習朝文，劉延峰，李江華*，堵國成，陳 堅，劉 龍

(1.江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫214122；2.江南大學 糖化學生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫214122)

關鍵字：L-氨基酸脫氨酶；飽和突變；丙酮酸；全細胞轉(zhuǎn)化

丙酮酸是一種有廣泛應用的有機物中間體[1],在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品及化工方面有重要用途[2-4]。目前,市場上丙酮酸主要由化工法和發(fā)酵法合成。在化工合成中,丙酮酸主要由酒石酸脫水和脫羧基合成。對于微生物發(fā)酵法,丙酮酸主要由2大類微生物(光滑球?qū)俳湍负痛竽c桿菌)合成[5]。目前,發(fā)酵法在合成丙酮酸過程中占主導地位,但是該方法的缺點是底物對丙酮酸的轉(zhuǎn)化率比較低。本研究中,作者采用了一種新的用于合成丙酮酸的生物轉(zhuǎn)化法。在之前的研究中,作者已用生物轉(zhuǎn)化法合成了酮戊二酸、酮異己酸、苯丙氨酸和酮異戊酸等多種酮酸[6-10]。

該生物轉(zhuǎn)化法中,L-氨基酸脫氨酶(pm1)發(fā)揮關鍵作用。pm1是一種依賴于黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的膜蛋白,能催化L-型氨基酸生成對應的酮酸及氨[11-13],其反應機理見圖1。在之前的工作中,作者已經(jīng)構建好表達pm1的大腸桿菌菌株,其能催化丙氨酸生成丙酮酸,產(chǎn)量為14.57 g/L[14]。本研究中,作者通過2種策略進一步提高丙酮酸的合成效率。其一是通過表達細胞色素b562(cybC,14 100)來提高FAD在催化過程中的合成效率,該細胞色素能將H原子由FADH2通過電子傳遞鏈傳遞給氧氣[15-16]。其二是通過飽和突變技術對pm1定向進化提高其催化能力。

圖1 L-氨基酸脫氨酶催化丙氨酸生成丙酮酸反應機理圖Fig.1 Reaction mechanism diagram for pyruvate production from L-alanine by L-amino acid

1 材料與方法

1.1 相關試劑

Prime STAR HS DNA polymerase,2×Taq PCR mix,SanPrep柱式質(zhì)粒小提試劑盒,Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒,DNA純化試劑盒和細菌感受態(tài)制備試劑盒：均購自TAKARA公司(中國大連)；丙酮酸鈉標樣和FAD分析試劑盒：購自Sigma-Aldrich有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI,T4-DNA連接酶：購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；IPTG和氨芐青霉素：購自生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 菌株和培養(yǎng)基

作者所用菌株和質(zhì)粒均在表1中列出。種子培養(yǎng)基為液體LB,配方為：10 g/L蛋白胨,5 g/L酵母提取物,10 g/L氯化鈉。發(fā)酵培養(yǎng)基為TB,配方為：12 g/L蛋白胨,24 g/L酵母提取物,5 g/L甘油,17 mmol/L磷酸二氫鉀,72 mmol/L磷酸氫二鉀。LB固體培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨,5 g/L酵母提取物,10 g/L氯化鈉,20 g/L瓊脂粉,100μg/mL氨芐青霉素。

1.3 重組質(zhì)粒的構建及表達

cybC的基因序列擴增自大腸桿菌基因組,pm1的基因序列擴增自質(zhì)粒(pET20b(+)-pm1),所用引物在表2中列出。PCR產(chǎn)物通過1 g/dL瓊脂糖核酸電泳分離,之后通過DNA純化試劑盒進行純化。cybC的基因片段和pm1的基因片段通過融合PCR進行融合,融合PCR產(chǎn)物純化步驟同上。純化后的融合片段和空質(zhì)粒pET20b(+)分別用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI于37℃處理3 h,之后酶切產(chǎn)物通過DNA純化試劑盒進行純化,最后用T4-DNA連接酶進行連接,連接24 h后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)中。涂布于LB固體平板,挑選單菌落進行菌落PCR驗證和測序驗證。

將保存在甘油管中的菌液按1%的接種體積分數(shù)接種到液體LB培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng),培養(yǎng)條件為：250 mL三角瓶裝液量為25 mL,37℃,12 h,100μg/mL氨芐青霉素。將種子液轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)條件：250 mL三角瓶裝液量25 mL,100μg/mL氨芐青霉,OD600nm值為2.0時,加入終濃度0.04 mmol/L IPTG開始誘導,同時將溫度降低至25℃,誘導12 h。菌體通過離心收集(7 000g、4℃、10 min),最終用0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)懸浮,并于4℃條件下保存。細胞干重DCW(g/L)和OD600nm值由如下公式(1)進行換算[17]：

