韋麗婷，譚貴良，樂 琳，吳世嘉，王周平*

(1.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇 無錫214122；2.江南大學 食品學院,江蘇 無錫214122；3.中山市食品藥品檢驗所,廣東 中山528437)

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN),又稱為F2毒素,是由鐮刀菌屬的禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌等產(chǎn)生的一種非甾體雌激素樣作用的真菌毒素[1],其主要污染玉米、小麥、大米、高粱等谷物及其制品[2-4]。ZEN具有較高的耐熱性,110℃條件下處理1 h才會被完全破壞,因此在食品或飼料加工過程中不易去除,對人體和動物健康帶來極大的危害[5]。ZEN具有較強的生殖毒性、神經(jīng)毒性和致癌性[6-8],可與雌激素受體結合引起動物發(fā)生雌激素亢進癥,導致動物不孕或流產(chǎn),給畜牧業(yè)經(jīng)濟造成巨大的經(jīng)濟損失[9]。ZEN被國際癌癥研究機構IARC分類為第3組致癌物質(zhì),其毒性僅次于黃曲霉毒素[10-11]。為了減少ZEN對人類和動物的危害,多個國家已對食品和飼料中的ZEN制定了限量標準,歐盟規(guī)定了谷物和玉米中ZEN的含量分別不能超過0.1 mg/kg和0.35 mg/kg。澳大利亞規(guī)定谷物中ZEN的含量不能超過50μg/kg,我國《GB2761-2011食品中真菌毒素限量》標準規(guī)定玉米、小麥及其制品中ZEN的含量不得超過60μg/kg,《GB 13078.2-2006飼料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允許量》規(guī)定配合飼料、玉米中ZEN的安全限量為500μg/kg。

目前,用于檢測食品和飼料中ZEN含量的方法主要有薄層色譜法(TLC)[12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[13]、高效液相色譜法(HPLC)[14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[15]和酶聯(lián)免疫法(ELISA)[16]。這些方法各有其優(yōu)缺點,如操作復雜、需要昂貴的儀器和專業(yè)的操作人員、穩(wěn)定性差等問題。酶聯(lián)免疫法靈敏度高、特異性好,但小分子半抗原的抗體制備過程非常復雜,需要進行動物免疫實驗,且研發(fā)周期較長。因此,研發(fā)一種新型的生物識別分子,用于檢測玉米赤霉烯酮具有重要的意義。

核酸適配體是經(jīng)SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化)技術體外篩選獲得的一段具有特定復雜三維構象、可與靶標特異性結合的寡核苷酸片段[17-18]。與抗體相比,適配體具有易人工合成和修飾、靶物質(zhì)范圍廣、穩(wěn)定性好、分子量小和易保存等優(yōu)點。目前,利用適配體作為識別分子主要應用于醫(yī)學、生命科學和生物分析科學等領域,基于適配體的分析檢測研究主要集中在熒光檢測法、生物傳感器和電化學傳感器[19-21],在食品中小分子危害物質(zhì)檢測方面的報道不多。作者通過HRP標記適配體互補鏈形成信號探針,與靶標競爭結合適配體,建立一種可視化快速檢測玉米赤霉烯酮的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 試劑 玉米赤霉烯酮(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、伏馬毒素B1(FB1)、嘔吐毒素(DON)和赭曲霉毒素A(OTA)標準品與鏈霉親和素購于Sigma-Aldrich；牛血清白蛋白 (BSA)、氯化鈉(NaCl)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、碳酸鈉(Na2CO3)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、氯化鉀(KCl)、濃硫酸、吐溫-20等均購買于國藥集團化學試劑有限公司,均為分析純；辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液、ZEN適配體5′bio-TCA TCT ATC TAT GGT ACA TTA CTA TCT GTA ATG TGA TAT G-3′和ZEN適配體互補鏈(cDNA)5′bio-AGT AGA TAG ATA CCA TGT AAT GAT AGA CAT TAC ACT ATA C-3′均購于生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.2 儀器 AR224CN電子天平：奧豪斯儀器(中國)有限公司產(chǎn)品；Starter 3C實驗室pH計：奧豪斯儀器(中國)有限公司產(chǎn)品；Direct-Q3超純水制備儀：美國Millipore公司產(chǎn)品；96孔酶標板：美國Corning公司產(chǎn)品；Synergy H1全功能酶標儀：美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 cDNA-HRP信號探針的合成 用PBS緩沖液(10 mmol/L,pH 7.4)將1 mg/mL鏈霉親和素修飾的HRP進行稀釋,取996μL HRP稀釋液與8μL 10μmol/L生物素修飾的cDNA混合,在10℃條件下孵育3 h,即可得到cDNA-HRP信號探針,并于-20℃下保存。

