張 麗，劉 璐，張文韜，陳周耀，王 冕，劉妍驛，姜 麗*

(1.蘇州市職業(yè)大學(xué) 教育與人文學(xué)院,江蘇 蘇州215104；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,江蘇 南京210095；3.蘇州市吳中區(qū)果蔬園藝站,江蘇 蘇州215107)

芫荽為葉菜類(lèi),其表面微生物數(shù)量多,種類(lèi)復(fù)雜。微生物的侵染不僅會(huì)影響芫荽的外觀,實(shí)質(zhì)上也降低了食用價(jià)值,減少貨架期時(shí)間[1]。芫荽種植的土壤、氣候等環(huán)境條件不同[2],隨著種植技術(shù)的提高與范圍的擴(kuò)大,鮮切加工規(guī)模的不斷擴(kuò)大,從田間到餐桌的環(huán)節(jié)增多,這些都增加了鮮切芫荽微生物污染的風(fēng)險(xiǎn),也增加了微生物控制的難度。

次氯酸鈉、氯氣、次氯酸鈣等能在水中產(chǎn)生次氯酸的殺菌劑總稱(chēng)為含氯殺菌劑,其中次氯酸鈉是目前應(yīng)用最廣泛的含氯殺菌劑[3]。此殺菌劑以氯為主,在水溶液中形成有強(qiáng)氧化性的次氯酸,次氯酸可穿透微生物的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,與胞內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)生氯化反應(yīng)從而凝固細(xì)胞液,可有效殺死細(xì)菌,效果明顯且反應(yīng)速度快[4]。目前,很多企業(yè)主要使用次氯酸鈉作為殺菌劑,并主要監(jiān)測(cè)菌落總數(shù)與大腸菌群的控制情況。由于次氯酸鈉可能存在氯殘留而對(duì)人體健康產(chǎn)生危害[5],因此需要擴(kuò)充綠色安全的殺菌劑種類(lèi),不斷挖掘新的殺菌劑并嚴(yán)格控制其使用濃度。

過(guò)氧乙酸是一種酸性強(qiáng)氧化劑,易溶于水、乙醇、乙醚、硫酸等溶劑,有強(qiáng)烈的刺激性酸味,對(duì)人的眼睛、皮膚、黏膜和上呼吸道有刺激作用,性質(zhì)不穩(wěn)定,遇熱或有機(jī)物、金屬離子、強(qiáng)堿等易分解。

過(guò)氧乙酸可殺滅細(xì)菌繁殖體、真菌、病毒、分枝桿菌、細(xì)菌芽孢等微生物,且在低溫下仍有效,其殺菌效果受濃度、溫度、相對(duì)濕度、有機(jī)物等因素影響[7]。過(guò)氧乙酸在質(zhì)量濃度為50 mg/L下就能達(dá)到良好的殺菌效果,幾乎對(duì)所有鮮切果蔬表面的腐敗菌和致病菌有明顯抑制效果,但因其穿透力不強(qiáng),低濃度下雖對(duì)懸浮的微生物效果明顯,而對(duì)緊緊吸附在鮮切產(chǎn)品表面的微生物作用不明顯[8]。過(guò)氧乙酸反應(yīng)的副產(chǎn)物是水和氧氣,對(duì)人體和環(huán)境無(wú)毒無(wú)害,因此被認(rèn)為是一種綠色環(huán)保的殺菌劑,FDA已將其定為非沖洗食品接觸表面消毒殺菌劑。過(guò)氧乙酸作為氯系殺菌劑的替代品,在鮮切果蔬加工中得到廣泛研究與應(yīng)用[7]。

與含氯制劑相比,二氧化氯不會(huì)與有機(jī)物反應(yīng)生成致癌、致突變、致畸的物質(zhì),是目前國(guó)際上公認(rèn)的最新一代高效、廣譜、安全的殺菌保鮮劑[6]。它能迅速氧化病毒蛋白質(zhì)衣殼中的酪氨酸,抑制病毒的特異性吸附,阻止其對(duì)宿主細(xì)胞的侵染,還能與細(xì)菌及其他微生物蛋白質(zhì)中的部分氨基酸發(fā)生氧化還原反應(yīng),分解破壞氨基酸,抑制微生物蛋白質(zhì)合成,從而導(dǎo)致微生物死亡。許多歐美國(guó)家有關(guān)組織已批準(zhǔn)和推薦二氧化氯用于食品的消毒、防腐、保鮮等,世界衛(wèi)生組織(WHO)已將二氧化氯列為Al級(jí)安全高效消毒劑,我國(guó)衛(wèi)計(jì)委也已批準(zhǔn)二氧化氯為消毒劑和新型食品添加劑[10]。

上述3種減菌劑在鮮切芫荽中的減菌效果還缺乏研究,因此作者采用次氯酸鈉、二氧化氯和過(guò)氧乙酸處理鮮切芫荽,確定適合于鮮切芫荽的最佳減菌劑,通過(guò)16SrDNA全基因組測(cè)序技術(shù)鑒定鮮切芫荽表面細(xì)菌種類(lèi),分析主要致病與致腐細(xì)菌,以期更有效地提高鮮切芫荽產(chǎn)品的安全性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

