楊 蕾，丁學(xué)峰，蔡燕飛，陳 蘊(yùn)，龔笑海，段作營，李華鐘，金 堅*

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 無錫214122)

中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞作為生物技術(shù)藥物生產(chǎn)細(xì)胞的優(yōu)勢地位已經(jīng)明確,且構(gòu)建適于穩(wěn)定生產(chǎn)治療性生物制品的CHO工程細(xì)胞系一直是研究工作的熱點[1-2]。經(jīng)典的CHO工程細(xì)胞系構(gòu)建均是采用目的基因隨機(jī)整合,多輪單克隆篩選,挑選相對穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白細(xì)胞株的方法[3-4]。帶來的麻煩是構(gòu)建工作費時費力,更重要的是無法知曉高、低表達(dá)目的蛋白的原因。隨著主細(xì)胞庫到生產(chǎn)細(xì)胞庫的放大和生產(chǎn)過程傳代,目的蛋白的表達(dá)量極易變化,丟失了目的蛋白表達(dá)的非生產(chǎn)性細(xì)胞克隆持續(xù)增加,難以達(dá)到生產(chǎn)和監(jiān)管的要求。構(gòu)建定點整合的穩(wěn)定表達(dá)外源基因的CHO工程細(xì)胞系是理論上解決這些問題的有效方法。CHO細(xì)胞的一、二和三代基因測序結(jié)果均已相繼公布,相關(guān)品系的CHO細(xì)胞染色體變異很大。對已保有的各種生產(chǎn)治療性生物制品的高、低表達(dá)CHO細(xì)胞株,結(jié)合其整合位點和臨近區(qū)域的結(jié)構(gòu)分析,還未有成功地將CHO細(xì)胞的穩(wěn)定高表達(dá)整合位點用于建立生產(chǎn)型CHO工程細(xì)胞系的報道[5-7]。

作者前期以CHO-K1為出發(fā)細(xì)胞株,組合應(yīng)用慢病毒示蹤報告基因技術(shù)和染色體步移技術(shù),尋找到了可以持續(xù)表達(dá)綠色熒光標(biāo)簽的基因組內(nèi)位點。測序結(jié)果明確了該整合位點為NW_003614172.1第629890堿基處,位于鉀通道調(diào)節(jié)因子1(potassium channel modulatory factor 1,Kcmf1)基因內(nèi)部的一段非編碼區(qū)域。該基因編碼鋅指蛋白,參與鉀通道的調(diào)節(jié)[8-9]。以此為基礎(chǔ),構(gòu)建和單克隆化了以Kcmf1基因NW_003614172.1第629890堿基處定點整合ZsGreen1報告基因的CHO-K1細(xì)胞(2C3),對其作為工程細(xì)胞的穩(wěn)定性開展了系統(tǒng)評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 中國倉鼠卵巢細(xì)胞亞株CHO-K1,購自美國ATCC公司；2C3細(xì)胞,為染色體NW_003614172.1內(nèi)第629890號堿基處整合了ZsGreen1基因的CHO-K1細(xì)胞株,由作者所在課題組構(gòu)建和保存[9]。

1.1.2 主要試劑 Ham's F-12K培養(yǎng)基、胎牛血清：美國Gibco公司產(chǎn)品；M2、M4無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蘇州康聚生物技術(shù)公司產(chǎn)品；PCR試劑：南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；TRIzol試劑：美侖生物公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Green Master Mix：Takara公司產(chǎn)品；DEPC水、基因組DNA小量抽提試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗中所用引物序列見表1。

表1 PCR引物列表Table 1 List of PCR primers

1.1.3 儀器與設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)箱SeriesⅡWater Jacket、NANODROP 2000：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡、倒置式生物顯微鏡TE2000-S：日本NIKON公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀、流式分選儀BD FACSAriaIII：美國BD公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀infinite M200 PRO、凝膠成像系統(tǒng)Tanon-5200Multi：上海天能公司產(chǎn)品；核酸電泳儀Mini-Protean、PCR儀C1000和Q-PCR儀CFX96：美國伯樂公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) CHO-K1細(xì)胞和2C3細(xì)胞在完全培養(yǎng)基(Ham's F-12K+體積分?jǐn)?shù)10%FBS)內(nèi)連續(xù)貼壁傳代培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2。

