楊 蕾，丁學(xué)峰，蔡燕飛，陳 蘊(yùn)，龔笑海，段作營(yíng)，李華鐘，金 堅(jiān)*

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 無(wú)錫214122)

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞作為生物技術(shù)藥物生產(chǎn)細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)地位已經(jīng)明確,且構(gòu)建適于穩(wěn)定生產(chǎn)治療性生物制品的CHO工程細(xì)胞系一直是研究工作的熱點(diǎn)[1-2]。經(jīng)典的CHO工程細(xì)胞系構(gòu)建均是采用目的基因隨機(jī)整合,多輪單克隆篩選,挑選相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白細(xì)胞株的方法[3-4]。帶來(lái)的麻煩是構(gòu)建工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力,更重要的是無(wú)法知曉高、低表達(dá)目的蛋白的原因。隨著主細(xì)胞庫(kù)到生產(chǎn)細(xì)胞庫(kù)的放大和生產(chǎn)過(guò)程傳代,目的蛋白的表達(dá)量極易變化,丟失了目的蛋白表達(dá)的非生產(chǎn)性細(xì)胞克隆持續(xù)增加,難以達(dá)到生產(chǎn)和監(jiān)管的要求。構(gòu)建定點(diǎn)整合的穩(wěn)定表達(dá)外源基因的CHO工程細(xì)胞系是理論上解決這些問(wèn)題的有效方法。CHO細(xì)胞的一、二和三代基因測(cè)序結(jié)果均已相繼公布,相關(guān)品系的CHO細(xì)胞染色體變異很大。對(duì)已保有的各種生產(chǎn)治療性生物制品的高、低表達(dá)CHO細(xì)胞株,結(jié)合其整合位點(diǎn)和臨近區(qū)域的結(jié)構(gòu)分析,還未有成功地將CHO細(xì)胞的穩(wěn)定高表達(dá)整合位點(diǎn)用于建立生產(chǎn)型CHO工程細(xì)胞系的報(bào)道[5-7]。

作者前期以CHO-K1為出發(fā)細(xì)胞株,組合應(yīng)用慢病毒示蹤報(bào)告基因技術(shù)和染色體步移技術(shù),尋找到了可以持續(xù)表達(dá)綠色熒光標(biāo)簽的基因組內(nèi)位點(diǎn)。測(cè)序結(jié)果明確了該整合位點(diǎn)為NW_003614172.1第629890堿基處,位于鉀通道調(diào)節(jié)因子1(potassium channel modulatory factor 1,Kcmf1)基因內(nèi)部的一段非編碼區(qū)域。該基因編碼鋅指蛋白,參與鉀通道的調(diào)節(jié)[8-9]。以此為基礎(chǔ),構(gòu)建和單克隆化了以Kcmf1基因NW_003614172.1第629890堿基處定點(diǎn)整合ZsGreen1報(bào)告基因的CHO-K1細(xì)胞(2C3),對(duì)其作為工程細(xì)胞的穩(wěn)定性開(kāi)展了系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞亞株CHO-K1,購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；2C3細(xì)胞,為染色體NW_003614172.1內(nèi)第629890號(hào)堿基處整合了ZsGreen1基因的CHO-K1細(xì)胞株,由作者所在課題組構(gòu)建和保存[9]。

1.1.2 主要試劑 Ham's F-12K培養(yǎng)基、胎牛血清：美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；M2、M4無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蘇州康聚生物技術(shù)公司產(chǎn)品；PCR試劑：南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；TRIzol試劑：美侖生物公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Green Master Mix：Takara公司產(chǎn)品；DEPC水、基因組DNA小量抽提試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)中所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物列表Table 1 List of PCR primers