芫荽：市售。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 次氯酸鈉、二氧化氯、過(guò)氧乙酸、氯化鈉、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、瓊脂、乳糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、月桂酸硫酸鈉、煌綠乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、牛肉膏、蛋白胨、結(jié)晶紫、草酸銨、碘片、碘化鉀、番紅、松柏油、SK1201-UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒等。

1.2.2 主要儀器 DJ300精密電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；YXQ-SG41-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；GRP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；XW-80A微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司產(chǎn)品；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；SPX-320型智能生化培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠產(chǎn)品；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀：加拿大BBI公司產(chǎn)品；3730測(cè)序分析儀：美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；H6-1微型電泳槽：上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)：Gene Genius公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品及減菌劑的準(zhǔn)備 挑選無(wú)黃葉、無(wú)機(jī)械傷、無(wú)病蟲(chóng)害、新鮮度基本一致的本地鮮切芫荽,去根,清水洗至可直接食用,晾干至無(wú)水漬,待用。

次氯酸鈉(5.2 mg/L)配制成質(zhì)量濃度為0、50、100、150、200、250 mg/L的溶液,測(cè)定pH分別為6.32、10.33、11.37、11.70、11.90、12.07。

二氧化氯(8 mg/L)配制成質(zhì)量濃度為0、20、40、60、80、100 mg/L的溶液,測(cè)定pH分別為5.90、3.16、2.87、2.73、2.56、2.41。

過(guò)氧乙酸(15.7 mg/L),由A液(冰醋酸和硫酸)和B液(過(guò)氧化氫)以體積比10∶8制得1000 mg/L溶液,反應(yīng)24h后稀釋成0、50、100、150、200、250 mg/L,測(cè)定pH分別為6.93、4.79、4.03、3.78、3.60、3.52。

1.3.2 3種減菌劑處理 比較3種減菌劑減菌效果,選擇效果最佳的減菌劑,以?xún)?yōu)化減菌劑處理參數(shù)。3種減菌劑處理?xiàng)l件見(jiàn)表1。所有處理在室溫下進(jìn)行,每個(gè)處理重復(fù)3次。

表1 3種減菌劑處理鮮切芫荽的試驗(yàn)表Table 1 Table of the tests of three different sterilization methods for fresh-cut coriander

1.3.3 二氧化氯正交處理 按照L9(34)正交表,對(duì)處理濃度(20、40、60 mg/L)、處理時(shí)間(2、5、10 min)、水菜體積質(zhì)量比(4 mL∶1 g、8 mL∶1 g、12 mL∶1 g)三因素進(jìn)行正交試驗(yàn),對(duì)照組為清水洗前及清水洗后待用的樣品。正交試驗(yàn)表見(jiàn)表2。

表2 二氧化氯處理芫荽的正交試驗(yàn)表Table 2 Orthogonal table of the tests of treating coriander with chlorine dioxide

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 菌落總數(shù) 參照GB/T 4789.2—2016。

1.4.2 大腸菌群 參照GB/T 4789.3—2016。

1.5 細(xì)菌的分離純化與保藏

無(wú)菌環(huán)境下,稱(chēng)取25 g鮮切芫荽置盛有225 mL無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中,置于搖床80 r/min,搖動(dòng)20 min,立即將樣品液稀釋至1×10-3、1×10-4、1×10-5三個(gè)梯度,吸取1 mL樣品勻液于無(wú)菌平皿內(nèi),每個(gè)稀釋度做2個(gè)重復(fù)。同時(shí),分別吸取1 mL無(wú)菌生理鹽水加入2個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。及時(shí)將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基傾注平皿,并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。于(36±1)℃倒置恒溫培養(yǎng)(48±2)h。試驗(yàn)重復(fù)3次。觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況及菌落的顏色和特征,并選取優(yōu)勢(shì)菌挑取單菌落,采用平板劃線法于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基劃線純化。于(36±1)℃倒置恒溫培養(yǎng)(48±2)h。連續(xù)純化5代。

挑取純化第5代的單菌落接種于牛肉膏蛋白胨斜面,于(36±1)℃倒置恒溫培養(yǎng)(24±2)h。置于4℃冰箱中保藏。

1.6 細(xì)菌形態(tài)觀察

1.6.1 菌落形態(tài)觀察 觀察純化第5代平皿內(nèi)菌落大小、菌落形態(tài)、菌落顏色、菌落表面特征(光滑與否、干燥與否、是否凸起、是否透明、是否存在同心環(huán)等)、邊緣規(guī)則與否。

1.6.2 革蘭氏染色 參照GB/T 4789.28—2013。

1.7 16Sr DNA序列的分析及其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立

1.7.1 DNA提取 參照上海生工SK1201-UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.7.2 PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA序列

1)引物序列 正向引物27 F：5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′；反向引物1492R(1510)：5′-GG TTACCTTGTTACGACTT-3′。

