Umutumwa Eric Principe，喬郅鈉，龍夢(mèng)飛，邵明龍，徐美娟，2，楊套偉，張 顯，饒志明*

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院/工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)(如皋)食品生物技術(shù)研究所,江蘇 南通226500)

4-羥基異亮氨酸(4-HIL)是一種很有前景的藥物,它具有促進(jìn)胰島素分泌、改善外周組織對(duì)胰島素的抵抗性和調(diào)節(jié)血脂異常等作用[1-9]。因此,目前針對(duì)4-HIL的研究也越來(lái)越多。

酶催化法進(jìn)行(2S,3R,4S)-4-HIL的合成是比較理想的方法[10]。Kodera等于2009年首次在蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)中發(fā)現(xiàn)了一種酶IDO,這種酶能特異性地催化底物L(fēng)-ILe生成(2S,3R,4S)-4-HIL[11-14],該酶的發(fā)現(xiàn)為4-HIL的生物合成奠定了基礎(chǔ)。此外,Smirnov等通過(guò)對(duì)菌株進(jìn)行代謝途徑以及過(guò)表達(dá)羥化酶的方式實(shí)現(xiàn)了L-ILe向4-HIL的轉(zhuǎn)化,其產(chǎn)率高達(dá)82%[13]。近年來(lái),天津科技大學(xué)陳寧等通過(guò)代謝工程改造,在L-ILe高產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌中實(shí)現(xiàn)了4-HIL的高產(chǎn),產(chǎn)量高達(dá)34.21 g/L[15]。

IDO屬Fe/αKGDs家族酶,L-ILe羥基化生成4-HIL的反應(yīng)過(guò)程中需要氧氣及輔因子包括Fe2+、α-酮戊二酸(α-KG)和抗壞血酸[16-18]。此外,該酶受pH影響較大,且存在底物抑制現(xiàn)象。因此,對(duì)此酶進(jìn)行改造,并對(duì)比酶活提高的突變株的羥基化反應(yīng)體系進(jìn)行研究,將會(huì)為4-HIL的高效合成提供理論基礎(chǔ)。

作者克隆了江南大學(xué)菌種庫(kù)保藏的蘇云金芽孢桿菌的ido基因,通過(guò)同源建模和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析,對(duì)該基因進(jìn)行定點(diǎn)突變,構(gòu)建了比酶活提高的突變型菌株E.coliBL21/pET28a-idoI156A,然后對(duì)其催化體系進(jìn)行研究,并在最優(yōu)條件下對(duì)突變株進(jìn)行補(bǔ)料分批轉(zhuǎn)化,最終得到77.3 mmol/L 4-HIL,為高效合成4-HIL提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌Escherichia coliBL21(DE3)以及質(zhì)粒pET28a均由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)由江南大學(xué)微生物菌種保藏中心保藏。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 限制性內(nèi)切酶(EcoR I、Hind III)、DL10000 DNA Marker、蛋白質(zhì)marker：購(gòu)于大連寶生物公司；高保真酶、同源重組酶克隆試劑盒：購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司；2,4-二硝基氟苯、N,N-二甲基甲酰胺、L-異亮氨酸(2S,3R,4S)-4-HIL標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于阿拉丁公司；分析純?chǔ)?酮戊二酸：購(gòu)于麥克林公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) PCR擴(kuò)增所用引物通過(guò)南京金唯智生物有限公司來(lái)合成,引物見表1。

表1 基因克隆及定點(diǎn)突變引物Table 1 Primers used for site-directed mutagenesis and gene

1.1.4 培養(yǎng)基及底物轉(zhuǎn)化液的配制 LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10,酵母粉5,氯化鈉10；pH 7.0,固體培養(yǎng)基則加1.5~2.0 g/dL的瓊脂粉,121℃滅菌20分鐘。

1.2 野生型菌株與突變菌株的構(gòu)建

1.2.1 突變點(diǎn)的選擇 根據(jù)克隆得到的L-異亮氨酸羥化酶基因表達(dá)后的氨基酸序列,利用Swiss-Model和I-TASSER網(wǎng)站進(jìn)行L-異亮氨酸羥化酶三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。本著將與底物氨基酸側(cè)鏈結(jié)合的氨基酸殘基從親水性或長(zhǎng)鏈?zhǔn)杷越Y(jié)構(gòu)突變成Ala的原則,對(duì)該基因I156位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。