1.1.3 儀器與設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)箱SeriesⅡWater Jacket、NANODROP 2000：美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡、倒置式生物顯微鏡TE2000-S：日本NIKON公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀、流式分選儀BD FACSAriaIII：美國(guó)BD公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀infinite M200 PRO、凝膠成像系統(tǒng)Tanon-5200Multi：上海天能公司產(chǎn)品；核酸電泳儀Mini-Protean、PCR儀C1000和Q-PCR儀CFX96：美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) CHO-K1細(xì)胞和2C3細(xì)胞在完全培養(yǎng)基(Ham's F-12K+體積分?jǐn)?shù)10%FBS)內(nèi)連續(xù)貼壁傳代培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2。

先后采用了兩種方法對(duì)2C3細(xì)胞進(jìn)行懸浮馴化：第一種是使用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基M2+M4(體積比為1∶1)直接替換完全培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞,第二種是使用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基M2+M4(體積比為1∶1)逐步取代完全培養(yǎng)基,使培養(yǎng)基中血清的最終體積分?jǐn)?shù)也逐步遞減,梯度為10%、8%、6%、4%、2%、1%、0.5%、0%,每個(gè)梯度連續(xù)傳代培養(yǎng)2~3次,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)減為另一梯度。

細(xì)胞馴化成功后,在150 mL搖瓶中使用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基M2+M4(體積比為1∶1)懸浮傳代培養(yǎng),培養(yǎng)基為30 mL,恒溫?fù)u床上的培養(yǎng)條件為110 r/min、37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2。每天取樣計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞接種密度為1.0×106個(gè)/mL。

1.2.2 MTT法檢測(cè)2C3貼壁細(xì)胞的倍增時(shí)間 將T75培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)細(xì)胞用胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù),用新鮮的完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1×104個(gè)/mL,吹打混勻后按每孔2 500個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中,5個(gè)重復(fù)孔,共接種10塊相同的96孔板,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天,取出一塊96孔板,避光加入MTT,每孔10μL,4小時(shí)后加入MTT Buffer,每孔100μL,過(guò)夜反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測(cè)取560 nm波長(zhǎng)下的吸光值。之后9天內(nèi),在每天相同時(shí)間點(diǎn)取一塊板重復(fù)上述操作,依據(jù)測(cè)得的吸光值繪制出細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.3 倒置熒光顯微鏡觀(guān)察ZsGreen1蛋白表達(dá)情況 貼壁細(xì)胞每分裂倍增10次,細(xì)胞匯合度達(dá)50%~60%時(shí),倒置熒光顯微鏡觀(guān)察ZsGreen1蛋白表達(dá)情況,隨機(jī)選擇鏡下視野進(jìn)行明場(chǎng)和熒光場(chǎng)拍攝。每次拍攝條件一致,AECompensation為+0.0 EV,Exposure Time為1 s,Gain為4×,Contrast為L(zhǎng)inear,熒光場(chǎng)照片采用ImageJ軟件分析細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。

按血清終濃度遞減的方法懸浮馴化的細(xì)胞(2C3-M2M4+體積分?jǐn)?shù)0%FBS),每次降低血清含量時(shí)觀(guān)察ZsGreen1蛋白表達(dá)情況；直接使用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞(2C3-M2M4),待細(xì)胞轉(zhuǎn)至搖瓶培養(yǎng)時(shí)初次觀(guān)察。馴化成功后的懸浮2C3細(xì)胞,每分裂倍增10次進(jìn)行觀(guān)察,拍攝條件及分析方法與貼壁細(xì)胞相同。

1.2.4 流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度貼壁細(xì)胞每分裂倍增10次后取出部分細(xì)胞進(jìn)行凍存,儲(chǔ)存于液氮罐中。在細(xì)胞總倍增次數(shù)達(dá)到50次時(shí),同時(shí)復(fù)蘇之前凍存的所有不同代次的細(xì)胞,傳代培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,使用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度,檢測(cè)結(jié)果使用FlowJo 7.6.2軟件進(jìn)行分析。