先后采用了兩種方法對2C3細(xì)胞進(jìn)行懸浮馴化：第一種是使用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基M2+M4(體積比為1∶1)直接替換完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞,第二種是使用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基M2+M4(體積比為1∶1)逐步取代完全培養(yǎng)基,使培養(yǎng)基中血清的最終體積分?jǐn)?shù)也逐步遞減,梯度為10%、8%、6%、4%、2%、1%、0.5%、0%,每個梯度連續(xù)傳代培養(yǎng)2~3次,當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好時減為另一梯度。

細(xì)胞馴化成功后,在150 mL搖瓶中使用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基M2+M4(體積比為1∶1)懸浮傳代培養(yǎng),培養(yǎng)基為30 mL,恒溫?fù)u床上的培養(yǎng)條件為110 r/min、37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2。每天取樣計數(shù),調(diào)整細(xì)胞接種密度為1.0×106個/mL。

1.2.2 MTT法檢測2C3貼壁細(xì)胞的倍增時間 將T75培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)細(xì)胞用胰蛋白酶消化后計數(shù),用新鮮的完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1×104個/mL,吹打混勻后按每孔2 500個細(xì)胞接種到96孔板中,5個重復(fù)孔,共接種10塊相同的96孔板,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第二天,取出一塊96孔板,避光加入MTT,每孔10μL,4小時后加入MTT Buffer,每孔100μL,過夜反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測取560 nm波長下的吸光值。之后9天內(nèi),在每天相同時間點取一塊板重復(fù)上述操作,依據(jù)測得的吸光值繪制出細(xì)胞的生長曲線。

1.2.3 倒置熒光顯微鏡觀察ZsGreen1蛋白表達(dá)情況 貼壁細(xì)胞每分裂倍增10次,細(xì)胞匯合度達(dá)50%~60%時,倒置熒光顯微鏡觀察ZsGreen1蛋白表達(dá)情況,隨機(jī)選擇鏡下視野進(jìn)行明場和熒光場拍攝。每次拍攝條件一致,AECompensation為+0.0 EV,Exposure Time為1 s,Gain為4×,Contrast為Linear,熒光場照片采用ImageJ軟件分析細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。

按血清終濃度遞減的方法懸浮馴化的細(xì)胞(2C3-M2M4+體積分?jǐn)?shù)0%FBS),每次降低血清含量時觀察ZsGreen1蛋白表達(dá)情況；直接使用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞(2C3-M2M4),待細(xì)胞轉(zhuǎn)至搖瓶培養(yǎng)時初次觀察。馴化成功后的懸浮2C3細(xì)胞,每分裂倍增10次進(jìn)行觀察,拍攝條件及分析方法與貼壁細(xì)胞相同。

1.2.4 流式細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度貼壁細(xì)胞每分裂倍增10次后取出部分細(xì)胞進(jìn)行凍存,儲存于液氮罐中。在細(xì)胞總倍增次數(shù)達(dá)到50次時,同時復(fù)蘇之前凍存的所有不同代次的細(xì)胞,傳代培養(yǎng)至細(xì)胞生長狀態(tài)良好,使用流式細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度,檢測結(jié)果使用FlowJo 7.6.2軟件進(jìn)行分析。

懸浮細(xì)胞在馴化成功后每分裂倍增10次進(jìn)行流式分析,檢測時和貼壁細(xì)胞使用同一條件,數(shù)據(jù)分析方法相同。

1.2.5 流式細(xì)胞分選儀分選懸浮細(xì)胞池 分析懸浮馴化成功的2C3細(xì)胞池,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞池中的細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白的熒光強(qiáng)度有一定的差異。以未插入外源基因的CHO-K1細(xì)胞為陰性對照,收集10 000個細(xì)胞測定對照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度,確定103為陰、陽性細(xì)胞分界線：單細(xì)胞FITC-A熒光強(qiáng)度低于103時為陰性細(xì)胞,高于103時為陽性細(xì)胞。流式細(xì)胞分選儀對2C3細(xì)胞池進(jìn)行分選,收集陰性細(xì)胞1.2×106個,分成四組分別培養(yǎng)在M2M4、M2M4+10%FBS、Ham's F-12K、Ham's F-12K+10%FBS四種培養(yǎng)基中(M2∶M4體積比為1∶1)；收集熒光強(qiáng)度值最高的10%陽性細(xì)胞3×105個,使用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基擴(kuò)培。