2)PCR反應(yīng)體系建立(50μL) 模板DNA 10 pmol,上游引物1μL,下游引物1μL,dNTP Mix 1μL,10×Taq reaction Buffer 5μL,高保真聚合酶(5 U/μL)0.25μL,無(wú)菌超純水補(bǔ)足至50μL。

3)PCR程序設(shè)定 98℃預(yù)變性5 min；95℃變性35 s,55℃退火35 s,72℃延伸90 s,35個(gè)循環(huán)；延伸8 min。

1.8 種屬鑒定

將PCR產(chǎn)物送到測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序完成的16S rDNA序列在GenBank(NCBI)中進(jìn)行BLAST檢索,尋找相似序列并下載,用MEGA軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)確定細(xì)菌種屬。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)取3次重復(fù)平均值,采用Excel、SPSS 18.0、正交設(shè)計(jì)助手等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種減菌劑單因素處理對(duì)芫荽減菌效果的影響

2.1.1 次氯酸鈉單因素處理對(duì)芫荽減菌效果的影響 圖1—圖3分別為次氯酸鈉不同質(zhì)量濃度(水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g、10 min)、不同處理時(shí)間(質(zhì)量濃度150 mg/L、水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g)和不同水菜體積質(zhì)量比(質(zhì)量濃度150 mg/L、10 min)對(duì)芫荽表面菌落總數(shù)減菌的效果。清水洗后的芫荽表面菌落總數(shù)都顯著低于清水洗前(P﹤0.05),與對(duì)照(清水洗后)相比,0 mg/L處理出現(xiàn)的略微上升與清洗及空氣接觸時(shí)間增加有關(guān),其余處理菌落總數(shù)均顯著降低(P﹤0.05)。圖1表明隨處理濃度升高,菌落總數(shù)呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)。其中150 mg/L處理組菌落總數(shù)最低,200 mg/L的處理引起芫荽組織損傷,增加微生物污染,250 mg/L處理可再次降低微生物數(shù)量,但濃度偏高已引起組織損傷且易發(fā)生氯殘留,故宜選用150 mg/L處理濃度。圖2和3表明隨處理時(shí)間延長(zhǎng)和用水量增加,菌落總數(shù)呈先下降后上升的趨勢(shì),其中10 min處理時(shí)間與8 mL∶1 g水菜體積質(zhì)量比減菌效果最優(yōu),15 min處理時(shí)間偏長(zhǎng),引起芫荽組織損傷,增加微生物污染。

圖1 次氯酸鈉不同質(zhì)量濃度(10 min、8 mL∶1 g)對(duì)芫荽菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effects of different concentrations on aerobic plate count in coriander treated with sodium hypochlorite(10 min,8 mL∶1 g)

圖2 次氯酸鈉不同處理時(shí)間(150 mg/L、8 mL∶1 g)對(duì)芫荽菌落總數(shù)的影響Fig.2 Effects of different processing time on aerobic plate count in coriander treated with sodium hypochlorite(150 mg/L,8 mL∶1 g)

圖3 次氯酸鈉處理時(shí)不同水菜體積質(zhì)量比(150 mg/L、10 min)對(duì)芫荽菌落總數(shù)的影響Fig.3 Effects of different ratio of solution to vegetable on aerobic plate count in coriander treated with sodium hypochlorite(150 mg/L,10 min)

表3—表5分別為次氯酸鈉不同質(zhì)量濃度(水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g、10 min)、不同處理時(shí)間(質(zhì)量濃度150 mg/L、水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g)和不同水菜體積質(zhì)量比(質(zhì)量濃度150 mg/L、10 min)對(duì)芫荽表面大腸菌群減菌的效果。芫荽經(jīng)清水洗后大腸菌群數(shù)普遍降低1～2個(gè)數(shù)量級(jí),與對(duì)照(清水洗后)相比,各處理組大腸菌群普遍下降約1個(gè)數(shù)量級(jí),最大減菌組分別為150 mg/L、250 mg/L(表3),2 min(表4)和4 mL∶1 g、8 mL∶1 g(表5),與同批次其余處理組相比,減菌量相差不大,說(shuō)明次氯酸鈉可一定程度上降低大腸菌群數(shù),但效果并不明顯。

表3 次氯酸鈉不同質(zhì)量濃度(10 min、8 mL∶1 g)對(duì)芫荽大腸菌群的影響Table 3 Effects of different concentrations on enumeration of coliform in coriander treated with sodium hypochlorite(10 min,8 mL∶1 g)

表4 次氯酸鈉不同處理時(shí)間(150 mg/L、8 mL∶1 g)對(duì)芫荽大腸菌群的影響Table4 Effectsof different processing time on enumeration of coliform in coriander treated with sodium hypochlorite(150 mg/L,8 mL∶1 g)

表5 次氯酸鈉處理時(shí)不同水菜體積質(zhì)量比(150 mg/L、10 min)對(duì)芫荽大腸菌群的影響Table 5 Effects of different ratio of solution to vegetable on enumeration of coliform in coriander treated with sodium hypochlorite(150 mg/L,10 min)