表1 研究中所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究中所用引物Table 2 Primers used in this study

1.4 SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)表達情況

cybC表達情況通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分析。樣品處理步驟為：用去離子水將細胞稀釋至5 g/L,30μL樣品與10μL緩沖液(NuPAGETMLDSSample Buffer(4×))混合,之后進行熱處理(100℃、15 min)。最后進行凝膠電泳,上樣量10μL。結束后用考馬斯亮藍染色,用水洗脫。

1.5 表達細胞色素對催化合成丙酮酸的影響

為研究表達細胞色素對催化合成丙酮酸的影響,我們對大腸桿菌BL21(DE3)-pET20b(+)-pm1和大腸桿菌BL21(DE3)-pET20b(+)-pm1-cybC分別進行發(fā)酵培養(yǎng),誘導時間為6、8、10、12 h及14 h。發(fā)酵結束后收集細胞進行催化反應,催化反應按照1.6中優(yōu)化結果進行。

1.6 pH值及細胞質(zhì)量濃度優(yōu)化

催化反應條件為：250 mL搖瓶裝液量為20 mL,反應溫度為37℃,底物質(zhì)量濃度為80 g/L D,L-丙氨酸。對于pH值及細胞質(zhì)量濃度優(yōu)化,所用菌株為大腸桿菌BL21(DE3)-pET20b(+)-pm1。在pH值優(yōu)化實驗中,細胞質(zhì)量濃度1.5 g/L,用0.2 mol/L磷酸鈉鹽緩沖液及0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)初始pH值,其梯度為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。在細胞質(zhì)量濃度優(yōu)化實驗中,初始pH值為前面優(yōu)化結果,細胞質(zhì)量濃度梯度為0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 g/L。

1.7 同源酶晶體結構分析及飽和突變、篩選

從Swiss Model在線網(wǎng)站得到pm1同源性為88.58%晶體模型,該晶體模型來源于Proteus myxofaciens[16]。通過分析該模型活性中心關鍵氨基酸,選取4個位點對其進行飽和突變。突變建庫方法為一步法全質(zhì)粒擴增,所用引物在表2中列出。用牙簽在每個突變點庫中隨機挑選大概100個單克隆到48孔板進行發(fā)酵培養(yǎng)及初篩。每孔裝液量為600μL液體LB,37℃孔板搖床培養(yǎng)12 h,之后轉(zhuǎn)接至每孔含有300μL液體TB培養(yǎng)基的48孔板進行發(fā)酵培養(yǎng),轉(zhuǎn)接體積分數(shù)為50%,同時加入終濃度0.08 mmol/L IPTG于37℃進行誘導,誘導6 h后發(fā)酵結束,離心(4 200g、5 min、4℃)棄上清液。

底物濃度為500 mmol/L L-丙氨酸,溶解到0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液中(pH值7.0),將50μL底物加入到含有細胞的48孔板中進行催化反應,37℃,30 min后離心,停止反應。通過顯色法測量上清液中丙酮酸含量,上清液中丙酮酸產(chǎn)量較高的突變菌株為目標菌株。顯色測量方法為：取50μL上清液與50μL 0.1 g/dL 2,4-二硝基苯肼混合,室溫放置5 min,最后加入1 mL 1.5 mol/L氫氧化鈉溶液,待顏色穩(wěn)定后吸取200μL液體,在酶標儀中檢測其在520 nm下的吸收值。突變、篩選流程如圖2所示。

圖2 飽和突變及高通量篩選Fig.2 Saturation mutation and high-throughput screening

1.8 膜蛋白提取及其酶學性質(zhì)分析

用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH值7.0)使對照組和突變體細胞懸浮,再通過超聲將其破碎。將破碎液通過10 000g離心1 h使未破碎細胞和上清液分離,取上清液進行超高速離心(100 000g、1 h),產(chǎn)生沉淀為細胞膜成分,用磷酸鈉鹽緩沖液將沉淀溶解。通過BCA蛋白質(zhì)濃度分析試劑盒(TianGen,北京,中國)測量其蛋白質(zhì)濃度。在酶學性質(zhì)測量試驗中,底物L-丙氨酸濃度為1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150 mmol/L和200 mmol/L,蛋白質(zhì)質(zhì)量為1.5 mg,于37℃條件下進行,30 min后通過顯示法檢測反應液中丙酮酸濃度。Km值和Vmax值通過如下公式(2)進行計算：