1.2.2 鏈霉親和素包被酶標板 用碳酸鹽緩沖液(10 mmol/L,pH 9.6)將其上的鏈霉親和素進行稀釋,每孔加入200μL,置于4℃冰箱中過夜,然后將酶標板內(nèi)的液體甩干,再用PBST洗滌緩沖液(1×PBS緩沖液＋體積分數(shù)0.05%吐溫-20)清洗3次,每次1 min,在濾紙上拍干,為了防止實驗中發(fā)生非特異吸附,加入200μL的BSA封閉液對未完全被鏈霉親和素包被的酶標板進行封閉,37℃條件下孵育1 h,用PBST洗滌緩沖液清洗3次,每次1 min,輕輕拍干。

1.2.3 競爭性酶聯(lián)適配體檢測ZEN 在鏈霉親和素包被的酶標板中加入10μL生物素標記的ZEN適配體,37℃條件下孵育30 min,拍干,用PBST緩沖洗滌液洗板3次,每次1 min,輕輕拍干。將100μL待測樣品加到酶標板中,同時加入100μL cDNAHRP信號探針,混合均勻,25℃條件下孵育1 h,然后將酶標板拍干,再用PBST洗滌緩沖液洗板3次,每次1 min,輕輕拍干。最后在每孔中加入100μL TMB顯色液,室溫放置20 min后,加入100μL的體積分數(shù)2%H2SO4終止液,用酶標儀測定在450 nm波長處溶液的吸光度值。

1.2.4 特異性實驗 為驗證實驗方法的特異性,應用該實驗建立的檢測方法對ZEN、FB1、DON、AFB1、OTA標準液和空白樣品同時進行檢測,實驗中ZEN的質(zhì)量濃度為100 ng/mL,其他對照毒素質(zhì)量濃度為ZEN的10倍。用酶標儀測定在450 nm波長處溶液的吸光度值,通過比較450 nm處的吸光度值大小和溶液顏色深淺來評價本實驗的特異性。

1.2.5 實際樣品加標回收測定 為驗證基于競爭性酶聯(lián)適配體檢測玉米赤霉烯酮在實際應用中的可行性,用本地超市的啤酒和玉米樣品進行加標回收實驗。樣品制備如下：將啤酒樣品置于4℃冰箱中30 min,再超聲30 min直至完全脫氣,將20 g溶解在50 mL體積分數(shù)70%甲醇中,取10 mL溶液加入40 mL超純水中稀釋,隨后用0.22μm過濾膜過濾。同樣,將20 g粉碎的玉米溶于50 mL體積分數(shù)70%甲醇,高速攪拌2 min,用定量濾紙過濾,然后將10 mL濾液轉移到40 mL超純水中稀釋,隨后用0.22μm過濾膜過濾。然后在啤酒和玉米樣品中加入ZEN標準溶液,加標啤酒和玉米樣品的質(zhì)量濃度分別為0.70、1.40、7.00 ng/mL。取100μL不同濃度的加標樣品用本實驗方法檢測,另外取100μL不同濃度的加標樣品用購買的玉米赤霉烯酮酶聯(lián)免疫試劑盒檢測,對兩種方法的檢測結果進行分析和比較,以驗證實驗所建立的檢測方法的準確性和穩(wěn)定性。

