高棟梁，張雷，張宏峰，楊喜明

作者單位：延安大學附屬醫(yī)院燒傷整形手外科，陜西 延安 716000

瘢痕疙瘩是一種病理性瘢痕，主要表現(xiàn)為皮膚損傷修復過程中結締組織快速增殖，成纖維細胞過度生長，膠原大量沉積，并伴有炎癥以及組織損傷等。瘢痕疙瘩生長在面部等部位嚴重影響病人的容貌，給病人帶來極大的生活困擾。目前，瘢痕疙瘩的發(fā)病機制尚不十分清楚，臨床缺乏特異性的治療方法。因此，探究瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展過程中的分子機制，為臨床尋找新的防治方 法具有重要意義。研究結果表明，阻礙成纖維細胞的惡性增殖可抑制瘢痕疙瘩的生長。 微小 RNA（microRNA，miRNA）是一種具有廣泛作用的非編碼 RNA，主要調控轉錄后的靶基因水平，影響多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展。研究證實，miRNA 的表達量異常與多種皮膚病如瘢痕疙瘩的病理進程緊密相關。研究顯示，miR-4463 在瘢痕疙瘩組織中較正常對照明顯降低，但其具體的作用機制尚不明確。本研究擬通過探究 miR-4463 對人瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、侵襲的影響及分子機制，為臨床闡明瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展分子機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

胎牛血清 、DMEM 培養(yǎng)基 、Transwell 小室購自美國 Corning 公司，Trizol 試劑、Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen 公司 ，定量聚 合酶鏈反應（qPCR）試劑盒、cDNA 逆轉錄試劑盒購自中國Roche公司 ，細胞計數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）購自上海碧云天生物有限公司；Mataigel 膠購自美國 BD 公司，miR-4463 模擬物對照質粒、miR-4463 模擬物均購自廣州銳博生物科技有限公司，熒光素酶試劑盒購自美國 Sigma 公司。熒光定量 PCR 擴增儀購自美國 ABI 公司，多功能酶標儀購自美國 Applied Biosystoms 公司。

1.2 細胞的收集與培養(yǎng)

收集延安大學附屬醫(yī)院2017年 12月至 2019年 6月整形手術病人 40例，每例切除瘢痕疙瘩組織 1 個以及鄰近正常皮膚組織 1個，其研究均獲得病人或其近親屬的同意，且均經過病理學檢驗確認為瘢痕疙瘩。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求 。病人年齡在20～35歲，均未接受任何瘢痕相關治療。收集的樣本置于無菌條件下清洗，使用組織塊貼壁法分離瘢痕疙瘩成纖維細胞，經鑒定符合實驗要求，加入含10% 胎牛血清 DMEM 培養(yǎng)基孵育，置于 5% 二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)，每 2 天加入胰酶消化、傳代。

1.3 細胞的轉染

選取對數(shù)期 3～5 代瘢痕疙瘩成纖維細胞，采用隨機數(shù)字表法分為對照組、miR-NC組、miR-4463 組。常規(guī)培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞作 為 對 照 組 ，miR-NC 組 、miR-4463 組 根 據(jù) Lipofectamine 2000 說明書將 miR-4463 模擬物對照質粒和 miR-4463 模擬物分別轉染入瘢痕疙瘩成纖維細胞，然后置于 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。取臨床手術中正常皮膚標本，應用組織塊法進行培養(yǎng)，用 2.5 g∕L 胰蛋白酶進行消化傳代，實驗用第3～8 代處于對數(shù)生長期的細胞。

1.4 qPCR 實驗

各組瘢痕疙瘩成纖維細胞轉染后培養(yǎng) 48 h，收集 5×10∕孔置于 6 孔板中，待細胞密度約為 80%～90%，加入 Trizol 試劑，提取瘢痕疙瘩成纖維細胞總 RNA，逆轉錄為互補 DNA（cDNA），反應條件為 50 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。引物均由上海生工生物公司設計、合成，如下表所示。miR-4463 以U6 為 參 照，Col 1 A1 和 Col 3 A1 以 GAPDH 為 參 照，根據(jù) qPCR 試劑盒指示檢測 miR-4463 的表達量，反應條件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s，57 ℃ 45 s，35 個循環(huán)，采用 2法計算 miR-4463 的表達量。