V表示反應速率(丙酮酸生成量；μmol/min),Vmax表示最大反應速率,Km表示米式常數(shù)(mmol/L),cs表示底物L-丙氨酸濃度。

1.9 丙酮酸、丙氨酸及FAD含量分析

采用高效液相色譜法(HPLC)檢測丙酮酸含量。取0.2 mL離心后的反應上清液,稀釋一定倍數(shù)后用0.22μm孔徑濾膜過濾,濾液即為待測樣品。色譜柱為：Agilent 1260型高效液相色譜儀,伯樂Aminex PHX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm,9μm),流動相為5 mmol/L稀硫酸,進樣量10μL,流量為0.6 mL/min,紫外檢測波長210 nm,柱溫40℃,洗脫時間15 min。

細胞內(nèi)輔酶FAD濃度通過FAD分析試劑盒(Sigma–Aldrich)測定[18]。將細胞從反應體系中離心取出,用水洗滌一遍,離心后用FAD分析試劑緩沖液使之懸浮,14 000g離心10 min,去除不容物質(zhì)。通過使用高氯酸(8 g/dL)使FAD從蛋白質(zhì)中釋放出來。反應體系含92μL FAD分析緩沖液,4μL熒光過氧化物酶,4μL FAD酶混合物,50μL待測樣品。通過加入反應終止試劑終止反應,最后檢測其在570 nm下的吸光值。

采用臨苯二甲醛-氯甲酸芴基甲酯(OPAFMOC)柱前衍生反相高效液相色譜法來測定樣品中的丙氨酸含量。將轉(zhuǎn)化液上清部分稀釋合適倍數(shù),用0.45μm孔徑濾膜過濾,濾液即為待測樣品。色譜條件為：Agilent 1260型高效液相色譜儀,依利特Hypersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),使用流動相A和流動相B,進樣量10μL,流量為1.0 mL/min,紫外檢測波長為338 nm,柱溫40℃,采用梯度洗脫,洗脫時間38 min,梯度洗脫表見表3。

2 結果與分析

2.1 表達cybC與pm1

細胞色素b562是大腸桿菌有氧呼吸鏈上的一種氧化酶。在電子傳遞鏈中,它將2個H原子從FADH2傳遞給氧氣[19-20]。本研究中,作者在大腸桿菌中共表達cybC與pm1,之后驗證表達細胞色素b562后對菌株的生長影響,結果見圖3,表達該細胞色素后會降低宿主的生長速率,原因可能是過量表達該細胞色素對宿主細胞膜通透性影響較大。為驗證細胞色素b562的表達情況,我們將樣品按照1.4中的方法處理后,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析,其結果見圖4。

表3 丙氨酸分析梯度洗脫表Table 3 Gradient elution of alanine analysis

圖3 表達cybC對宿主生長的影響Fig.3 Effects of cybC expression on the growth of host cells

最后,作者研究表達細胞色素對催化合成丙酮酸的影響。結果見圖5(a)、(b)所示,細胞色素并不會影響最適誘導時間,2株菌最適誘導時間在12~14 h左右,最終丙酮酸產(chǎn)量相差不大。然而,表達細胞色素后,見圖5(a),催化合成丙酮酸的速率較對照菌高,同時胞內(nèi)FAD的含量也較對照菌高。因此作者推測,表達細胞色素b562能提高FAD合成速率,從而提高丙酮酸合成速率。

圖4 蛋白電泳分析Fig.4 Whole-cell SDS-PAGE analysis

圖5 表達細胞色素對催化合成丙酮酸影響Fig.5 Effects of cybC expression on pyruvate production

2.2 最適pH值及細胞濃度

pH值對酶的功能影響較大,為此,作者研究了不同pH值對催化反應的影響。如圖6(a)所示,pH值為7.0時,丙酮酸最高產(chǎn)量為17.10 g/L。過高的pH值對丙酮酸積累不利,原因之一是過高pH值使酶的活性損失比較大,導致最終產(chǎn)量降低。同時,我們在催化過程中各時間點取樣測量其pH值,發(fā)現(xiàn)pH值基本可以保持穩(wěn)定,這說明隨著催化進行,緩沖液可以維持pH值穩(wěn)定,使酶可以持續(xù)發(fā)揮催化能力。

圖6 最適pH值及細胞質(zhì)量濃度Fig.6 Optimal pH and cell density

催化體系中酶的量直接由加入的細胞量決定。為此,作者研究了不同細胞量對酶催化的影響。結果如圖6(b)所示,細胞質(zhì)量濃度為1.5 g/L時,產(chǎn)量達到最高為17.15 g/L,然而細胞質(zhì)量濃度更高時,產(chǎn)量反而降低。為此,作者進一步設計實驗,驗證細胞對丙氨酸和丙酮酸的消耗情況,結果見圖6(c)、(d)。該結果表明在催化過程中細胞會消耗一定量的丙酮酸,但幾乎不消耗丙氨酸。本實驗結果證明了利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸時,弱化或消除這類消耗丙酮酸的途徑的必要性[21-22]。因此,作者選擇細胞質(zhì)量濃度為1.5 g/L作為催化反應的條件,產(chǎn)量為17.15 g/L,轉(zhuǎn)化率達42.75%。同時,作者在催化過程中各時間點取樣檢測細胞質(zhì)量濃度、丙酮酸及丙氨酸含量。其結果如圖7所示,細胞質(zhì)量濃度在催化過程中會降低,可能是由于在高離子濃度的溶液中細胞破裂導致的。催化結束,丙氨酸與丙酮酸的總量為65 g/L,與初始底物80 g/L有一定的差值,根據(jù)作者所在實驗室之前的結論,這部分差值是細胞消耗丙酮酸導致的。