2 結果與討論

2.1 檢測原理

將生物素標記的ZEN適配體固定在鏈霉親和素包被的微孔板上,適配體互補鏈cDNA與辣根過氧化物酶連接形成cDNA-HRP復合物作為信號探針,cDNA-HRP復合物和靶標競爭與適配體結合,加入TMB底物顯色液,在HRP的作用下,TMB被氧化為藍色,加入酸終止液后,溶液變?yōu)辄S色。靶標濃度與溶液顏色深淺呈反比,通過測定溶液在450 nm處的吸光度值和觀察溶液顏色的深淺變化,即可實現(xiàn)對待測樣品中ZEN的可視化檢測。檢測原理見圖1。

圖1 基于競爭性酶聯(lián)適配體可視化檢測玉米赤霉烯酮的原理圖Fig.1 Schematic illustration of the visual detection of zearalenone based on competitive emzyme-linked aptamer assay

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1 鏈霉親和素包被濃度的優(yōu)化 生物素標記的ZEN適配體通過生物素-親和素的連接固定于微孔板上,因此鏈霉親和素的包被量對檢測靈敏度有很大的影響。選取6個不同質(zhì)量濃度的鏈霉親和素(5、10、15、20、25、30μg/mL)包被微孔板進行實驗。從圖2(a)可知,隨著鏈霉親和素質(zhì)量濃度的增加,溶液的吸光度值A450nm也不斷增大,當鏈霉親和素質(zhì)量濃度達到20μg/mL后,A450nm值不再隨著質(zhì)量濃度的增加而增大,而是趨于平緩,說明包被微孔板的鏈霉親和素的量達到了飽和狀態(tài)。因此,選取20μg/mL鏈霉親和素為最佳包被質(zhì)量濃度。

2.2.2 BSA封閉液濃度的優(yōu)化 為防止實驗過程中發(fā)生非特異性吸附而影響檢測結果,在鏈霉親和素包被微孔板后加入BSA封閉液進行封閉,BSA封閉液濃度低會產(chǎn)生非特異性吸附,而濃度高也會降低檢測靈敏度。因此,選取7個不同質(zhì)量濃度的BSA封閉液(0、5、10、15、20、25、30 mg/mL)進行優(yōu)化,在空白樣品條件下測定溶液在450 nm處的吸光度值。從圖2(b)可知,隨著BSA質(zhì)量濃度的增大,A450nm值逐漸降低,表明微孔板底面的非特異性吸附不斷減少,當BSA質(zhì)量濃度達到20 mg/mL后,A450nm值逐漸趨于平穩(wěn)不再下降,說明BSA已將微孔板底部未被鏈霉親和素包被的部分全部封閉。因此,BSA封閉液的最佳質(zhì)量濃度為20 mg/mL。

2.2.3 適配體濃度的優(yōu)化 生物素標記的ZEN適配體作為捕獲探針,能夠特異性識別和捕獲靶標分子,并且能與cDNA-HRP信號探針互補雜交,從而實現(xiàn)待測樣品中ZEN的檢測,因此,適配體的濃度對實驗結果有較大影響。實驗選取6個不同濃度的ZEN適配體(100、200、300、400、500、600 nmol/L)進行空白樣品的檢測。從圖2(c)可知,隨著適配體濃度的增加,吸光度值A450nm也逐漸增大,當適配體濃度達到200 nmol/L后,A450nm值趨于平緩不再增大,表明適配體濃度已經(jīng)達到飽和狀態(tài)。根據(jù)實驗結果,選擇200 nmol/L為最佳適配體濃度。