1.2.2ido基因及含突變點(diǎn)基因的克隆 根據(jù)NCBI上Bacillus thuringiensisstrain TUST1的ido(GenBank：KC884243.1)序列設(shè)計(jì)引物(見表1),以IDO-F和IDO-R為引物,以蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增ido基因。

采用重疊延伸定點(diǎn)突變的方式對(duì)ido基因進(jìn)行突變。以ido基因的上游引物(IDO-F)和引入突變的下游引物(I156A-R)、ido基因的下游引物(IDOR)和引入突變的上游引物(I156A-F),分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到2段含I156A突變點(diǎn)的基因序列；然后以這2段序列互為模板,以IDO-F和IDO-R為引物,繼續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,則得到包含突變點(diǎn)的基因序列。PCR條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性45 s,58℃復(fù)性45 s,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.3 重組菌E.coliBL21/pET28a-ido和E.coliBL21/pET28a-idoI156A的構(gòu)建 分別將上面PCR得到的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收,膠回收的產(chǎn)物與經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切線性化的pET28a載體通過(guò)同源重組的方式進(jìn)行連接,然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3),即可獲得E.coliBL21/pET28aido野生型菌株和E.coliBL21/pET28a-idoI156A突變型菌株。

1.3 野生菌株與突變菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

將野生菌株與突變菌株先在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化,然后按1%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為50μg/mL的卡那霉素抗性,37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)10~12 h,之后再按1%的接種體積分?jǐn)?shù),轉(zhuǎn)接到50 mL的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為50μg/mL的卡那霉素抗性。最后按參考文獻(xiàn)[10]對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE檢測(cè)看酶的表達(dá)情況,其中對(duì)照為不含目的基因的、轉(zhuǎn)化有pET28a的E.coliBL21(DE3)。經(jīng)Ni-NTA親和層析柱對(duì)野生酶IDO及突變酶I156A進(jìn)行純化[19],Bradford法測(cè)定純化的野生酶和突變酶的濃度,標(biāo)準(zhǔn)樣品為牛血清蛋白。

1.4 酶活測(cè)定與產(chǎn)物4-HIL的檢測(cè)

酶活測(cè)定體系：20 mmol/L L-ILe,20 mmol/L α-KG,1 mmol/L FeSO4·7H2O,5 mmol/L抗壞血酸,pH 7.0的50 mmol/L HEPES,2 mg/mL純酶。

1個(gè)酶活力單位是指在25℃條件下,單位時(shí)間催化L-ILe反應(yīng)生成1μmol產(chǎn)物4-HIL所需的酶量。比酶活定義為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活,單位為U/mg。

產(chǎn)物4-HIL的HPLC檢測(cè)方法為[20],轉(zhuǎn)化液經(jīng)衍生化處理后,用C18柱反相高效液相色譜測(cè)定；洗針用體積分?jǐn)?shù)10%甲醇；后進(jìn)行自動(dòng)進(jìn)樣,氨基酸洗脫方法為：T=33℃,λ=360 nm,進(jìn)樣20μL,時(shí)間為30 min,流量為1 mL/min。

1.5 野生酶與突變酶酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

1.5.1 最適反應(yīng)溫度 1 mL反應(yīng)體系內(nèi)加入20 mmol/L L-異亮氨酸、20 mmol/Lα-KG、1 mmol/L FeSO4·7H2O、5 mmol/L抗壞血酸和900μL pH 7.0的50 mmol/L HEPES緩沖液,然后分別加入100μL的野生酶與突變酶,迅速放入不同溫度的水浴鍋中進(jìn)行反應(yīng),30分鐘后,沸水浴5 min終止反應(yīng),離心取上清液,HPLC測(cè)定酶活。