1.2.6 2C3細(xì)胞中ZsGreen1基因的分析 使用基因組DNA小量抽提試劑盒,分別提取在無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基里擴(kuò)培后的陰性、陽性細(xì)胞的基因組,使用表1中ZsGreen1-F.1和ZsGreen1-R.1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為：2×Phanta?Max Buffer 12.5μL,dNTPMix 0.5μL,ZsGreen1-F.1(10μmol/L)1μL,ZsGreen1-R.1(10μmol/L)1μL,Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5μL,DNA 100 ng,ddH2O補(bǔ)足25μL。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s,58℃退火15 s,72℃延伸45 s,30個循環(huán)；72℃延伸5 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

1.2.7 2C3細(xì)胞中ZsGreen1基因轉(zhuǎn)錄水平分析分別提取在M2M4、M2M4+10%FBS、Ham′s F-12K、Ham′s F-12K+10%FBS四種不同培養(yǎng)基中擴(kuò)培的陰性細(xì)胞的RNA,將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系 為：5×PrimeScript RTMaster Mix(Perfect Real Time)4μL,Total RNA 1μg,RNase Free dH2O補(bǔ)足20μL。輕柔混勻后使用PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)條件為：37℃,15 min；85℃,5 s；降溫至4℃,于-20℃長期保存。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行Q-PCR,反應(yīng)體系為：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10μL,ZsGreen1-F.2 (10μmol/L)1μL,ZsGreen1-R.2(10μmol/L)1μL,cDNA 10 ng,ddH2O補(bǔ)足20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s,60℃延伸30 s,40個循環(huán)；溶解曲線為65℃反應(yīng)5 s,95℃反應(yīng)60 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 2C3細(xì)胞倍增時間檢測結(jié)果

用MTT法檢測560 nm波長下的吸光值,繪制出的細(xì)胞生長曲線見圖1。CHO細(xì)胞一般20~24 h分裂一次,定點整合ZsGreen1報告基因的CHO-K1細(xì)胞(2C3)的倍增時間與CHO-K1細(xì)胞大體一致,分裂倍增時間按24 h計,即每1天細(xì)胞發(fā)生1次倍增,記做細(xì)胞傳代1次。

圖1 2C3細(xì)胞生長速率Fig.1 Growth rate of 2C3 cells

2.2 貼壁培養(yǎng)的2C3細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白情況

為了驗證位點NW_003614172.1表達(dá)外源基因的穩(wěn)定性,作者持續(xù)觀察2C3細(xì)胞連續(xù)貼壁傳代培養(yǎng)過程中ZsGreen1蛋白的表達(dá)情況。前期對此細(xì)胞已進(jìn)行了20代傳代實驗,發(fā)現(xiàn)熒光蛋白可以持續(xù)表達(dá)[10]?；趶纳a(chǎn)細(xì)胞庫擴(kuò)增到大生產(chǎn)罐需要45~50代次的實際狀態(tài),本實驗設(shè)計以傳至20代的2C3細(xì)胞為初始細(xì)胞,連續(xù)傳代50次為實驗終點,觀察目的基因的表達(dá)情況,進(jìn)行穩(wěn)定性評估。具體實驗為,每傳10個代次,用倒置熒光鏡觀察并拍照記錄,見圖2(a),熒光場照片使用ImageJ軟件分析細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度,見圖2(b)。同時,傳代過程中每傳代10次進(jìn)行一次細(xì)胞凍存,在連續(xù)傳代50次后,復(fù)蘇之前凍存的不同代次的細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步對熒光蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析,見圖2(c)、(d)。倒置熒光顯微鏡的觀察結(jié)果和流式細(xì)胞儀分析結(jié)果皆顯示,在連續(xù)貼壁傳代培養(yǎng)50代的過程中,100%的2C3細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)ZsGreen1報告基因。

2.3 懸浮培養(yǎng)的2C3細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白情況

治療性生物制品的原料藥生產(chǎn)基本采用懸浮細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn),所以在驗證了貼壁培養(yǎng)的2C3細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白的穩(wěn)定性后,對其進(jìn)行了懸浮馴化。先采用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基直接替換完全培養(yǎng)基的方法馴化2C3細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好,大小均一,數(shù)量能隔天翻倍時,認(rèn)為其馴化成功,開始進(jìn)行無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮傳代培養(yǎng)。倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白熒光強(qiáng)度較培養(yǎng)基中含血清時有明顯差異,細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度降低。為了判斷此現(xiàn)象是否因直接更換培養(yǎng)基引起的細(xì)胞不適應(yīng)導(dǎo)致,作者采用了第二種懸浮馴化方法,使培養(yǎng)基中血清終濃度逐步遞減,但是馴化成功后觀察到了同樣的實驗結(jié)果：細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度較培養(yǎng)基中含血清時有明顯差異。