圖7 催化過程中底物、產(chǎn)物及細胞量變化Fig.7 Changes of substrate concentration,product concentration and cell density during the biocatalyst process

2.3 pm1突變體對合成丙酮酸的影響及其酶學性質(zhì)分析

飽和突變是研究蛋白酶的結構與功能關系的一種非常有用的手段。該技術可以確定每個位點最適合的氨基酸[23]。然而,選擇合適的位點進行飽和突變至關重要。本研究中,作者通過分析同源酶晶體結構,見圖8(a),尋找合適的位點進行飽和突變。如圖8(b)所示,FAD位于底物口袋中心,選擇周圍4個關鍵位點(279、341、418和438)作為飽和突變的位點。經(jīng)過一輪篩選,從279、418和438位點突變庫中各篩選出丙酮酸產(chǎn)量較對照菌有提高的菌株。經(jīng)過測序驗證,它們分別是L279I、E418A和V438I。在341位點突變庫中,并沒有獲得較好的突變菌株,這說明谷氨酸是341位點最合理的氨基酸。之后作者驗證了這3株菌催化生產(chǎn)丙酮酸的能力,其結果見圖9,三突變體L279I/V438I/E418A丙酮酸產(chǎn)量最大,為25.58 g/L,相比對照菌17.69 g/L,提高44.6%。

最后作者對L-氨基酸脫氨酶突變體及野生型進行酶學性質(zhì)檢測及分析。如表4所示,突變體E418A對提高底物親和性較明顯,Km值由(42.75±0.51)mmol/L降低至(30.28±0.67)mmol/L。如圖8(c)所示,418位點位于丙酮酸離開活性中心的路徑[9],將該位點的谷氨酸替換成丙氨酸后,其側鏈長度降低,使得丙氨酸更容易離開活性中心。突變體L279I和V438I,其Km值相對于野生型變化不大,Kcat值相比野生型提高1.75和1.60倍。如圖8(d)所示,279和438位點分別位于L-氨基酸脫氨酶底物口袋內(nèi),該兩個位點替換成異亮氨酸后,能增加底物口袋內(nèi)的疏水性,從而提高其對底物的催化能力。

圖8 L-氨基酸脫氨酶同源模型晶體結構及關鍵氨基酸位點Fig.8 L-amino acid deaminase crystal structure and key residues inside the substrate-binding pocket

圖9 不同突變菌株催化合成丙酮酸產(chǎn)量Fig.9 Pyruvate concentration of different mutant strains

3 結語

作者通過表達pm1伴侶蛋白(細胞色素b562)及應用飽和突變技術對pm1進行分子改造這兩種策略來提高生物轉(zhuǎn)化法合成丙酮酸的能力。通過表達細胞色素b562使催化反應周期減少6 h左右,但不利于發(fā)酵過程中細胞量的積累,對于工業(yè)化應用具有一定的缺點。

分子改造采用的篩選方案為：催化反應一定時間,通過顯色法檢測丙酮酸含量的高低來衡量突變體的催化能力。該方法能高效檢測出催化速率較高的突變體。然而,實際過程中,產(chǎn)物對酶的抑制是一個對丙酮酸最終產(chǎn)量有較大影響的因素,篩選出產(chǎn)物抑制能力較弱的突變體對提高丙酮酸產(chǎn)量至關重要。由于在反應過程中細胞會消耗一定量的產(chǎn)物,故通過該篩選方案不能準確的篩選出產(chǎn)物抑制能力較弱的突變體。未來的研究中,期望尋找一種能快速檢測底物丙氨酸剩余量的方法,建立更加準確的篩選方案。

表4 對照菌及突變菌酶學性質(zhì)Table 4 Comparison of kinetic parameters of the wild type pm1 and its mutants

此外,由于細胞在催化過程中會消耗一定量的丙酮酸,不利于產(chǎn)物的積累。因此,在之后的研究中,可以通過基因敲除技術和宿主誘變來弱化細胞對丙酮酸的消耗,期望獲得一株消耗丙酮酸較弱的宿主。