2.1.2 二氧化氯單因素處理對(duì)芫荽減菌效果的影響 圖4—圖6分別為二氧化氯不同質(zhì)量濃度(水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g、10 min)、不同處理時(shí)間(質(zhì)量濃度60 mg/L、水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g)和不同水菜體積質(zhì)量比(質(zhì)量濃度60 mg/L、10 min)對(duì)芫荽表面菌落總數(shù)減菌的效果。清水洗后的芫荽表面菌落總數(shù)都顯著低于清水洗前(P﹤0.05),與對(duì)照(清水洗后)相比,菌落總數(shù)除0 mg/L處理與對(duì)照相當(dāng),其余處理均顯著降低(P﹤0.05)。圖4表明隨處理濃度升高,菌落總數(shù)呈先下降后上升的趨勢(shì),80 mg/L處理為最大減菌組,100 mg/L處理引起芫荽組織損傷,增加微生物污染,考慮質(zhì)量濃度超過(guò)80 mg/L處理會(huì)使部分芫荽葉片出現(xiàn)變黃現(xiàn)象,60 mg/L處理也可控制菌落總數(shù)在低水平,故實(shí)際應(yīng)用更適宜選擇質(zhì)量濃度60 mg/L。圖5-6表明隨處理時(shí)間延長(zhǎng)和用水量增加,菌落總數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì),考慮二氧化氯處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起芫荽葉片變黃及組織損傷,增加微生物污染風(fēng)險(xiǎn),故10 min處理時(shí)間適宜,水菜體積質(zhì)量比12 mL∶1 g減菌效果優(yōu)于其余2組。

圖4 二氧化氯不同質(zhì)量濃度(10 min、8 mL∶1 g)對(duì)芫荽菌落總數(shù)的影響Fig.4 Effects of different concentrations on aerobic plate count in coriander treated with chlorine dioxide(10 min,8 mL∶1 g)

圖5 二氧化氯不同處理時(shí)間(60 mg/L、8 mL∶1 g)對(duì)芫荽菌落總數(shù)的影響Fig.5 Effects of different processing time on aerobic plate count in coriander treated with chlorine dioxide(60 mg/L,8 mL∶1 g)

圖6 二氧化氯處理時(shí)不同水菜體積質(zhì)量比(60 mg/L、10 min)對(duì)芫荽菌落總數(shù)的影響Fig.6 Effects of different ratio of solution to vegetable on aerobic plate count in coriander treated with chlorine dioxide(60 mg/L,10 min)

表6—表8分別為二氧化氯不同質(zhì)量濃度(水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g、10 min)、不同處理時(shí)間(質(zhì)量濃度60 mg/L、水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g)和不同水菜體積質(zhì)量比(質(zhì)量濃度60 mg/L、10 min)對(duì)芫荽表面大腸菌群減菌的效果。芫荽經(jīng)清水洗后大腸菌群數(shù)普遍降低1～2個(gè)數(shù)量級(jí),與對(duì)照(清水洗后)相比,不同質(zhì)量濃度(表6)、不同水菜體積質(zhì)量比(表8)2個(gè)處理組均將大腸菌群數(shù)控制在最低水平,不同處理時(shí)間(表7)處理組由于原始大腸菌群數(shù)偏高而未能控制在最低水平,但仍可保持在較低水平。綜上所述,二氧化氯可有效控制芫荽表面大腸菌群數(shù)在可接受的低水平。

表6 二氧化氯不同質(zhì)量濃度(10 min、8 mL∶1 g)對(duì)芫荽大腸菌群的影響Table 6 Effects of different concentrationson enumeration of coliform in coriander treated with chlorine dioxide(10 min,8 mL∶1 g)

表7 二氧化氯不同處理時(shí)間(60 mg/L、8 mL∶1 g)對(duì)芫荽大腸菌群的影響Table 7 Effects of different processing time on enumeration of coliform in coriander treated with chlorine dioxide(60 mg/L,8 mL∶1 g)

表8 二氧化氯處理時(shí)不同水菜體積質(zhì)量比(60 mg/L、10 min)對(duì)芫荽大腸菌群的影響Table 8 Effects of different ratio of solution to vegetable on enumeration in coliform of coriander treated with chlorine dioxide(60 mg/L,10 min)

2.1.3 過(guò)氧乙酸單因素處理對(duì)芫荽減菌效果的影響 圖7—圖9分別為過(guò)氧乙酸不同質(zhì)量濃度(水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g、10 min)、不同處理時(shí)間(質(zhì)量濃度150 mg/L、水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g)和不同水菜體積質(zhì)量比(質(zhì)量濃度150 mg/L、2 min)對(duì)芫荽表面菌落總數(shù)減菌的效果。清水洗后的芫荽表面菌落總數(shù)都顯著低于清水洗前(P﹤0.05)。圖7表明隨處理濃度升高,菌落總數(shù)呈先上升后下降再上升的趨勢(shì),150 mg/L處理組為最大減菌組。與對(duì)照(清水洗后)相比,0、50 mg/L和100 mg/L處理組菌落總數(shù)高于對(duì)照組,表明低濃度過(guò)氧乙酸對(duì)芫荽表面減菌無(wú)效,反而因操作步驟增加引起微生物污染；高濃度過(guò)氧乙酸引起的芫荽組織損傷使其自身抵抗力下降,為微生物生長(zhǎng)提供有利條件,使?jié)舛雀哂?50 mg/L后減菌效果反而下降。圖8表明隨處理時(shí)間延長(zhǎng),菌落總數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì),2 min處理組為最大減菌組,可見(jiàn)過(guò)氧乙酸的作用速度快。圖9表明隨用水量增加,菌落總數(shù)呈上升趨勢(shì),水菜體積質(zhì)量比4 mL∶1 g減菌效果最優(yōu)。