對兩種方法馴化成功的細(xì)胞連續(xù)懸浮傳代培養(yǎng)30、60 d后,倒置熒光顯微鏡均觀察到細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度有所提高,見圖3,同時使用流式細(xì)胞儀對不同代次的懸浮細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白的情況進(jìn)行檢測,使用FlowJo 7.6.2軟件分析檢測結(jié)果,見圖4。以CHO-K1細(xì)胞為對照,通過連續(xù)傳代培養(yǎng)后,表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)目增多,陽性細(xì)胞比例有了12%~15%的提升。

與此同時,作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)懸浮培養(yǎng)使用的無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)10%血清后,懸浮細(xì)胞池中表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞比例明顯提升,95%以上的細(xì)胞能夠表達(dá)ZsGreen1報告基因,見圖5。

圖2 貼壁傳代培養(yǎng)的2C3細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白情況Fig.2 Expression of ZsGreen1 protein by adherently subcultured 2C3 cells

圖3 懸浮傳代培養(yǎng)的2C3細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白情況Fig.3 Expression of ZsGreen1 protein in suspension-cultured 2C3 cells

2.4 ZsGreen1蛋白的DNA水平驗證

為了確認(rèn)流式分析儀檢測到的陰性細(xì)胞是否在細(xì)胞分裂過程中丟失了ZsGreen1基因,采用流式細(xì)胞術(shù)從直接更換培養(yǎng)基的方法中馴化成功的2C3細(xì)胞分選細(xì)胞,以未插入外源基因的CHO-K1為對照,以FITC-A熒光強(qiáng)度值103為陰性和陽性細(xì)胞的分界,分別收集細(xì)胞,見圖6。

以分別回收的1.50×106個熒光蛋白表達(dá)陰性和陽性細(xì)胞為材料,分別提取基因組,PCR擴(kuò)增ZsGreen1基因,瓊脂糖凝膠電泳驗證擴(kuò)增結(jié)果見圖7,測序結(jié)果見表2。結(jié)果顯示,陰性和陽性細(xì)胞群基因組內(nèi)均含有ZsGreen1基因,說明蛋白表達(dá)的差異是細(xì)胞從貼壁培養(yǎng)到適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的過程中受到影響的結(jié)果。

圖4 流式細(xì)胞儀分析2C3細(xì)胞表達(dá)熒光蛋白情況Fig.4 Flow cytometry analysis of the expression of fluorescent protein in 2C3 cells

圖5 無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清后2C3細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白的情況Fig.5 Expression of ZsGreen1 protein in 2C3 cells supplemented with 10%FBSin serum-free basal medium

圖6 流式分選儀分選2C3細(xì)胞示意圖Fig.6 Schematic diagram of sorting 2C3 cells by flow sorter

圖7 2C3細(xì)胞流式分選后陰性細(xì)胞池ZsGreen1基因驗證Fig.7 Verification of the ZsGreen1 gene in the negative cell pool after 2C3 cell flow sorting

為了驗證上文提到的血清的作用,將回收的陰性細(xì)胞以3×105個/孔接種在六孔板內(nèi),使用M2M4、M2M4+10%FBS、F-12K+10%FBS三種培養(yǎng)基培養(yǎng)。擴(kuò)培至T75培養(yǎng)瓶后,待細(xì)胞生長狀態(tài)良好,進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析,結(jié)果見圖8。培養(yǎng)基中加入血清后,有50%左右的陰性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃约?xì)胞。以上結(jié)果都可以證明,在對2C3細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的過程中,ZsGreen1基因并沒有因細(xì)胞分裂、生長而丟失,通過優(yōu)化懸浮馴化的培養(yǎng)基和培育條件,有望提高目的蛋白的表達(dá)量。

表2 2C3陰性細(xì)胞PCR擴(kuò)增后片段測序結(jié)果Table 2 Fragment sequencing results of PCR amplification of 2C3 negative cells

圖8 血清影響陰性2C3細(xì)胞表達(dá)ZsGreen1蛋白的驗證Fig.8 Effect of serum on the ZsGreen1 protein expression in the negative 2C3 cells