2.2.4 HRP稀釋倍數(shù)的優(yōu)化 cDNA-HRP復合物作為實驗中的信號探針,HRP能夠將底物分子TMB催化氧化產(chǎn)生藍色反應產(chǎn)物,HRP的濃度可影響ZEN的可視化檢測的靈敏度。同時檢測含靶標樣品(ZEN質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL)和空白樣品,當兩者吸光度差值最大時,即溶液顏色的區(qū)分度最大,所對應的HRP稀釋倍數(shù)為最佳稀釋倍數(shù)。選取7個不同稀釋倍數(shù)的HRP(100、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000倍),同時檢測含靶標樣品和空白樣品。從圖2(d)可知,空白樣品的吸光度比含靶標樣品的信號強度高,隨著HRP稀釋倍數(shù)的增大,溶液的信號強度也逐漸降低,當HRP稀釋倍數(shù)為500倍時,含靶標樣品與空白樣品在450 nm處的吸光度差值最大,達到了最佳的比色效果,因此,最佳的HRP稀釋倍數(shù)為500倍。

圖2 實驗條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of experimental conditions

2.3 標準曲線測定

在最佳實驗條件下,采用競爭性酶聯(lián)適配體檢測不同濃度的ZEN,ZEN的系列標準質(zhì)量濃度為1、10、100、1 000、10 000 ng/mL,以ZEN質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標,溶液吸光度值A450nm為縱坐標,繪制標準曲線。從圖3可知,ZEN質(zhì)量濃度在1～10 000 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系,檢測限(3N/S,N為空白樣品信號的標準偏差,S為標準曲線的斜率)為0.7 ng/mL。與歐盟、澳大利亞和我國國家標準規(guī)定的食品中ZEN的最大限量(100、50、60μg/kg)相比,該實驗所建立的競爭性酶鏈適配體檢測方法能夠滿足ZEN定量檢測分析的要求。

圖3 玉米赤霉烯酮濃度與450 nm處吸光度值之間的線性關系Fig.3 Linear relationship between zearalenoneconcentration and absorbance at 450 nm

2.4 特異性檢測

為驗證實驗方法的特異性,防止假陽性現(xiàn)象的發(fā)生,應用所構建的方法對ZEN、FB1、DON、AFB1、OTA和空白樣品同時進行檢測。從圖4可知,ZEN樣品孔的吸光度值A450nm較低,顏色較淺,其余對照真菌毒素和空白樣品孔的吸光度值A450nm都較高,溶液顏色也較深。實驗結果表明此競爭性酶聯(lián)適配體檢測ZEN方法具有較高的特異性,可用于ZEN的特異性檢測。

圖4 競爭性酶鏈適配體檢測方法的特異性實驗結果Fig.4 Specific experimental results of the visual detection of zearalenone based on competitive emzymelinked aptamer assay

2.5 食品樣品加標回收檢測

為驗證實驗方法的準確性,用酶聯(lián)免疫檢測法與該方法進行對照。將從超市購買的啤酒和玉米樣品進行前處理后,分別向2個樣品中加入3種不同質(zhì)量濃度的ZEN標準液,每個質(zhì)量濃度做3組平行對照,分別用兩種方法進行ZEN的加標回收檢測。從表1可知,啤酒樣品回收率為88.57%～102.14%,玉米樣品回收率為91.43%～106.43%,與酶聯(lián)免疫法對比,實驗結果相差不大,表明了該實驗方法具有準確性和穩(wěn)定性,可用于不同食品樣品檢測。

表1 啤酒和玉米樣品中ZEN加標回收檢測結果(n=3)Table 1 Spike recovery results of ZEN in beer and corn samples(n=3)

3 結語

作者建立了一種基于競爭性酶聯(lián)適配體檢測玉米赤霉烯酮的方法,該方法檢測靈敏度高、特異性好且成本低,能用肉眼判斷實驗結果,不需要特殊的儀器檢測。方法的檢測限為0.7 ng/mL,在1～10 000 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系(R2=0.991 3),啤酒和玉米樣品加標回收率分別為88.57%～102.14%和91.43%～106.43%,與酶聯(lián)免疫法實驗結果對比無明顯差異,檢測穩(wěn)定性好、準確性高,可用于食品中玉米赤霉烯酮的可視化檢測,對食品中小分子危害物質(zhì)的檢測具有重大意義。