1.5.2 最適反應(yīng)pH值 同樣采用1 mL的反應(yīng)體系,保持反應(yīng)溫度為25℃,將反應(yīng)的緩沖液更換成不同pH值的檸檬酸鈉-檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.0~5.0)、PBS緩沖液(pH 6.0~8.0)和Tris-HCl緩沖液(pH 9.0~10.0),pH值的反應(yīng)梯度為1,然后分別加入野生酶與突變酶反應(yīng)30 min,沸水浴5 min終止反應(yīng),離心取上清液,HPLC測(cè)定酶活。

1.5.3 溫度穩(wěn)定性 將野生酶與突變酶放在不同的溫度(30~50℃)下,熱處理不同時(shí)間,然后在25℃、pH 7.0的條件反應(yīng)30 min,HPLC法下測(cè)殘余酶活,以保溫前的酶活為100%,測(cè)定熱處理不同時(shí)間后野生酶及突變酶在不同溫度下的殘余酶活。

1.6 野生酶與突變酶比酶活比較

在1 mL的反應(yīng)體系中加入20 mmol/L L-異亮氨酸、20 mmol/Lα-KG、1 mmol/L FeSO4·7H2O、5 mmol/L抗壞血酸和pH 7.0的50 mmol/L HEPES緩沖液,然后分別加入100μL 2 mg/mL的野生酶與突變酶,25℃反應(yīng)30分鐘后,沸水浴5 min終止反應(yīng),離心取上清液,HPLC測(cè)定酶活。

1.7 野生酶與突變酶的結(jié)構(gòu)分析

利用Swiss-Model和I-TASSER網(wǎng)站同源建模獲得L-異亮氨酸羥化酶的結(jié)構(gòu)模型,利用Pymol軟件對(duì)L-異亮氨酸羥化酶可能的底物結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析[21],本著將與底物氨基酸側(cè)鏈結(jié)合的氨基酸殘基從親水性或長(zhǎng)鏈?zhǔn)杷越Y(jié)構(gòu)突變成Ala的原則,對(duì)I156位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變。最后,通過(guò)Discover Studio 4.0進(jìn)行底物L(fēng)-ILe和L-異亮氨酸羥化酶的分子對(duì)接[22],并利用VMD軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分析[23]。

1.8 突變菌株催化體系研究

1.8.1 底物L(fēng)-ILe濃度對(duì)4-HIL產(chǎn)生的影響 設(shè)置不同底物濃度10～60 mmol/L,分別加入20 mmol/L α-KG、1 mmol/L FeSO4·7H2O、5 mmol/L抗壞血酸和pH 7.0的50 mmol/L HEPES緩沖液,25℃、pH 7.0條件下反應(yīng)30 min。HPLC檢測(cè)4-HIL產(chǎn)量。

1.8.2 α-KG濃度對(duì)4-HIL產(chǎn)生的影響 設(shè)置不同α-KG濃度為10～50 mmol/L,分別加入20 mmol/L L-ILe、1 mmol/L FeSO4·7H2O、5 mmol/L抗壞血酸和pH 7.0的50 mmol/L HEPES緩沖液,25℃、pH 7.0條件下反應(yīng)30 min。HPLC檢測(cè)4-HIL產(chǎn)量。

1.8.3 Fe2+濃度對(duì)4-HIL產(chǎn)生的影響 設(shè)置Fe2+濃度 分 別 為0.5、1.5、2.5、3.5、5.0、6.5、8.0 mmol/L和10.0 mmol/L,分別加入20 mmol/L L-ILe、20 mmol/L α-KG、5 mmol/L抗壞血酸和pH 7.0的50 mmol/L HEPES緩沖液,25℃、pH 7.0條件下反應(yīng)30 min。HPLC檢測(cè)4-HIL產(chǎn)量。

1.8.4 抗壞血酸濃度對(duì)4-HIL產(chǎn)生的影響 設(shè)置不同抗壞血酸濃度為10～50 mmol/L,分別加入20 mmol/L L-ILe、20 mmol/Lα-KG、8 mmol/L FeSO4·7H2O和pH 7.0的50 mmol/L HEPES緩沖液,25℃、pH 7.0條件下反應(yīng)30 min。HPLC檢測(cè)4-HIL產(chǎn)量。