圖7 過(guò)氧乙酸不同質(zhì)量濃度(10 min、8 mL∶1 g)對(duì)芫荽菌落總數(shù)的影響Fig.7 Effects of different concentrations on aerobic plate count in coriander treated with peracetic acid(10 min,8 mL∶1 g)

圖8 過(guò)氧乙酸不同處理時(shí)間(150 mg/L、8 mL∶1 g)對(duì)芫荽菌落總數(shù)的影響Fig.8 Effects of different processing time on aerobic plate count in coriander treated with peracetic acid(150 mg/L,8 mL∶1 g)

表9—表11分別為過(guò)氧乙酸不同質(zhì)量濃度(水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g、10 min)、不同處理時(shí)間(質(zhì)量濃度150 mg/L、水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g)和不同水菜體積質(zhì)量比(質(zhì)量濃度150 mg/L、2 min)對(duì)芫荽表面大腸菌群減菌的效果。芫荽經(jīng)清水洗后大腸菌群數(shù)普遍降低1～2個(gè)數(shù)量級(jí),與對(duì)照(清水洗后)相比,除250 mg/L(表9)處理組將大腸菌群數(shù)控制在最低水平,3個(gè)批次的其余處理對(duì)大腸菌群的減菌效果均較差。過(guò)氧乙酸濃度越高對(duì)大腸菌群的減菌效果越好。與菌落總數(shù)指標(biāo)相似,2 min(表10)和4 mL∶1 g(表11)處理組分別為批次內(nèi)最大減菌組,可見(jiàn)過(guò)氧乙酸的處理速度越快、用水量越少,減菌效果越好。

圖9 過(guò)氧乙酸處理時(shí)不同水菜體積質(zhì)量比(150 mg/L、2 min)對(duì)芫荽菌落總數(shù)的影響Fig.9 Effects of different ratio of solution to vegetable on aerobic plate count in coriander treated with peracetic acid(150 mg/L,2 min)

表9 過(guò)氧乙酸不同質(zhì)量濃度(10 min、8 mL∶1 g)對(duì)芫荽大腸菌群的影響Table 9 Effects of different concentrations on enumeration of coliform in coriander treated with peracetic acid(10 min,8 mL∶1 g)

2.1.4 3種減菌劑處理對(duì)芫荽減菌效果的比較 3種減菌劑處理都能有效減少芫荽表面的菌落總數(shù),但作用效果存在差異。次氯酸鈉、二氧化氯、過(guò)氧乙酸處理的最大減菌組分別為150 mg/L、8 mL∶1 g處理10 min(水菜體積質(zhì)量比),80 mg/L、8 mL∶1 g處理10 min(處理質(zhì)量濃度),150 mg/L、8 mL∶1 g處理10 min(處理質(zhì)量濃度)；最大減菌數(shù)量分別為2.29 lg(CFU/g)、2.79 lg(CFU/g)、0.99 lg(CFU/g)。二氧化氯減菌效果最強(qiáng),次氯酸鈉次之,過(guò)氧乙酸最弱且減菌效果差。3種減菌劑處理對(duì)芫荽大腸菌群的控制效果與菌落總數(shù)相似,減菌效果從強(qiáng)至弱依次為：二氧化氯、次氯酸鈉、過(guò)氧乙酸。

實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)綜合考慮減菌效果、減菌劑成本、生產(chǎn)效率、用水情況、安全性等選擇最適宜生產(chǎn)的減菌劑種類(lèi)。本試驗(yàn)以最優(yōu)減菌效果為標(biāo)準(zhǔn),選擇二氧化氯作為減菌劑進(jìn)行正交試驗(yàn)以篩選其處理質(zhì)量濃度、處理時(shí)間和水菜體積質(zhì)量比的最優(yōu)配方,進(jìn)而使用二氧化氯最優(yōu)配方處理芫荽后,進(jìn)行不同貯藏溫度對(duì)芫荽貯藏期間微生物的影響試驗(yàn)。

2.2 二氧化氯正交處理對(duì)芫荽減菌效果的優(yōu)化

本試驗(yàn)采用三因素三水平的正交試驗(yàn),以芫荽表面菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)作為評(píng)價(jià)減菌效果優(yōu)劣的指標(biāo),以此得出最優(yōu)的減菌劑使用方法。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表12。