懸浮細(xì)胞在馴化成功后每分裂倍增10次進(jìn)行流式分析,檢測(cè)時(shí)和貼壁細(xì)胞使用同一條件,數(shù)據(jù)分析方法相同。

1.2.5 流式細(xì)胞分選儀分選懸浮細(xì)胞池 分析懸浮馴化成功的2C3細(xì)胞池,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞池中的細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白的熒光強(qiáng)度有一定的差異。以未插入外源基因的CHO-K1細(xì)胞為陰性對(duì)照,收集10 000個(gè)細(xì)胞測(cè)定對(duì)照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度,確定103為陰、陽(yáng)性細(xì)胞分界線(xiàn)：?jiǎn)渭?xì)胞FITC-A熒光強(qiáng)度低于103時(shí)為陰性細(xì)胞,高于103時(shí)為陽(yáng)性細(xì)胞。流式細(xì)胞分選儀對(duì)2C3細(xì)胞池進(jìn)行分選,收集陰性細(xì)胞1.2×106個(gè),分成四組分別培養(yǎng)在M2M4、M2M4+10%FBS、Ham's F-12K、Ham's F-12K+10%FBS四種培養(yǎng)基中(M2∶M4體積比為1∶1)；收集熒光強(qiáng)度值最高的10%陽(yáng)性細(xì)胞3×105個(gè),使用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基擴(kuò)培。

1.2.6 2C3細(xì)胞中ZsGreen1基因的分析 使用基因組DNA小量抽提試劑盒,分別提取在無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基里擴(kuò)培后的陰性、陽(yáng)性細(xì)胞的基因組,使用表1中ZsGreen1-F.1和ZsGreen1-R.1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為：2×Phanta?Max Buffer 12.5μL,dNTPMix 0.5μL,ZsGreen1-F.1(10μmol/L)1μL,ZsGreen1-R.1(10μmol/L)1μL,Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL,DNA 100 ng,ddH2O補(bǔ)足25μL。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s,58℃退火15 s,72℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并測(cè)序。

1.2.7 2C3細(xì)胞中ZsGreen1基因轉(zhuǎn)錄水平分析分別提取在M2M4、M2M4+10%FBS、Ham′s F-12K、Ham′s F-12K+10%FBS四種不同培養(yǎng)基中擴(kuò)培的陰性細(xì)胞的RNA,將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系 為：5×PrimeScript RTMaster Mix(Perfect Real Time)4μL,Total RNA 1μg,RNase Free dH2O補(bǔ)足20μL。輕柔混勻后使用PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)條件為：37℃,15 min；85℃,5 s；降溫至4℃,于-20℃長(zhǎng)期保存。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行Q-PCR,反應(yīng)體系為：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10μL,ZsGreen1-F.2 (10μmol/L)1μL,ZsGreen1-R.2(10μmol/L)1μL,cDNA 10 ng,ddH2O補(bǔ)足20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s,60℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn)為65℃反應(yīng)5 s,95℃反應(yīng)60 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 2C3細(xì)胞倍增時(shí)間檢測(cè)結(jié)果

用MTT法檢測(cè)560 nm波長(zhǎng)下的吸光值,繪制出的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。CHO細(xì)胞一般20~24 h分裂一次,定點(diǎn)整合ZsGreen1報(bào)告基因的CHO-K1細(xì)胞(2C3)的倍增時(shí)間與CHO-K1細(xì)胞大體一致,分裂倍增時(shí)間按24 h計(jì),即每1天細(xì)胞發(fā)生1次倍增,記做細(xì)胞傳代1次。