1.8.5 不同轉(zhuǎn)化液對(duì)4-HIL產(chǎn)生的影響 在L-ILe、α-KG、FeSO4·7H2O和抗壞血酸濃度均為最優(yōu)的情況下,分別研究了H2O、pH 7.0的50 mmol/L Bis-Tris緩沖液、pH 7.0的50 mmol/L Tris-HCI緩沖液、pH 7.0的50 mmol/L HEPES緩沖液和pH 7.0的50 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液共5種轉(zhuǎn)化液對(duì)4-HIL的產(chǎn)生有無(wú)影響；在25℃、pH 7.0條件下反應(yīng)30 min。HPLC檢測(cè)4-HIL產(chǎn)量。

1.9 野生菌與突變體分批補(bǔ)料生產(chǎn)4-HIL

在50 mL體系中,分別加入20 mmol/L L-ILe、20 mmol/Lα-KG、8 mmol/L FeSO4·7H2O、30 mmol/L抗壞血酸、pH 7.0的50 mmol/L HEPES以及相同量的野生酶與突變酶(OD600nm大約為50左右破細(xì)胞所得粗酶液),每隔4小時(shí)投加底物一次,在投加底物前后均取樣,HPLC檢測(cè)4-HIL產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的克隆及表達(dá)

2.1.1 野生型菌株與突變菌株的構(gòu)建情況 以提取的蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis的基因組為模板,按1.2中方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳,跑膠結(jié)果見圖1,ido基因及含點(diǎn)突變的基因大小均為723 bp左右。

圖1 ido基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of ido gene and mutated gene

將膠回收的PCR產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)EcoR I和Hind III雙酶切線性化的pET28a質(zhì)粒進(jìn)行同源重組酶切連接,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,涂卡那霉素抗性平板,37℃培養(yǎng)8~12 h。挑取平板上的轉(zhuǎn)化子,進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證(見圖2),驗(yàn)證為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子送往測(cè)序機(jī)構(gòu)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序如正確,則野生型菌株E.coliBL21/pET28a-ido和突變型菌株E.coliBL21/pET28a-idoI156A構(gòu)建成功。根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析,ido基因的序列和NCBI上Bacillus thuringiensisstrain TUST1的ido基因序列相似度為97.65%,將蘇云金芽孢桿菌的ido基因和研究較為清晰的Bacillus thuringiensis2-e-2的ido序列進(jìn)行對(duì)比分析,發(fā)現(xiàn)該基因的核苷酸和氨基酸序列相似度分別為98.06%和98.75%。

圖2 菌落PCR驗(yàn)證Fig.2 Colony PCR verification

2.1.2 野生酶和突變酶的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將構(gòu)建好的野生型菌株和突變型菌株先進(jìn)行劃線活化12~24 h,然后接種在含10 mL LB液體培養(yǎng)基的小瓶,最后轉(zhuǎn)接種至含50 mL LB液體培養(yǎng)基的大瓶,37℃、180 r/min培養(yǎng)大約2~3 h,待菌體的OD600nm大約為0.6左右時(shí),添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)(IPTG終濃度為0.1 mmol/L),最后,在25℃、180 r/min條件下誘導(dǎo)20 h左右。

將誘導(dǎo)完的野生型菌株和突變型菌株進(jìn)行離心收集菌體,進(jìn)行細(xì)胞破碎,離心獲得細(xì)胞破碎上清液,然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳看蛋白質(zhì)的表達(dá)情況(見圖3),結(jié)果顯示,野生酶和突變酶均有表達(dá),大小為27 900左右。

圖3 IDO蛋白質(zhì)的表達(dá)Fig.3 IDO protein expression

將細(xì)胞破碎液的上清液進(jìn)行純化,將純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,其結(jié)果見圖4。

圖4 SDS-PAGE分析野生酶和I156A突變酶的純化Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified wild-type enzyme and the mutated enzyme I156A

2.2 L-異亮氨酸羥化酶的催化功能驗(yàn)證

采用2,4-二硝基氟苯對(duì)L-ILe和(2S,3R,4S)-4-HIL標(biāo)準(zhǔn)品及轉(zhuǎn)化液進(jìn)行衍生化處理,通過(guò)HPLC法對(duì)其進(jìn)行分析。L-ILe標(biāo)準(zhǔn)品、(2S,3R,4S)-4-HIL標(biāo)準(zhǔn)品和轉(zhuǎn)化液的HPLC分析結(jié)果分別見圖5(a)—(c)。