由直觀分析的結(jié)果可知,三個(gè)因素對(duì)芫荽表面菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)的影響順序?yàn)樘幚碣|(zhì)量濃度>處理時(shí)間>水菜體積質(zhì)量比。菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)越小,說(shuō)明減菌效果越好。從表12可知,隨二氧化氯質(zhì)量濃度的增大,芫荽表面菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)都逐漸減少,隨處理時(shí)間的延長(zhǎng),菌落總數(shù)先上升后下降,大腸菌群數(shù)逐漸下降。當(dāng)二氧化氯質(zhì)量濃度為60 mg/L,處理時(shí)間為10 min時(shí),菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)都出現(xiàn)最低值。二氧化氯質(zhì)量濃度越高,溶液內(nèi)起減菌作用的有效氯濃度越高,較大程度地減少了芫荽表面的菌落總數(shù)和大腸菌群；而處理的時(shí)間越長(zhǎng),芫荽與減菌劑的接觸越充分,殺菌效果越好。水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g處理的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)都達(dá)到最低值,其原因在于：處理相同質(zhì)量的芫荽,水菜體積質(zhì)量比4 mL∶1 g用水量少導(dǎo)致芫荽不能與減菌劑充分接觸,水菜體積質(zhì)量比12 mL∶1 g用水量多增加了二氧化氯溶液內(nèi)原始的微生物數(shù),一定程度上削弱了減菌劑的減菌效果。

綜上所述,從正交試驗(yàn)表可知,處理組第9組,即組合A3B3C2為最優(yōu)組合。結(jié)合芫荽表面的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)考慮,確定二氧化氯的最佳減菌參數(shù)是：質(zhì)量濃度60 mg/L、處理時(shí)間10 min、水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g。

表10 過(guò)氧乙酸不同處理時(shí)間(150 mg/L、8 mL∶1 g)對(duì)芫荽大腸菌群的影響Table 10 Effects of different processing time on enumeration of coliform in coriander treated with peracetic acid(150 mg/L,8 mL∶1 g)

表11 過(guò)氧乙酸處理時(shí)不同水菜體積質(zhì)量比(150 mg/L、2 min)對(duì)芫荽大腸菌群的影響Table 11 Effects of different ratio of solution to vegetable on enumeration of coliform in coriander treated with peracetic acid(150 mg/L,2 min)

2.3 細(xì)菌形態(tài)觀察結(jié)果

從鮮切芫荽中分離出7種不同的菌株,分別編號(hào)為1、2、3、C11、Y4、C1、12。分離獲得的7種菌株的菌體形態(tài)描述、菌落形態(tài)見(jiàn)表13和圖10。根據(jù)分離獲得的7種菌株的菌體形態(tài)描述表及菌落形態(tài)圖可知：菌株全部為革蘭氏陰性菌,主要為白色或者黃色,均呈圓形。7株菌表面特征明顯,除Y4菌株外,其余菌落中心不透光,且表面光滑濕潤(rùn)。通過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn),Y4菌株菌體特征為球狀,其他菌株菌體呈桿狀或短桿狀。

2.4 細(xì)菌16Sr DNA序列的分析與鑒定結(jié)果

通過(guò)擴(kuò)增獲得不同菌株的16SrDNA片段,經(jīng)序列比對(duì),由MEGA軟件構(gòu)建的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及序列距離見(jiàn)圖11—圖17,從而確定細(xì)菌種屬。從鮮切芫荽中分離純化得到的7株細(xì)菌,可分類(lèi)為致腐菌、致病菌與普通菌。從圖11—圖17依次鑒定為歐文氏菌屬、假單胞菌屬、氣單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、拉恩氏菌屬、根瘤菌屬和腸桿菌屬。

表13 分離獲得7株菌的菌落形態(tài)與菌體形態(tài)描述Table 13 Description of 7 isolated strains'colonial morphology and cell morphology

圖10 分離獲得的7株菌的菌落形態(tài)Fig.10 Colonial morphology of 7 isolated strains

圖11 基于菌株C11 16Sr DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.11 Phylogenetic tree based on 16Sr DNA sequences of C11

圖12 基于菌株Y4 16Sr DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.12 Phylogenetic tree based on 16Sr DNA sequences of Y4

圖13 基于菌株C1 16Sr DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.13 Phylogenetic tree based on 16Sr DNA sequences of C1

圖14 基于菌株12 16Sr DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.14 Phylogenetic tree based on 16Sr DNA sequences of 12

圖15基于菌株Y4 16Sr DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.15 Phylogenetic tree based on 16Sr DNA sequences of Y4

圖16 基于菌株C1 16Sr DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.16 Phylogenetic tree based on 16Sr DNA sequences of C1

2.5 二氧化氯處理對(duì)鮮切芫荽中菌屬種類(lèi)的影響

根據(jù)上述比較3種減菌劑對(duì)鮮切芫荽減菌效果的試驗(yàn)得知,二氧化氯在質(zhì)量濃度60 mg/L、處理時(shí)間10 min、水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g的條件下,減菌效果最好,因此采用二氧化氯來(lái)研究對(duì)鮮切芫荽中菌屬種類(lèi)的影響。不同處理方法下鮮切芫荽表面菌屬的種類(lèi)見(jiàn)表14。實(shí)驗(yàn)表明,二氧化氯處理可減少根瘤菌屬、不動(dòng)桿菌屬和氣單胞菌屬。