圖1 2C3細(xì)胞生長(zhǎng)速率Fig.1 Growth rate of 2C3 cells

2.2 貼壁培養(yǎng)的2C3細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白情況

為了驗(yàn)證位點(diǎn)NW_003614172.1表達(dá)外源基因的穩(wěn)定性,作者持續(xù)觀(guān)察2C3細(xì)胞連續(xù)貼壁傳代培養(yǎng)過(guò)程中ZsGreen1蛋白的表達(dá)情況。前期對(duì)此細(xì)胞已進(jìn)行了20代傳代實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)熒光蛋白可以持續(xù)表達(dá)[10]。基于從生產(chǎn)細(xì)胞庫(kù)擴(kuò)增到大生產(chǎn)罐需要45~50代次的實(shí)際狀態(tài),本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以傳至20代的2C3細(xì)胞為初始細(xì)胞,連續(xù)傳代50次為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),觀(guān)察目的基因的表達(dá)情況,進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估。具體實(shí)驗(yàn)為,每傳10個(gè)代次,用倒置熒光鏡觀(guān)察并拍照記錄,見(jiàn)圖2(a),熒光場(chǎng)照片使用ImageJ軟件分析細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度,見(jiàn)圖2(b)。同時(shí),傳代過(guò)程中每傳代10次進(jìn)行一次細(xì)胞凍存,在連續(xù)傳代50次后,復(fù)蘇之前凍存的不同代次的細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步對(duì)熒光蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析,見(jiàn)圖2(c)、(d)。倒置熒光顯微鏡的觀(guān)察結(jié)果和流式細(xì)胞儀分析結(jié)果皆顯示,在連續(xù)貼壁傳代培養(yǎng)50代的過(guò)程中,100%的2C3細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)ZsGreen1報(bào)告基因。

2.3 懸浮培養(yǎng)的2C3細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白情況

治療性生物制品的原料藥生產(chǎn)基本采用懸浮細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn),所以在驗(yàn)證了貼壁培養(yǎng)的2C3細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白的穩(wěn)定性后,對(duì)其進(jìn)行了懸浮馴化。先采用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基直接替換完全培養(yǎng)基的方法馴化2C3細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,大小均一,數(shù)量能隔天翻倍時(shí),認(rèn)為其馴化成功,開(kāi)始進(jìn)行無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮傳代培養(yǎng)。倒置熒光顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白熒光強(qiáng)度較培養(yǎng)基中含血清時(shí)有明顯差異,細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度降低。為了判斷此現(xiàn)象是否因直接更換培養(yǎng)基引起的細(xì)胞不適應(yīng)導(dǎo)致,作者采用了第二種懸浮馴化方法,使培養(yǎng)基中血清終濃度逐步遞減,但是馴化成功后觀(guān)察到了同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度較培養(yǎng)基中含血清時(shí)有明顯差異。

對(duì)兩種方法馴化成功的細(xì)胞連續(xù)懸浮傳代培養(yǎng)30、60 d后,倒置熒光顯微鏡均觀(guān)察到細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度有所提高,見(jiàn)圖3,同時(shí)使用流式細(xì)胞儀對(duì)不同代次的懸浮細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白的情況進(jìn)行檢測(cè),使用FlowJo 7.6.2軟件分析檢測(cè)結(jié)果,見(jiàn)圖4。以CHO-K1細(xì)胞為對(duì)照,通過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)后,表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)目增多,陽(yáng)性細(xì)胞比例有了12%~15%的提升。

與此同時(shí),作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)懸浮培養(yǎng)使用的無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)10%血清后,懸浮細(xì)胞池中表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞比例明顯提升,95%以上的細(xì)胞能夠表達(dá)ZsGreen1報(bào)告基因,見(jiàn)圖5。

圖2 貼壁傳代培養(yǎng)的2C3細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白情況Fig.2 Expression of ZsGreen1 protein by adherently subcultured 2C3 cells

圖3 懸浮傳代培養(yǎng)的2C3細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白情況Fig.3 Expression of ZsGreen1 protein in suspension-cultured 2C3 cells