圖5 L-ILe,(2S,3R,4S)-4-HIL標(biāo)準(zhǔn)品及轉(zhuǎn)化液的HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatogram of L-ILe,(2S,3R,4S)-4-HIL standards and conversion solutions

2.3 野生酶與突變酶的部分酶學(xué)性質(zhì)比較分析

2.3.1 野生酶與突變酶的最適反應(yīng)溫度和最適pH測(cè)定 將野生酶和I156A突變酶分別置于不同的溫度下,測(cè)定它們?cè)诓煌瑴囟认碌拿富?見圖6(a),野生酶和突變酶的最適反應(yīng)溫度并沒(méi)有發(fā)生明顯變化,都為25℃左右。當(dāng)溫度高于25℃時(shí),野生酶相對(duì)酶活下降速度比突變酶快。

將野生酶和I156A突變酶分別置于不同的pH中,測(cè)定它們?cè)诓煌琾H下的酶活,如圖6(b)所示,重組酶和突變酶的最適反應(yīng)pH并沒(méi)有發(fā)生明顯變化,都為7.0。

圖6 野生酶和I156A突變酶的最適溫度和最適pHFig.6 Optimum temperature and p H for wild-type enzyme and the mutated enzyme I156A

2.3.2 野生酶與突變酶溫度穩(wěn)定性測(cè)定 將野生酶與突變酶分別在30、35、40℃和50℃下放置不同時(shí)長(zhǎng),然后與未進(jìn)行熱處理的酶一起測(cè)酶活,結(jié)果見圖7。從圖7(a)可知,野生酶在30、35℃和40℃下處理8 h,仍保持80%以上的比酶活；而在50℃下熱處理2 h,IDO基本喪失活性。而從圖7(b)可知,突變體的溫度穩(wěn)定性與野生酶基本無(wú)區(qū)別,也就是說(shuō),突變酶I156A的熱穩(wěn)定性并沒(méi)有得到改善。

2.4 野生酶與突變酶比酶活比較分析

在酶量相同的情況下,比較野生酶及突變酶的酶活并計(jì)算其比酶活。如圖8,野生酶的比酶活為0.84 U/mg,突變酶的比酶活是野生酶的1.9倍,為1.58 U/mg。

圖7 野生酶和I156A突變酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of wild-type enzyme and the mutated enzyme I156A

圖8 野生酶和I156A突變酶的比酶活Fig.8 The specific activity of wild-type enzyme and the mutated enzyme I156A

2.5 野生酶及突變酶結(jié)構(gòu)解析結(jié)果

L-異亮氨酸羥化酶屬Fe2+和α-KG依賴型酶,因此,將L-異亮氨酸羥化酶與Fe/αKGDs家族典型酶TauD(1GY9)進(jìn)行結(jié)構(gòu)對(duì)比,對(duì)底物結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),推測(cè)其底物結(jié)合位點(diǎn)可能是H139、Y81、P155和D162。因此,選取P155位點(diǎn)對(duì)底物L(fēng)-ILe進(jìn)行分子對(duì)接。

從對(duì)接結(jié)果來(lái)看(見圖9),第156位的異亮氨酸(I)突變成丙氨酸(A)后,底物L(fēng)-ILe的結(jié)合口袋變大了,拓寬了底物通道。

圖9 野生酶與I156A突變酶與底物L(fēng)-ILe的分子對(duì)接Fig.9 Molecular docking of wild-type enzyme and I156A mutated enzyme with substrate L-ILe

2.6 突變株羥基化反應(yīng)催化體系的研究

2.6.1 底物L(fēng)-ILe濃度對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響 從圖10可知,在L-ILe濃度為20～50 mmol/L時(shí),4-HIL產(chǎn)量變化不大,且在L-ILe濃度為20 mmol/L時(shí),轉(zhuǎn)化率最高,為87.5%,此時(shí)4-HIL產(chǎn)量為10.1 mmol/L；當(dāng)L-ILe濃度為60 mmol/L時(shí),轉(zhuǎn)化率下降為53.6%,此時(shí)4-HIL產(chǎn)量?jī)H為7.41 mmol/L。