表1 引物序列

1.5 CCK-8 實驗

將各組 1×10個瘢痕疙瘩成纖維細胞接種至 96 孔板，加入適量培養(yǎng)基，分別培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，37 ℃繼續(xù)孵育 2 h，酶標儀檢測瘢痕疙瘩成纖維細胞 450 nm吸光度。

1.6 Transwell 實驗

將 Mataigel 基質膠稀釋液提前加入 Transwell 上室膜，風干、備用；收集各組轉染48 h 的瘢痕疙瘩成纖維細胞，在胰酶的介導下將其密度調整為 1×10∕mL；吸取 200 μL 瘢痕疙瘩成纖維細胞懸液加入 Transwell 上室，下室中加入 600 μL、含 10% 胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng) 48 h；取 5 個區(qū)域計數(shù)，計算平均值即為侵襲細胞數(shù)；檢測遷移細胞數(shù)時，Transwell 上室膜不加入 Mataigel 基質膠。

1.7 miR-4463靶基因的預測和驗證

Targetscan（http：∕∕www.targetscan.org∕vert_71∕）預測 miR-4463與 B 細胞淋巴瘤 -2（Bcl-2）Bcl-2 相關的致病基因BAG4 的靶向關系。野生型（BAG4-wt）熒光素酶報告載體（含有與miR-4463結合的位點）和突變型（BAG4-mut）熒光素酶報告載體（含有突變位點）均購買自美國 Sigma 公司，分別與 miR-NC 質粒、miR-4463 模擬物共轉染，37 ℃培養(yǎng) 48 h，在熒光素酶試劑盒說明書指示下測定瘢痕疙瘩成纖維細胞中的熒光素酶相對活性。

2 結果

2.1 miR-4463 在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達量

與人正常成纖維細胞細胞（1.000±0.071）相比，miR-4463 在瘢痕疙瘩成纖維細胞中表達量（0.218±0.036）明顯降低（

t

=29.470，

P

＜0.001）。

2.2 轉染 miR-4463 模擬物對瘢痕疙瘩成纖維細胞中 miR-4463 表達量的影響

與對照組（1.000±0.073）相比，miR-NC 組瘢痕疙瘩成纖維細胞中 miR-4463 表 達量（1.026±0.085）差異無統(tǒng)計學意義（

P＞

0.05），但 miR-4463 組細胞中 miR-4463 表達量（3.313±0.242）明顯增加（

F

=669.515，

P

＜0.001）。

2.3 上調 miR-4463 對瘢痕疙瘩纖維化相關基因表達、細胞增殖、遷移及侵襲的影響

與對照組相比，miR-NC 組瘢痕疙瘩成纖維細胞中 Col 1 A1、Col 3 A1 表達量、細胞增殖、遷移及侵襲差異無統(tǒng)計學意義（

P＞

0.05），但 miR-4463 組細胞中 Col 1 A1、Col 3 A1 表達量、增殖活性、遷移及侵襲數(shù)明顯降低（

P

＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 上調miR-4463對人瘢痕疙瘩成纖維細胞細胞遷移、侵襲的影響（結晶紫染色×200）

2.4 miR-4463 靶基因的預測和驗證

BAG4 基因3’端非翻譯區(qū)域（3’UTR）部分堿基可于 miR-4463特異性結合，見圖2。跟 miR-NC 與 BAG4-wt 共轉染（1.000±0.065）相比，miR-4463 模擬物與 BAG4-wt 共轉染降低瘢痕疙瘩 成纖 維 細胞 熒光 素酶相 對活 性（0.435±0.048）（

t

=20.977，

P

＜0.001）；但 miR-4463 模擬物與 BAG4-mut共轉染（0.994±0.081）跟 miR-NC 與 BAG4-mut 共 轉染（1.000±0.083）相比，對瘢痕疙瘩成纖維細胞熒光素酶相對活性無明顯影響（

t

=0.155，

P

=0.879）。

圖2 Targetscan 預測 miR-4463 與 BAG4 的靶向關系

3 討論

瘢痕疙瘩是一種組織在創(chuàng)傷或感染后過度修復、纖維化的良性腫瘤，其病理進展與成纖維細胞增殖調控異常有關。瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展主要表現(xiàn)為成纖維細胞增殖活性增強，但其發(fā)病機制尚不明確，治療手段多樣，但效果不令人滿意，已經成為整形外科亟待解決的主要難題之一。越來越多的研究表明，瘢痕疙瘩的發(fā)生、發(fā)展與 miRNA 表達量異常緊密相關。