圖17 基于菌株12的16Sr DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.17 Phylogenetic tree based on 16Sr DNA sequences of 12

表14 不同處理方法下鮮切芫荽表面菌的種類(lèi)Table 14 Bacteria species of fresh-cut coriander treated by chlorine dioxide

3 討 論

新鮮芫荽經(jīng)自來(lái)水沖洗后的菌落總數(shù)均明顯低于清水洗前的芫荽,水洗操作的減菌范圍在(1.30～2.07)lg(CFU/g)。單因素試驗(yàn)中,所有處理均顯著降低了芫荽表面的微生物數(shù)量(P﹤0.05)。隨處理質(zhì)量濃度的增加,3種殺菌劑的殺菌效果呈不同趨勢(shì)：次氯酸鈉呈先下降后上升再下降,二氧化氯呈先下降再上升,過(guò)氧乙酸呈先上升后下降再上升。3種趨勢(shì)中都存在一段隨處理質(zhì)量濃度增加,菌落總數(shù)先下降再上升的變化,表明各種殺菌劑都有最適殺菌濃度,而并非濃度越高殺菌效果越好,這與王玉麗等[11]、張丙云等[12]的研究結(jié)果相似：濃度過(guò)高會(huì)破壞芫荽的組織結(jié)構(gòu),降低芫荽自身的抵抗能力,并為微生物生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。過(guò)氧乙酸的殺菌速度較次氯酸鈉和二氧化氯更快。3種殺菌劑對(duì)大腸菌群的控制效果與對(duì)菌落總數(shù)的控制效果相似。次氯酸鈉、二氧化氯、過(guò)氧乙酸3種殺菌劑的減菌范圍分別為(1.43～2.29)lg(CFU/g)、(2.08～2.79)lg(CFU/g)、(0.64～0.99)lg(CFU/g),最大減菌率分別為55.08%、82.69%、31.88%,殺菌效果由強(qiáng)至弱依次為：二氧化氯、次氯酸鈉、過(guò)氧乙酸。二氧化氯減菌最徹底,對(duì)大腸菌群的殺菌效果明顯；次氯酸鈉也可顯著降低菌落總數(shù),但效果次于二氧化氯,對(duì)大腸菌群的抑制效果不明顯；過(guò)氧乙酸的特點(diǎn)是作用速度快,用水量少,但殺菌效果較差,低濃度的過(guò)氧乙酸對(duì)菌落總數(shù)和大腸菌群均無(wú)作用效果。本試驗(yàn)結(jié)論與其他關(guān)于鮮切蔬菜減菌的報(bào)道相符合[4,13],譚玉霞[14]用75 mg/L的次氯酸鈉處理菠菜10min和15min后,菌落總數(shù)分別降低1.4lg(CFU/g)和1.8 lg(CFU/g)；梁冬妮[15]用0.2 g/L的次氯酸鈉處理大白菜3 min后,降低菌落總數(shù)0.6 lg(CFU/g)；Allende等[16]用200 mg/L次氯酸鈉溶液對(duì)芫荽葉消毒1 min可使菌落總數(shù)下降(1～1.3)lg(CFU/g)；徐斐燕[10]分別用50、75 mg/L和100 mg/L的二氧化氯處理西蘭花15 min,使菌落總數(shù)分別降低2.00 lg(CFU/g)、2.52 lg(CFU/g)和2.97 lg(CFU/g)；Silveira等[17]用質(zhì)量濃度68 mg/L的過(guò)氧乙酸溶液處理鮮切甜瓜,能有效降低菌落總數(shù)2 lg(CFU/g)；王少丹[8]用200 mg/L的次氯酸鈉、10 mg/L的二氧化氯和80 mg/L的過(guò)氧乙酸處理青椒,菌落總數(shù)分別降低2.4 lg(CFU/g)、2.6 lg(CFU/g)和2.7 lg(CFU/g)。

二氧化氯正交試驗(yàn)中,最大減菌組為質(zhì)量濃度60 mg/L、水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g處理10 min,減菌量為2.10 lg(CFU/g),減菌程度優(yōu)于單因素實(shí)驗(yàn)中相同操作條件的處理組。二氧化氯對(duì)芫荽的殺菌效果與許多報(bào)道相似,Chen等[18]用100 mg/L二氧化氯水溶液處理鮮切萵苣6天后,好氧菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌這3個(gè)指標(biāo)分別降低了3.60 lg(CFU/g)、1.20 lg(CFU/g)和1.40 lg(CFU/g)。