圖10 L-ILe濃度對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響Fig.10 Effect of L-ILeconcentration on 4-HIL production

2.6.2 α-KG濃度對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響 IDO羥基化反應(yīng)需要α-KG的參與,其羥基化反應(yīng)與α-KG氧化脫羧反應(yīng)相耦聯(lián),因此反應(yīng)體系中α-KG濃度會(huì)影響IDO的酶活及4-羥基異亮氨酸的合成[8,13,24]。

如圖11所示,α-KG濃度在10～20 mmol/L時(shí),4-HIL產(chǎn)量隨著α-KG濃度的升高而升高,當(dāng)α-KG濃度為20 mmol/L時(shí),4-HIL產(chǎn)量達(dá)到最大,為12.92 mmol/L。當(dāng)α-KG濃度高于20 mmol/L時(shí),4-HIL產(chǎn)量下降,特別是α-KG濃度為50 mmol/L時(shí),4-HIL產(chǎn)量?jī)H為5.44 mmol/L?？赡苁且?yàn)楦邼舛鹊摩?KG抑制了IDO的羥基化反應(yīng),使整個(gè)反應(yīng)趨向于α-KG氧化脫羧,生成了副產(chǎn)物琥珀酸,而琥珀酸的過(guò)量積累不利于4-HIL的產(chǎn)生。

圖11 α-KG濃度對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響Fig.11 Effect ofα-KGconcentration on 4-HIL production

2.6.3 Fe2+濃度對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響 在L-ILe羥基化生成4-HIL的反應(yīng)過(guò)程中,Fe2+會(huì)與α-KG的C1位的羧基和C2位的羰基結(jié)合進(jìn)而形成八面配位體復(fù)合物,在α-KG氧化脫羧的同時(shí),Fe2+會(huì)被氧化生成高價(jià)鐵-超氧復(fù)合體(Fe(IV)=O),而Fe(IV)=O是L-ILe羥基化生成4-HIL過(guò)程中的關(guān)鍵復(fù)合體,因此,酶促反應(yīng)體系中Fe2+的含量會(huì)影響Fe(IV)=O的形成和4-HIL的產(chǎn)生[8]。由圖12可知,4-HIL的產(chǎn)量隨著Fe2+濃度的升高而升高,當(dāng)Fe2+濃度為8 mmol/L時(shí),4-HIL產(chǎn)量最高,為13.5 mmol/L；當(dāng)Fe2+濃度升高至10 mmol/L時(shí),4-HIL產(chǎn)量下降為5.32 mmol/L。

圖12 Fe2+濃度對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響Fig.12 Effect of Fe2+concentration on 4-HIL production

2.6.4 抗壞血酸濃度對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響 在L-ILe羥基化生成4-HIL的反應(yīng)過(guò)程中,不光要有適當(dāng)濃度的Fe2+,同時(shí)也必須要有充足的氧氣。如圖13,抗壞血酸濃度在10～30 mmol/L時(shí),4-HIL的產(chǎn)量隨著抗壞血酸濃度的升高而升高,且在抗壞血酸濃度為30 mmol/L時(shí),4-HIL產(chǎn)量達(dá)到最高,為13.9 mmol/L。這可能是因?yàn)榭箟难釢舛仍?0～30 mmol/L時(shí),能夠?qū)⒈谎趸腇e2+還原,且在抗壞血酸濃度為30 mmol/L時(shí),Fe2+濃度也為最適濃度,4-HIL產(chǎn)量最高；當(dāng)抗壞血酸濃度高于30 mmol/L時(shí),一方面抗壞血酸將被氧化的Fe2+還原導(dǎo)致Fe2+濃度過(guò)高,影響Fe(IV)=O的形成；另一方面,抗壞血酸會(huì)消耗氧氣進(jìn)而影響反應(yīng)體系的氧化性,因此,4-HIL產(chǎn)量降低。

圖13 抗壞血酸濃度對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響Fig.13 Effect of ascorbic acid concentration on 4-HIL production