2.4 ZsGreen1蛋白的DNA水平驗(yàn)證

為了確認(rèn)流式分析儀檢測(cè)到的陰性細(xì)胞是否在細(xì)胞分裂過(guò)程中丟失了ZsGreen1基因,采用流式細(xì)胞術(shù)從直接更換培養(yǎng)基的方法中馴化成功的2C3細(xì)胞分選細(xì)胞,以未插入外源基因的CHO-K1為對(duì)照,以FITC-A熒光強(qiáng)度值103為陰性和陽(yáng)性細(xì)胞的分界,分別收集細(xì)胞,見(jiàn)圖6。

以分別回收的1.50×106個(gè)熒光蛋白表達(dá)陰性和陽(yáng)性細(xì)胞為材料,分別提取基因組,PCR擴(kuò)增ZsGreen1基因,瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖7,測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示,陰性和陽(yáng)性細(xì)胞群基因組內(nèi)均含有ZsGreen1基因,說(shuō)明蛋白表達(dá)的差異是細(xì)胞從貼壁培養(yǎng)到適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的過(guò)程中受到影響的結(jié)果。

圖4 流式細(xì)胞儀分析2C3細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白情況Fig.4 Flow cytometry analysis of the expression of fluorescent protein in 2C3 cells

圖5 無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清后2C3細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白的情況Fig.5 Expression of ZsGreen1 protein in 2C3 cells supplemented with 10%FBSin serum-free basal medium

圖6 流式分選儀分選2C3細(xì)胞示意圖Fig.6 Schematic diagram of sorting 2C3 cells by flow sorter

圖7 2C3細(xì)胞流式分選后陰性細(xì)胞池ZsGreen1基因驗(yàn)證Fig.7 Verification of the ZsGreen1 gene in the negative cell pool after 2C3 cell flow sorting

為了驗(yàn)證上文提到的血清的作用,將回收的陰性細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種在六孔板內(nèi),使用M2M4、M2M4+10%FBS、F-12K+10%FBS三種培養(yǎng)基培養(yǎng)。擴(kuò)培至T75培養(yǎng)瓶后,待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析,結(jié)果見(jiàn)圖8。培養(yǎng)基中加入血清后,有50%左右的陰性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殛?yáng)性細(xì)胞。以上結(jié)果都可以證明,在對(duì)2C3細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的過(guò)程中,ZsGreen1基因并沒(méi)有因細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)而丟失,通過(guò)優(yōu)化懸浮馴化的培養(yǎng)基和培育條件,有望提高目的蛋白的表達(dá)量。

表2 2C3陰性細(xì)胞PCR擴(kuò)增后片段測(cè)序結(jié)果Table 2 Fragment sequencing results of PCR amplification of 2C3 negative cells

圖8 血清影響陰性2C3細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白的驗(yàn)證Fig.8 Effect of serum on the ZsGreen1 protein expression in the negative 2C3 cells

2.5 ZsGreen1基因的轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證

作者推測(cè)血清可能在轉(zhuǎn)錄水平上影響了蛋白表達(dá),所以提取了在培養(yǎng)基M2M4、M2M4+10%FBS和F-12K+10%FBS中擴(kuò)培的3組陰性細(xì)胞以及M2M4培養(yǎng)的陽(yáng)性細(xì)胞的RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,進(jìn)行了Q-PCR實(shí)驗(yàn),以GAPDH為內(nèi)參。已經(jīng)適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞在F-12K+10%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,mRNA含量稍高于對(duì)照組,而在培養(yǎng)基M2M4中加入血清后,ZsGreen1蛋白的mRNA含量明顯提高,也稍高于同時(shí)收集的陽(yáng)性細(xì)胞,見(jiàn)圖9。

圖9 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)下2C3細(xì)胞內(nèi)ZsGreen1的mRNA表達(dá)量的變化Fig.9 ZsGreen1 mRNA content in 2C3 cells cultured in different culture media

3 結(jié)語(yǔ)

應(yīng)用定點(diǎn)整合的方法構(gòu)建CHO工程細(xì)胞系,可以快速將外源基因插入宿主細(xì)胞基因組的特定位置,從而避免傳統(tǒng)的隨機(jī)整合方法帶來(lái)的耗時(shí)費(fèi)力、“位置效應(yīng)”等問(wèn)題。為了能挑選出相對(duì)穩(wěn)定、高表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株,初始整合位點(diǎn)的選擇尤其重要。

