這表明東莨菪堿明顯降低了小鼠的學(xué)習(xí)和認(rèn)知記憶能力。而海參花低劑量組顯著提高了辨別指數(shù)（P＜0.05），海參花中劑量組和高劑量組也有提高的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。陽(yáng)性組也顯著提高了小鼠的辨別指數(shù)（P＜0.05），略低于海參花低劑量組。綜上所述，海參花能改善東莨菪堿造成的小鼠學(xué)習(xí)能力和認(rèn)知記憶的損傷。

2.6 Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表6可知：與空白組相比，模型組自發(fā)交替顯著降低（P＜0.01）。這表明東莨菪堿會(huì)損傷小鼠的工作記憶和參考記憶。海參花低劑量組（P＜0.01）和中劑量組（P＜0.05）顯著提高了小鼠的自發(fā)交替。陽(yáng)性組表現(xiàn)最好，也顯著提高了小鼠的辨別指數(shù)（P＜0.01）。綜上所述，海參花能夠改善東莨菪堿對(duì)小鼠工作記憶和參考記憶的損傷。

表5 海參花對(duì)小鼠辨別指數(shù)的影響Table 5 Effect of sea cucumber ovum on mouse discrimination index

表6 海參花對(duì)小鼠自發(fā)交替的影響Table 6 Effect of sea cucumber ovum on spontaneous alternation in mice

2.7 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7.1平臺(tái)可見期實(shí)驗(yàn)結(jié)果 可見期實(shí)驗(yàn)是為了排除小鼠在游泳能力、視覺能力上的差異，這些因素與水迷宮的指標(biāo)有很大關(guān)系。由表7可知：各組小鼠在逃避潛伏期、路程、速度上均無(wú)顯著性差異。說(shuō)明各組小鼠的視力和游泳能力沒(méi)有差別。

2.7.2 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表8可知：隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，小鼠找到平臺(tái)的速度越來(lái)越快，逃避潛伏期越來(lái)越短。到第五天訓(xùn)練時(shí)，與空白組相比，模型組的逃避潛伏期較大，但沒(méi)有出現(xiàn)顯著性差異。海參花組有降低逃避潛伏期的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。

2.7.3 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表9可知：在速度沒(méi)有顯著差異的條件下，模型組的逃避潛伏期比空白組顯著增加（P＜0.01），海參花低劑量組（P＜0.01）和高劑量組（P＜0.05）與模型組相比，顯著降低了逃避潛伏期。模型組在平臺(tái)區(qū)域累計(jì)時(shí)間（P＜0.01）和穿越次數(shù)（P＜0.01）也比空白組顯著減少。海參花低劑量和高劑量顯著增加了小鼠在平臺(tái)區(qū)域的累計(jì)時(shí)間（P＜0.05）。平臺(tái)區(qū)域穿越次數(shù)：海參花低劑量組較模型組顯著增加（P＜0.05），海參花中劑量組和高劑量組均有增加的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。平臺(tái)穿越次數(shù)：模型組比空白組少，海參花組相比模型組有改善趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。陽(yáng)性組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比差別不大，僅有一點(diǎn)改善趨勢(shì)。結(jié)合圖2能夠更加直觀地看出上述結(jié)果。綜上所述，海參花能改善東莨菪堿導(dǎo)致的小鼠空間記憶損傷。

表7 平臺(tái)可見期實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Platform visible period experiment results

表8 海參花對(duì)小鼠定位航行逃避潛伏期的影響Table 8 Effect of sea cucumber ovum on training escape latency of mice

表9 海參花對(duì)小鼠在空間探索實(shí)驗(yàn)中的影響Table 9 Effect of sea cucumber ovum on mice in space exploration experiments

圖2 海參花對(duì)小鼠空間探索軌跡的影響Fig.2 Effect of sea cucumber ovum on trajectory of space exploration in mice

2.8 避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果

除了上述的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)外，還研究了海參花對(duì)小鼠被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)的影響。由表10可知：訓(xùn)練期間，與空白組相比，模型組小鼠進(jìn)入通電暗室的潛伏期顯著降低（P＜0.01），犯錯(cuò)受電擊的次數(shù)顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，海參花3個(gè)劑量組在這兩個(gè)指標(biāo)上均有顯著改善，其中海參花中劑量組和高劑量組能顯著增加小鼠進(jìn)入通電暗室的潛伏期（P＜0.01），同時(shí)顯著降低小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)（P＜0.01）。陽(yáng)性組與模型組相比，潛伏期顯著增加（P＜0.01），錯(cuò)誤次數(shù)顯著降低（P＜0.01）。

在測(cè)試期，考慮到電擊對(duì)小鼠的刺激和傷害較大，關(guān)閉了暗室的電擊。結(jié)果表明：模型組比空白組的潛伏期顯著減少（P＜0.01），錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加（P＜0.01）。而與模型組相比，海參花低劑量組的潛伏期顯著增加（P＜0.05），錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；海參花高劑量組的潛伏期顯著增加（P＜0.05）；海參花中劑量組錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。陽(yáng)性組的潛伏期增加，錯(cuò)誤次數(shù)減少，但無(wú)顯著性差異。綜上所述，海參花能提高東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶損傷小鼠的被動(dòng)回避反應(yīng)能力和恐懼記憶再現(xiàn)能力。

表10 海參花對(duì)小鼠在避暗實(shí)驗(yàn)中潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)的影響Table 10 Effect of sea cucumber ovum on latency and number of errors of mice in step-through task

3 結(jié)語(yǔ)

作者對(duì)海參花的主要成分進(jìn)行了分析測(cè)定，結(jié)果表明：海參花是一種蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)低的食物。海參花含有不飽和脂肪酸和多糖，且氨基酸種類豐富，可作為蛋白質(zhì)來(lái)源。本研究利用東莨菪堿建立小鼠記憶障礙模型來(lái)評(píng)估海參花改善小鼠學(xué)習(xí)和記憶的功效。結(jié)果表明：海參花在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中能增加模型組在中心區(qū)域的探索行為；在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中能改善模型組的學(xué)習(xí)能力和認(rèn)知記憶；在Y迷宮中能改善模型組的工作記憶和參考記憶；在Morris水迷宮中能改善模型組的空間記憶；在避暗實(shí)驗(yàn)中能改善小鼠的被動(dòng)回避反應(yīng)能力和恐懼記憶再現(xiàn)能力。海參花對(duì)小鼠學(xué)習(xí)和記憶的改善效果并未隨海參花劑量的增大而增強(qiáng)，綜合效果最好的是海參花低劑量組，原因有待在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討。綜上所述，本研究證明海參花在改善學(xué)習(xí)和記憶方面具有一定功效，為海參花進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一些理論依據(jù)。同時(shí)能夠給海參養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益。