代小梅[4]研究不同質(zhì)量濃度與處理時(shí)間的次氯酸鈉、二氧化氯和過(guò)氧乙酸對(duì)香蔥菌落總數(shù)的減菌效果。結(jié)果表明,次氯酸鈉對(duì)香蔥減菌能力最弱,所有處理質(zhì)量濃度下菌落總數(shù)的減少均﹤1.00 lg(CFU/g)；過(guò)氧乙酸和二氧化氯對(duì)香蔥減菌能力相當(dāng),分別達(dá)(1.68～2.22)lg(CFU/g)和(0.99～2.85)lg(CFU/g)。與本試驗(yàn)對(duì)芫荽減菌效果相比,次氯酸鈉對(duì)芫荽和香蔥減菌效果差異較大,可能由于兩種蔬菜微生物組成不同,使得次氯酸鈉對(duì)芫荽的減菌效果好而對(duì)香蔥的減菌效果差；過(guò)氧乙酸對(duì)香蔥減菌范圍較寬,表明過(guò)氧乙酸的減菌能力不穩(wěn)定,對(duì)香蔥的減菌效果好于芫荽是因?yàn)橄闶[外部光滑,不像芫荽具有繁茂的葉片,使微生物更易溶于溶液中,而過(guò)氧乙酸具有對(duì)懸浮的微生物效果明顯,而對(duì)緊緊吸附在表面的微生物作用不明顯[7]的特點(diǎn)；二氧化氯對(duì)芫荽與香蔥減菌能力相當(dāng)且效果顯著,更說(shuō)明二氧化氯是高效廣譜的殺菌劑。

芫荽多以生食為主,為保障其安全性,微生物的控制尤為重要。本試驗(yàn)從鮮切芫荽中分離純化得到的7株細(xì)菌可分類(lèi)為致腐菌、致病菌與普通菌。歐文氏菌屬和假單胞菌屬是蔬菜中常見(jiàn)致腐菌,是新鮮葉菜類(lèi)的主要微生物組成成分[19],在芫荽中分離得到不足為奇。這兩類(lèi)屬內(nèi)的菌種可引起芫荽葉片出現(xiàn)斑點(diǎn)、腐爛并產(chǎn)生不良?xì)馕?導(dǎo)致貨架期縮短,商品價(jià)值降低。由于歐文氏菌屬和假單胞菌屬可在低溫環(huán)境下生長(zhǎng),又增加了鮮切芫荽在低溫貯藏期細(xì)菌控制的難度。氣單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬是致病菌,可引起人類(lèi)腹瀉等多種疾病,若帶有氣單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬的鮮切芫荽產(chǎn)品未經(jīng)高溫加熱而被人體食用,將產(chǎn)生嚴(yán)重后果。拉恩氏菌屬、根瘤菌屬、腸桿菌屬未見(jiàn)致病報(bào)道,可將其歸類(lèi)為普通菌。其中腸桿菌屬?gòu)V泛存在于人和動(dòng)物的腸道以及土壤、乳品和污水中,一般不致病或?yàn)闂l件致病菌,但是在機(jī)體免疫功能低下時(shí),容易發(fā)生感染。因此,在嚴(yán)格控制致腐菌與致病菌的同時(shí),應(yīng)加強(qiáng)控制其他一般性菌屬的數(shù)量,進(jìn)而降低菌落總數(shù),延長(zhǎng)鮮切芫荽的貨架期并增強(qiáng)食品的安全性。

4 結(jié) 語(yǔ)

室溫條件下,次氯酸鈉、二氧化氯、過(guò)氧乙酸對(duì)芫荽均有顯著(P﹤0.05)的減菌效果,對(duì)大腸菌群也有一定作用。次氯酸鈉對(duì)芫荽的最適減菌條件為質(zhì)量濃度150 mg/L、處理時(shí)間10 min、水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g,菌落總數(shù)降低(1.43～2.29)lg(CFU/g),大腸菌群降低約1個(gè)數(shù)量級(jí)；二氧化氯對(duì)芫荽的最適減菌條件為質(zhì)量濃度60 mg/L、處理時(shí)間10 min、水菜體積質(zhì)量比12 mL∶1 g,菌落總數(shù)降低(2.08～2.79)lg(CFU/g),大腸菌群降低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)；過(guò)氧乙酸對(duì)芫荽的最適減菌條件為質(zhì)量濃度150 mg/L、處理時(shí)間2 min、水菜體積質(zhì)量比4 mL∶1 g,菌落總數(shù)降低(0.64～0.99)lg(CFU/g),大腸菌群降低小于1個(gè)數(shù)量級(jí)。綜合比較3種減菌劑的減菌效果,二氧化氯殺菌效果最好且安全無(wú)毒,過(guò)氧乙酸對(duì)芫荽減菌效果最弱。

作者從鮮切芫荽中分離純化得到的7株細(xì)菌分別為歐文氏菌屬、假單胞菌屬、氣單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、拉恩氏菌屬、根瘤菌屬和腸桿菌屬。二氧化氯處理可以減少根瘤菌屬、不動(dòng)桿菌屬和氣單胞菌屬。

綜上所述,適合芫荽鮮切加工的減菌方法是二氧化氯質(zhì)量濃度60 mg/L、水菜體積質(zhì)量比8 mL∶1 g處理10 min。