2.6.5 不同轉(zhuǎn)化緩沖液對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響 在L-ILe羥基化生成4-HIL的反應(yīng)過(guò)程中,Fe2+和整個(gè)反應(yīng)體系的pH會(huì)對(duì)4-HIL的產(chǎn)生有影響,因此,需分析不同轉(zhuǎn)化液對(duì)4-HIL產(chǎn)量有無(wú)影響,結(jié)果見圖14。由圖可知,pH 7.0的50 mmol/L HEPES緩沖液更適合4-HIL的生產(chǎn),產(chǎn)量高達(dá)14.8 mmol/L。這可能是因?yàn)镠EPES緩沖液具有很好的緩沖能力,能夠?qū)⒎磻?yīng)體系的pH較長(zhǎng)時(shí)間維持在7.0左右。

圖14 不同轉(zhuǎn)化緩沖液對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響Fig.14 Effect of different transformation buffers on 4-HIL production

2.7 野生型菌株和突變型菌株粗酶液分批轉(zhuǎn)化結(jié)果

從圖15可知,在轉(zhuǎn)化的前8 h,野生型菌株與突變株4-HIL產(chǎn)量相近,野生型菌株4-HIL產(chǎn)量為24.6 mmol/L,突變株4-HIL產(chǎn)量為28.4 mmol/L；但8 h以后,野生型菌株轉(zhuǎn)化L-ILe生成4-HIL的能力下降,而突變株轉(zhuǎn)化能力雖有下降但仍較野生型高。最后,轉(zhuǎn)化32 h后,野生型菌株4-HIL產(chǎn)量?jī)H為54.2 mmol/L,而I156A突變株4-HIL產(chǎn)量達(dá)到77.3 mmol/L,為野生型菌株的1.43倍。突變株4-HIL產(chǎn)量提高的可能原因是,由于突變,底物口袋變大,拓寬了底物通道。對(duì)于野生型菌株來(lái)說(shuō),酶結(jié)構(gòu)底物口袋很快達(dá)到飽和狀態(tài),即使再投加底物,酶已不能繼續(xù)進(jìn)行催化；但突變后,底物口袋可以容納更多的底物,因此,4-HIL產(chǎn)量較野生型高。

3 結(jié) 語(yǔ)

4-HIL的藥理作用較為廣泛,主要包括降血糖、降血脂、改善外周組織對(duì)胰島素的抵抗性等,是一種非常有前景的藥物。作者從蘇云金芽孢桿菌中克隆L-異亮氨酸羥化酶(IDO),在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了異源表達(dá)。通過(guò)Ni-NTA親和柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化得到純酶,并對(duì)其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。然后通過(guò)同源建模和蛋白結(jié)構(gòu)分析,本著將與底物氨基酸側(cè)鏈結(jié)合的氨基酸殘基從親水性或長(zhǎng)鏈?zhǔn)杷越Y(jié)構(gòu)突變成Ala的原則,對(duì)該基因I156位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。突變酶I156A比酶活比野生酶提高了1.9倍。最后以突變體重組菌I156A出發(fā),考察羥基化反應(yīng)體系中,底物L(fēng)-ILe濃度、α-酮戊二酸濃度、Fe2+濃度、抗壞血酸濃度以及轉(zhuǎn)化液對(duì)4-HIL產(chǎn)生的影響。確定了最終轉(zhuǎn)化體系為：20 mmol/L L-異亮氨酸、20 mmol/Lα-KG、8 mmol/L FeSO4·7H2O、30 mmol/L抗壞血酸和pH 7.0的50 mmol/L HEPES緩沖液。在最優(yōu)轉(zhuǎn)化體系條件下結(jié)合分批補(bǔ)料的方式,轉(zhuǎn)化32 h,可以產(chǎn)生77.3 mmol/L 4-HIL。

此外,在研究不同轉(zhuǎn)化液對(duì)4-HIL產(chǎn)量的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)用純水作為轉(zhuǎn)化液,依然可以轉(zhuǎn)化底物L(fēng)-ILe生成4-HIL,可以降低生產(chǎn)成本。

圖15 野生型菌株和I156A突變株的分批轉(zhuǎn)化Fig.15 Batch conversion of wild-type stain and the mutated strain I156A