前期作者應(yīng)用慢病毒示蹤報(bào)告基因技術(shù)以及染色體步移技術(shù),在CHO-K1細(xì)胞株中,尋找到了可以持續(xù)表達(dá)綠色熒光標(biāo)簽ZsGreen1的基因組內(nèi)位點(diǎn),測(cè)序結(jié)果明確了該整合位點(diǎn)為Kcmf1基因NW_003614172.1第629890堿基處[9]。本實(shí)驗(yàn)中主要使用倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù),以細(xì)胞熒光強(qiáng)度為指標(biāo),定量分析ZsGreen1報(bào)告基因的表達(dá)情況。通過(guò)對(duì)2C3細(xì)胞以貼壁和懸浮兩種不同的培養(yǎng)條件傳代培養(yǎng),可以確定NW_003614172.1第629890堿基處可作為整合位點(diǎn)用于外源基因的穩(wěn)定表達(dá)。

在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中,生產(chǎn)細(xì)胞庫(kù)擴(kuò)增到大生產(chǎn)罐需要45~50代次,所以本研究中的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)以連續(xù)傳代50次為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),觀(guān)察目的基因的表達(dá)情況。2C3細(xì)胞貼壁培養(yǎng)連續(xù)傳代50代次,100%的細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)ZsGreen1報(bào)告基因。無(wú)血清懸浮馴化培養(yǎng)2C3細(xì)胞時(shí),倒置熒光顯微鏡觀(guān)察到細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度明顯降低,但連續(xù)懸浮傳代培養(yǎng)60代次,熒光細(xì)胞數(shù)目顯著增多。在懸浮培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)10%FBS后,懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞池中ZsGreen1陽(yáng)性細(xì)胞比例上升到95%以上。流式細(xì)胞術(shù)分選細(xì)胞池中高、低表達(dá)ZsGreen1蛋白的2C3細(xì)胞,可以確定細(xì)胞分裂生長(zhǎng)過(guò)程中沒(méi)有丟失ZsGreen1基因,培養(yǎng)環(huán)境的改變影響了基因表達(dá)水平,猜測(cè)細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)優(yōu)先表達(dá)必需基因,關(guān)閉了非必需基因的表達(dá)以滿(mǎn)足生長(zhǎng)需求,當(dāng)營(yíng)養(yǎng)充足時(shí)重新開(kāi)啟。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,比如在懸浮培養(yǎng)基中添加血小板裂解液、植物水解素等增加培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng),有望提高目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量。無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基直接替換完全培養(yǎng)基和無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基逐步取代完全培養(yǎng)基這兩種不同的懸浮馴化方法,不會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)和外源蛋白表達(dá)的明顯差異,推薦使用直接替換的馴化方法更能縮短馴化時(shí)間。

目前,作者以CHO-K1為出發(fā)細(xì)胞株,使用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的定點(diǎn)整合技術(shù),在該位點(diǎn)成功敲入了生物藥市場(chǎng)上有代表性的3種治療性蛋白質(zhì)基因：人血清白蛋白(HSA,68 000)的基因、胰高血糖素樣肽-1突變雙聯(lián)體-人血清白蛋白(HSANGG,75 000)的基因和靶向VEGF人源化抗體(VEGF-hAb,150 000)輕重鏈的基因[10-11],在連續(xù)的貼壁和懸浮傳代培養(yǎng)中,細(xì)胞均可以表達(dá)對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì),進(jìn)一步驗(yàn)證了該位點(diǎn)的適用度。綜上,Kcmf1基因NW_003614172.1第629890堿基處可作為整合位點(diǎn)成為研究人員構(gòu)建CHO工程細(xì)胞株的可靠選擇。