Col 1 A1 和 Col 3 A1 基因是一種膠原表達的相關基因，在瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，Col 1 A1 和 Col 3 A1 基因過表達可引起成纖維細胞的增殖。

miR-4463 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種 miRNA，通過調控細胞的增殖、侵襲影響人類疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明，采用 miRNA 芯片技術檢測發(fā)現(xiàn)，miR-4463在動脈硬化閉塞癥病人中表達量明顯降低，進一步過表達 miR-4463 抑制低密度脂蛋白誘導的血管平滑肌細胞遷移，從而參與動脈硬化閉塞癥的病理發(fā)生過程。另外研究表明，miR-4463 可通過靶向調控下游靶基因（細胞遷移相關蛋白 AMOT）表達來調控血管平滑肌細胞遷移，為探究血管疾病的新療法提供實驗依據(jù)。除此之外，miR-4463 可增強過氧化氫誘導的人臍靜脈內皮細胞氧化應激反應，并促進其凋亡，表明 miR-4463 在血管疾病中發(fā)揮重要作用。但研究發(fā)現(xiàn)，miR-4463 在瘢痕疙瘩病人樣本組織中表達量異常，表明 miR-4463 可能參與瘢痕疙瘩病理 發(fā)展過程。因此本實驗通過 qPCR 檢測 miR-4463 在瘢痕疙瘩成纖維細胞、人正常成纖維細胞中的表達量，結果顯示，miR-4463 在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達量明顯降低，與前人研究在組織中的表達量具有一定的相似性；進一步上調 miR-4463 在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達量，結果顯示，過表達 miR-4463 抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖，降低其侵襲、遷移能力，表明 miR-4463 可通過影響瘢痕疙瘩成纖維細胞的生物學特性，阻礙瘢痕疙瘩組織的生長。

表1 上調 miR-4463 對瘢痕疙瘩纖維化相關基因表達的影響∕

BAG4 是 BAG 家族蛋白成員之一，可靶向結合于 B 細胞淋巴瘤∕白血病 -2（B cell lymphoma∕lewkmia-2，Bcl-2），阻礙細胞凋亡信號的傳導，降低細胞的凋亡率。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，BAG4 在多種腫瘤組織如非小細胞肺癌、乳腺癌、黑色素瘤中表達量異常，參與腫瘤的發(fā)生、轉移過程。研究證實，BAG4 在瘢痕疙瘩病理演進過程中表達量明顯上調，表明 BAG4 參與瘢痕疙瘩的病理進程。在本實驗中，為進一步探究 miR-4463 抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、侵襲、遷移的分子機制，通過在線數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)，BAG43’UTR 區(qū)域含有部分堿基可特異性結合于 miR-4463，表明 BAG4 可能是 miR-4463的下游靶基因；進一步通過雙熒光素酶驗證發(fā)現(xiàn)，miR-4463 與含有結合位點的 BAG4 野生型載體共轉染可降低細胞中的雙熒光素酶相對活性 ，而 與BAG4 突變型載體共轉染對細胞中雙熒光素酶相對活性無顯著影響，表明 miR-4463 可通過特異性結合于 BAG4，從而降低細胞中的雙熒光素酶相對活性，證實 BAG4 是 miR-4463 的下游靶基因。

綜上所述，miR-4463 在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達量顯著降低；過表達 miR-4463 可抑制細胞外基質中纖維化相關膠原基因的表達，抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、侵襲、遷移，其作用機制可能是通過靶向調控 BAG4 表達量，為瘢痕疙瘩臨床特異性治療方法的探究提供實驗依據(jù)，未來會進一步深入研究 miR-4463 的作用機制以及探究其在臨床樣本中的作用。