2.5 ZsGreen1基因的轉(zhuǎn)錄水平驗證

作者推測血清可能在轉(zhuǎn)錄水平上影響了蛋白表達(dá),所以提取了在培養(yǎng)基M2M4、M2M4+10%FBS和F-12K+10%FBS中擴(kuò)培的3組陰性細(xì)胞以及M2M4培養(yǎng)的陽性細(xì)胞的RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,進(jìn)行了Q-PCR實驗,以GAPDH為內(nèi)參。已經(jīng)適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞在F-12K+10%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,mRNA含量稍高于對照組,而在培養(yǎng)基M2M4中加入血清后,ZsGreen1蛋白的mRNA含量明顯提高,也稍高于同時收集的陽性細(xì)胞,見圖9。

圖9 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)下2C3細(xì)胞內(nèi)ZsGreen1的mRNA表達(dá)量的變化Fig.9 ZsGreen1 mRNA content in 2C3 cells cultured in different culture media

3 結(jié)語

應(yīng)用定點整合的方法構(gòu)建CHO工程細(xì)胞系,可以快速將外源基因插入宿主細(xì)胞基因組的特定位置,從而避免傳統(tǒng)的隨機(jī)整合方法帶來的耗時費力、“位置效應(yīng)”等問題。為了能挑選出相對穩(wěn)定、高表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株,初始整合位點的選擇尤其重要。

前期作者應(yīng)用慢病毒示蹤報告基因技術(shù)以及染色體步移技術(shù),在CHO-K1細(xì)胞株中,尋找到了可以持續(xù)表達(dá)綠色熒光標(biāo)簽ZsGreen1的基因組內(nèi)位點,測序結(jié)果明確了該整合位點為Kcmf1基因NW_003614172.1第629890堿基處[9]。本實驗中主要使用倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù),以細(xì)胞熒光強(qiáng)度為指標(biāo),定量分析ZsGreen1報告基因的表達(dá)情況。通過對2C3細(xì)胞以貼壁和懸浮兩種不同的培養(yǎng)條件傳代培養(yǎng),可以確定NW_003614172.1第629890堿基處可作為整合位點用于外源基因的穩(wěn)定表達(dá)。

在實際工業(yè)生產(chǎn)過程中,生產(chǎn)細(xì)胞庫擴(kuò)增到大生產(chǎn)罐需要45~50代次,所以本研究中的穩(wěn)定性評價以連續(xù)傳代50次為實驗終點,觀察目的基因的表達(dá)情況。2C3細(xì)胞貼壁培養(yǎng)連續(xù)傳代50代次,100%的細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)ZsGreen1報告基因。無血清懸浮馴化培養(yǎng)2C3細(xì)胞時,倒置熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度明顯降低,但連續(xù)懸浮傳代培養(yǎng)60代次,熒光細(xì)胞數(shù)目顯著增多。在懸浮培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)10%FBS后,懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞池中ZsGreen1陽性細(xì)胞比例上升到95%以上。流式細(xì)胞術(shù)分選細(xì)胞池中高、低表達(dá)ZsGreen1蛋白的2C3細(xì)胞,可以確定細(xì)胞分裂生長過程中沒有丟失ZsGreen1基因,培養(yǎng)環(huán)境的改變影響了基因表達(dá)水平,猜測細(xì)胞在營養(yǎng)匱乏時優(yōu)先表達(dá)必需基因,關(guān)閉了非必需基因的表達(dá)以滿足生長需求,當(dāng)營養(yǎng)充足時重新開啟。通過優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,比如在懸浮培養(yǎng)基中添加血小板裂解液、植物水解素等增加培養(yǎng)基的營養(yǎng),有望提高目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量。無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基直接替換完全培養(yǎng)基和無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基逐步取代完全培養(yǎng)基這兩種不同的懸浮馴化方法,不會造成細(xì)胞生長和外源蛋白表達(dá)的明顯差異,推薦使用直接替換的馴化方法更能縮短馴化時間。

目前,作者以CHO-K1為出發(fā)細(xì)胞株,使用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的定點整合技術(shù),在該位點成功敲入了生物藥市場上有代表性的3種治療性蛋白質(zhì)基因：人血清白蛋白(HSA,68 000)的基因、胰高血糖素樣肽-1突變雙聯(lián)體-人血清白蛋白(HSANGG,75 000)的基因和靶向VEGF人源化抗體(VEGF-hAb,150 000)輕重鏈的基因[10-11],在連續(xù)的貼壁和懸浮傳代培養(yǎng)中,細(xì)胞均可以表達(dá)對應(yīng)蛋白質(zhì),進(jìn)一步驗證了該位點的適用度。綜上,Kcmf1基因NW_003614172.1第629890堿基處可作為整合位點成為研究人員構(gòu)建CHO工程細(xì)胞株的可靠選擇。